一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測方法、檢測 質(zhì)粒W及制備方法、檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 類泛素化修飾是由類泛素化修飾蛋白所介導(dǎo)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾行為，研究 表明類泛素化修飾在染色體分離、DNA損傷應(yīng)答、減數(shù)分裂、蛋白質(zhì)泛素化降解W及染色質(zhì) 結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，異常的類泛素化修飾還被認(rèn)為與腫 瘤、也血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等多種疾病的發(fā)生相關(guān)。但是在細(xì)胞里僅有一小 部分底物蛋白能發(fā)生類泛素化修飾，比例較低，該種低豐度的現(xiàn)狀極大限制了對類泛素化 修飾的量化分析及其生物學(xué)功能研究。
[0003] 目前，主要采用蛋白質(zhì)印跡方法W及質(zhì)譜學(xué)手段來對類泛素化修飾進(jìn)行分析鑒 定。蛋白質(zhì)印跡方法通常利用免疫沉降方法來富集被類泛素化修飾蛋白所修飾的目標(biāo)蛋 白，然后再利用聚丙帰醜氨凝膠電泳進(jìn)行分離，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體賠育、顯影等步驟進(jìn) 行類泛素化修飾的鑒定；質(zhì)譜學(xué)手段需要對純化的目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白酶酶切，通過獲取目 標(biāo)膚段質(zhì)荷比并與相應(yīng)的蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，從而判定目標(biāo)蛋白發(fā)生修飾與 否。
[0004] 然而，蛋白質(zhì)印跡法需要進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)操作，操作步驟多，實(shí)驗(yàn)周期長；質(zhì)譜學(xué) 檢測雖然可W對類泛素化修飾發(fā)生與否進(jìn)行分析，但是需要對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特定 改造，且無法對類泛素化修飾蛋白多聚鏈的聚合程度進(jìn)行量化分析。
[0005] 因此，有必要提供一種簡單易行、靈敏度高、能對蛋白質(zhì)類泛素化修飾進(jìn)行檢測， W及對蛋白質(zhì)的多聚類泛素化修飾的修飾程度進(jìn)行量化分析的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測方法，該方法將 表達(dá)待測蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒W及表達(dá)帶四半脫氨酸多膚標(biāo)簽的類泛素化修飾蛋白的重組 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)的類泛素化修飾，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)純化、雙神染料標(biāo)記、并 對待測蛋白質(zhì)的類泛素化修飾進(jìn)行檢測和待測蛋白質(zhì)的多聚類泛素化修飾的修飾程度進(jìn) 行量化分析；該方法靈敏度高，簡單易行。此外，本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾 的檢測質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用；另外，本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測 試劑盒。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾的檢測方法，包括W下步驟：
[0008] (1)提供重組質(zhì)粒，包括待測蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒和檢測質(zhì)粒，
[0009] 其中，所述待測蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒具有待測蛋白質(zhì)的編碼基因，所述檢測質(zhì)粒含有 相連的類泛素化修飾蛋白的編碼基因和四半脫氨酸多膚標(biāo)簽的編碼基因，所述四半脫氨酸 多膚標(biāo)簽的編碼基因位于所述類泛素化修飾蛋白的編碼基因的5'端，所述四半脫氨酸多膚 標(biāo)簽的編碼基因?yàn)?8bp~36bp,
[0010] 所述四半脫氨酸多膚標(biāo)簽的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C為半脫氨酸，所 述X為除半脫氨酸W外的任一氨基酸，
[0011] 所述待測蛋白質(zhì)為類泛素化修飾蛋白作用的底物蛋白；
[0012] (2)將所述待測蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒和檢測質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，得到經(jīng)類泛素化修 飾蛋白修飾的待測蛋白質(zhì)；
[0013] (3)純化經(jīng)類泛素化修飾蛋白修飾的待測蛋白質(zhì)；
[0014] (4)采用雙神英光染料對純化后的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進(jìn)行英光標(biāo)記；
[0015] (5)對英光標(biāo)記的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測和/或量化分析。
[0016] 優(yōu)選地，所述待測蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒為將待測蛋白質(zhì)的編碼基因插入真核載體的多 克隆位點(diǎn)后所得的重組質(zhì)粒。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述真核載體為真核表達(dá)載體。
[0018] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體為pcDNA載體。
[001 引 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 pcDNA 載體為 pcDNA?3. 1/His-A、pcDNA?3. 1/His-B、 pcDM?3. 1/His-C、pcDM?4/His-A、pcDM?4/His-B、pcDM?4/His-C、pcDM?3. 1 (-) / myc-His-A、pcDNA?3. 1 (-)/myc-His-B、pcDNA?3. 1 (-)/myc-His-C、pcDM3. l(+)/myc-His A、pcDNA3. l(+)/myc-His B 或 pcDNA3. l(+)/myc-His C。
[0020] 優(yōu)選地，檢測質(zhì)粒為將所述相連的類泛素化修飾蛋白的編碼基因和四半脫氨酸多 膚標(biāo)簽的編碼基因插入原核載體或真核載體的多克隆位點(diǎn)后所得的重組質(zhì)粒。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述原核載體或真核載體為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
