含cd54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)之免疫細(xì)胞的應(yīng)用以及經(jīng)克隆之新穎細(xì)胞的制作方法
【專利說明】含CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)之免疫細(xì)胞的應(yīng)用以及經(jīng)克隆之 新穎細(xì)胞 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明關(guān)于含⑶54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)之免疫細(xì)胞的應(yīng)用，且特別關(guān)于將此含⑶54 表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)之免疫細(xì)胞應(yīng)用于確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 0)54(分化簇 54(Cluster of Difffeentiation 54))(也已知為細(xì)胞間黏附分 子-I (Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM_1)，其為于人類體中由 ICAMl 基因所編 碼出之蛋白質(zhì)。此基因編碼出通常表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells)與免疫系統(tǒng)之細(xì) 胞上的細(xì)胞表面糖蛋白（glycoprotein)。0)54與⑶I la/Q)18型（type)，或⑶llb/Q)18型 之整聯(lián)蛋白（integrins)結(jié)合，且也被鼻病毒（rhinovirus)利用為一受體（receptor)。目 前已知⑶54為免疫反應(yīng),特別是過敏反應(yīng)的一生物標(biāo)記。
[0004] 免疫反應(yīng)在許多疾病皆扮演重要的角色，例如發(fā)炎反應(yīng)，皮膚敏感性等等，因此許 多藥物皆針對(duì)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)進(jìn)行開發(fā)。但是免疫系統(tǒng)所涉及的生物分子及細(xì)胞種類繁多， 因此常需要以活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估，而造成時(shí)間及成本增加。雖然目前已有許多 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢赃M(jìn)行調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的測試，然而，其在分析上常需要以ELISA或流式 細(xì)胞儀來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也較平常生物實(shí)驗(yàn)復(fù)雜。
[0005] 又，致敏性是化妝品、各種化學(xué)品、農(nóng)產(chǎn)品、環(huán)境毒物、工業(yè)制品等產(chǎn)品上市前的重 要安全性評(píng)估項(xiàng)目。順應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理及減量的趨勢，歐美日各國的研究機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè) 公司均投入相當(dāng)大的資源于替代性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)，但目前在國際上仍未出現(xiàn)公認(rèn)可 以取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的替代方式。
[0006] 因此，目前亟需發(fā)展不須動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)或致敏物質(zhì)的新方法以適 合高通量測試使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，包括：(a)提供待測物與免疫細(xì)胞，其 中該免疫細(xì)胞包括CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)，而該CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)，包括：CD54基因之啟 動(dòng)子；以及報(bào)告基因，與該CD54基因之啟動(dòng)子連接，用以報(bào)告該CD54基因之啟動(dòng)子的表達(dá)； (b)以該待測物處理該免疫細(xì)胞；以及（c)測定經(jīng)該待測物處理之該免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之該 報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)以判定該待測物是否有免疫調(diào)節(jié)作用。
[0008] 本發(fā)明也提供一種確認(rèn)皮膚致敏物質(zhì)的方法，包括：(a)提供待測物與免疫細(xì)胞， 其中該免疫細(xì)胞包括CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)，而該CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)，包括：CD54基因之 啟動(dòng)子；以及報(bào)告基因，與該CD54基因之啟動(dòng)子連接，用以報(bào)告該CD54基因之啟動(dòng)子的表 達(dá)；(b)以該待測物處理該免疫細(xì)胞；以及（c)測定經(jīng)該待測物處理之該免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之 該報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)以判定該待測物是否為皮膚致敏物質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明更提供一種經(jīng)克隆之新穎細(xì)胞，其系于2014年11月12日保藏于德國微生 物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM ACC3257。
