待測蛋白質(zhì)的修飾程度，即類泛素化修飾多聚鏈的聚合 度。
[0052] 優(yōu)選地，所述步驟（5)對英光標記后的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進行檢測和 量化分析的方法為；利用全內(nèi)反射英光顯微鏡對經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進行單分子 成像，觀察待測蛋白質(zhì)是否發(fā)生類泛素化修飾；然后將帶單四半脫氨酸多膚標簽的類泛素 化修飾蛋白的英光強度的平均值定義為單類泛素化修飾，再將經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白 質(zhì)獲得的英光強度值除W單修飾的英光值，從而計算出經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)的修 飾程度，即類泛素化修飾多聚鏈的聚合度。
[0053] 優(yōu)選地，所述帶單四半脫氨酸多膚標簽的類泛素化修飾蛋白中，所述單四半脫氨 酸多膚標簽位于所述類泛素化修飾蛋白的N端。
[0054] 本發(fā)明所述的帶單四半脫氨酸多膚標簽的類泛素化修飾蛋白即單個四半脫氨酸 多膚標簽與類泛素樣修飾蛋白的融合蛋白。
[0055] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測方法，通過將類泛素化修飾蛋白與四半 脫氨酸多膚標簽融合，借助四半脫氨酸多膚標簽與雙神英光染料之間特意性的反應，即雙 神英光染料共價結(jié)合四半脫氨酸多膚標簽而發(fā)出英光，從而將類泛素化修飾和/或多聚類 泛素化修飾該一生物學事件轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷挠⒐庑盘?，并結(jié)合全內(nèi)反射英光顯微鏡的單分子 檢測能力實現(xiàn)類泛素化修飾的靈敏檢測和多聚類泛素化修飾的量化分析。
[0056] 第二方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測質(zhì)粒，含有相連的類泛 素化修飾蛋白的編碼基因和四半脫氨酸多膚標簽的編碼基因，所述四半脫氨酸多膚標簽的 編碼基因位于所述類泛素化修飾蛋白的編碼基因的5'端，所述四半脫氨酸多膚標簽的編碼 基因為18bp~36bp ;
[0057] 所述四半脫氨酸多膚標簽的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C為半脫氨酸，所 述X為除半脫氨酸W外的任一氨基酸。
[005引優(yōu)選地，檢測質(zhì)粒為將所述相連的類泛素化修飾蛋白的編碼基因和四半脫氨酸多 膚標簽的編碼基因插入原核載體或真核載體的多克隆位點后所得的重組質(zhì)粒。
[0059] 進一步優(yōu)選地，所述原核載體或真核載體為原核表達載體或真核表達載體。
[0060] 更進一步優(yōu)選地，所述原核表達載體為祀T載體或pGEX載體。
[0061] 更進一步優(yōu)選地，所述真核表達載體為pcDNA載體。
[00間更進一步優(yōu)選地，所述 pcDNA 載體為 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 載體。
[006引更進一步優(yōu)選地，所述多克隆位點為pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I酶切 位點。
[0064] 優(yōu)選地，所述類泛素化修飾蛋白為SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0065] 優(yōu)選地，所述SUM02為人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02 (h SUM02)的編碼 基因如SEQ ID N0:1所示。
[0066] 在此優(yōu)選條件下，所述類泛素化修飾蛋白的Genebank登錄號如下：
[0067]所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登錄號分別為 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0068]優(yōu)選地，所述待測蛋白質(zhì)為 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、An^ogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66。
[0069]在此優(yōu)選條件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登錄號分別為 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、AF077188. 1、BC144136. 1、NM_002227. 2、 GU211：M7. 1、X60188. 1、AF281255. 1、U65410. 1、AY441957. 1、J04718. 1、NM_020666. 2、 NM_005146. 4。
[0070] 優(yōu)選地，本發(fā)明所采用四半脫氨酸多膚標簽包括的CCXXCC為序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0071]優(yōu)選地，所述 CCXXCC 為 CCPGCC。
[0072] 優(yōu)選地，所述四半脫氨酸標簽多膚的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。
[0073]具體地，所述 SEQ ID N0:3 的序列為 FLNCCPGCCMEP。
[0074]具體地，所述 SEQ ID N0:4 的序列為 HRWCCPGCCKTF。
[0075] 第H方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測質(zhì)粒的制備方法，包括 如下步驟：
[0076] (1)、提供類泛素化修飾蛋白編碼基因的PCR擴增模板；
[0077] (2)、提供類泛素化修飾蛋白編碼基因的PCR擴增引物，包括上游引物和下游引 物，其中，所述上游引物具有四半脫氨酸多膚標簽的編碼基因序列，所述四半脫氨酸多膚標 簽的編碼基因序列為18bp~36bp;
[0078] 所述四半脫氨酸多膚標簽的氨基酸序列包括CCXXCC,其中，所述C為半脫氨酸，所 述X為除半脫氨酸W外的任一氨基酸；
[0079] (3)、采用步驟（2)提供的PCR擴增引物與步驟（1)提供的基因模板進行PCR，擴增 得到編碼帶四半脫氨酸多膚標簽的類泛素化修飾蛋白的融合基因；
[0080] (4)、將擴增后所得的融合基因插入到載體的多克隆位點，得到檢測質(zhì)粒，所述檢 測質(zhì)粒含有相連的類泛素化修飾蛋白的編碼基因和四半脫氨酸多膚標簽的編碼基因，所述 四半脫氨酸多膚標簽的編碼基因位于所述類泛素化修飾蛋白的編碼基因的5'端，所述四半 脫氨酸多膚標簽的編碼基因為18bp~36bp，
[0081] 所述四半脫氨酸多膚標簽的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C為半脫氨酸，所 述X為除半脫氨酸W外的任一氨基酸。
[008引優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID N0:5和 SEQ ID N0:6 所示。
[0083] 具體地，SEQ ID NO: 5所示的序列為（5, -3'）；
[0084] GCAAGCTTACCATGGGATTCTTGAACTGTTGCCCGGGCTGCTGTATGG AACCAATGGCCGACGAAAAGCCCAAGGAAGG ；
[0085] 具體地，SEQ ID NO:6所示的序列為（5' -3，）；
[0086] CGCTCGAGTCAACCTCCCGTCTGCTGTT。
[0087] 在SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中，單下劃線標識部分為酶切位點，雙下劃線標識 部分為四半脫氨酸多膚標簽的編碼基因。
[0088] 優(yōu)選地，所述步驟（4)中，所述載體為原核表達載體或真核表達載體。
[0089] 進一步優(yōu)選地，所述原核表達載體為pET載體或pGEX載體。
[0090] 進一步優(yōu)選地，所述真核表達載體為pcDNA載體。
[0091] 進一步優(yōu)選地，所述 pcDNA 載體為 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 載體。
[009引在此優(yōu)選條件下，所述多克隆位點優(yōu)選為pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I 酶切位點。
[0093] 優(yōu)選地，所述類泛素化修飾蛋白為SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0094] 優(yōu)選地，所述SUM02為人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02的編碼基因如SEQ ID NO: 1 所示。
[0095] 在此優(yōu)選條件下，所述類泛素化修飾蛋白的Genebank登錄號如下：
[0096] 所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登錄號分別為 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0097] 優(yōu)選地，所述待測蛋白質(zhì)為 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、ArKlrogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66。
[0098] 在此優(yōu)選條件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCYl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登錄號分別為 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、A