[0022] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述原核表達(dá)載體為pET載體或pGEX表達(dá)載體。
[0023] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體為pcDNA載體。
[0024]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 pcDNA 載體為 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 載體。
[002引更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多克隆位點(diǎn)為pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I酶切 位點(diǎn)。
[0026] 在此優(yōu)選條件下，所述步驟（3)純化表達(dá)所得的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)的 方法為：
[0027] a)收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解緩沖液重息，超聲破碎；
[0028] b)離也取上清液，所得上清液與媒結(jié)合樹脂賠育后用清洗緩沖液清洗樹脂2~3 次；
[0029] C)再用與樹脂等體積的洗脫緩沖液將經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)從樹脂上洗 脫下來，得到純化的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟a)中，所述細(xì)胞裂解緩沖液的抑為8.0,包括；lOOmM NaH^POA, lOmM Tris_Cl，8M urea, ImM TCEP。
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟b)中，所述清洗緩沖液的地為6. 3,包括：100ml NaH2P〇4, lOmM Tris-C1，4M urea，ImM TCEP。
[003引優(yōu)選地，所述步驟c)中，所述洗脫緩沖液的地為4. 5,包括：100ml麻畔04, lOmM Tris-Cl, 2M urea, ImM TCEP, pH=4. 5。
[003引優(yōu)選地，所述類泛素化修飾蛋白為SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0034] 優(yōu)選地，所述SUM02為人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02的編碼基因如SEQ ID NO: 1 所示。
[00巧]在此優(yōu)選條件下，所述類泛素化修飾蛋白的Genebank登錄號如下：
[0036]所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登錄號分別為 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0037]優(yōu)選地，所述待測蛋白質(zhì)為 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、An^ogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCyl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66.
[0038]在此優(yōu)選條件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCyl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登錄號分別為 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、AF077188. 1、BC144136. 1、NM_002227. 2、 GU211347. 1、X60188. 1、AF281255. 1、U65410. 1、AY441957. 1、J04718. 1、NM_020666. 2、 NM_005146. 4。
[0039] 優(yōu)選地，本發(fā)明所采用的四半脫氨酸多膚標(biāo)簽包括的CCXXCC為序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
[0040]具體地，所述 SEQ ID N0:2 為 CCPGCC。
[0041] 優(yōu)選地，所述四半脫氨酸標(biāo)簽多膚的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。
[0042]具體地，所述 SEQ ID N0:3 的序列為 FLNCCPGCCMEP。
[0043]具體地，所述 SEQ ID N0:4 的序列為 HRWCCPGCCKTF。
[0044] 優(yōu)選地，所述待測蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒和檢測質(zhì)粒共表達(dá)的細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞、人宮 頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、非洲綠猴SV40轉(zhuǎn)化的腎細(xì)胞、人成骨肉瘤細(xì)胞。
[004引優(yōu)選地，所述雙神英光染料標(biāo)記試劑包括FlAsH-EDTs、巧FlAsH-EDTs、 F4F1AsH-EDT2 或 ReAsH-EDT]。
[0046] 優(yōu)選地，所述步驟（4)采用雙神英光染料對純化后的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白 質(zhì)進(jìn)行英光標(biāo)記的方法為：
[0047] 先用步驟（3)所得純化的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)的十倍體積的磯酸鹽緩沖 液進(jìn)行稀釋和中和，再加入雙神英光染料在室溫下避光賠育60分鐘，得到雙神英光染料標(biāo) 記的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)；其中，所述磯酸鹽緩沖液的抑為7. 4,所述雙神英光染 料加入后的終濃度為500nM。
[0048] 在此優(yōu)選條件下，所述十倍體積的磯酸鹽緩沖液為步驟（3)所得的純化后的洗脫 液的體積的十倍。
[0049] 優(yōu)選地，所述步驟（5)對英光標(biāo)記后的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測的 方法為：利用全內(nèi)反射英光顯微鏡對經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子成像，觀察 待測蛋白質(zhì)是否發(fā)生類泛素化修飾。
[0050] 優(yōu)選地，所述步驟（5)對英光標(biāo)記后的經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)進(jìn)行量化分 析的方法為：
[0051] 將帶單四半脫氨酸多膚標(biāo)簽的類泛素化修飾蛋白的英光強(qiáng)度的平均值定義為單 類泛素化修飾，再將經(jīng)類泛素化修飾的待測蛋白質(zhì)獲得的英光強(qiáng)度值除W單修飾的英光 值，從而計(jì)算出經(jīng)類泛素化修飾的