[0010] 因此本發(fā)明提供了不須動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)或皮膚致敏物質(zhì)的新方法 以適合高通量測試使用，開發(fā)出替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，符合相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理及減量的趨 勢。
【附圖說明】
[0011] 圖1顯不本發(fā)明一實(shí)施例之⑶54-啟動(dòng)子mLuc表達(dá)系統(tǒng)。
[0012] 圖2顯示本發(fā)明一實(shí)施例之判定待測物質(zhì)是否為皮膚致敏物的流程。以及
[0013] 圖3顯示本發(fā)明一實(shí)施例之判定待測物質(zhì)是否為抗發(fā)炎物質(zhì)的流程。
[0014] 發(fā)明詳述
[0015] 在本發(fā)明一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法。本發(fā)明之確 認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，可包括，但不限于下列所述步驟。
[0016] 首先，提供待測物與包括⑶54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞。
[0017] 上述待測物之例子可包括，例如，化妝品、藥物、化學(xué)物、天然物之萃取物等，但不 限于此。而上述免疫細(xì)胞之來源的例子則可包括，但不限于THP-I細(xì)胞、U937細(xì)胞、MUTZ-3 細(xì)胞等。在一實(shí)施例中，而上述免疫細(xì)胞之來源為THP-I細(xì)胞。
[0018] 上述免疫細(xì)胞之⑶54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)，可包括，但不限于，⑶54基因之啟動(dòng)子 (0)54 promoter)與報(bào)告基因 （reporter gene),其中上述報(bào)告基因與上述⑶54基因之啟 動(dòng)子連接，用以報(bào)告CD54基因之啟動(dòng)子的表達(dá)。
[0019] 在一實(shí)施例中，上述⑶54基因之啟動(dòng)子之序列可包括序列辨識(shí)號(hào)：1之序列，而在 另一實(shí)施例中，上述CD54基因之啟動(dòng)子之序列可為序列辨識(shí)號(hào)：1之序列。
[0020] 再者，上述報(bào)告基因的例子可包括，但不限于長腹水蚤科螢光素酶（Metridia Iuciferase)基因、螢火蟲螢光素酶（firefly Iuciferase)基因、綠色突光蛋白質(zhì)（green fluorescent protein，GFP)基因 、β -葡萄糖醒酸苷酶（β-glucuronidase)基因等。在一 實(shí)施例中，上述報(bào)告基因?yàn)殚L腹水蚤科螢光素酶基因。長腹水蚤科螢光素酶基因之產(chǎn)物會(huì) 被細(xì)胞直接分泌至培養(yǎng)液，因此測定其表達(dá)（例如，活性）時(shí)，可直接將培養(yǎng)基進(jìn)行冷光分 析，不須將細(xì)胞打破，具有節(jié)省分析時(shí)間之優(yōu)點(diǎn)。
[0021] 在一實(shí)施例中，上述⑶54基因之啟動(dòng)子之序列為序列辨識(shí)號(hào)：1之序列，而上述免 疫細(xì)胞之來源為THP-I細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，上述CD54基因之啟動(dòng)子之序列為序列辨識(shí) 號(hào)：1之序列，而上述報(bào)告基因?yàn)殚L腹水蚤科螢光素酶基因。又，在另一實(shí)施例中，上述CD54 基因之啟動(dòng)子之序列為序列辨識(shí)號(hào)：1之序列，上述免疫細(xì)胞之來源為THP-I細(xì)胞，且上述 報(bào)告基因?yàn)殚L腹水蚤科螢光素酶基因。
[0022] 于本發(fā)明之確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法的一實(shí)施例中，包含CD54基因之啟動(dòng)子與 報(bào)告基因之前述CD54表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)的序列可包括序列辨識(shí)號(hào)：2之序列。在一特定實(shí)施 例中，前述CD54表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)的序列可為序列辨識(shí)號(hào)：2之序列，即CD54表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)為 ⑶54基因之啟動(dòng)子-長腹水蚤科螢光素酶基因（⑶54 promoter-Metridia Luc)之形式。 而于此特定實(shí)施例中，所使用之包括CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，可為藉由將具有序 列辨識(shí)號(hào)：2之序列的病毒載體感染進(jìn)入THP-I細(xì)胞所獲得的細(xì)胞，而此細(xì)胞可以是命名為 ITRI-54M之細(xì)胞，其于2014年11月12日保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號(hào)為 DSM ACC3257。
[0023] 接著，以上述待測物處理上述包括⑶54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞。在一實(shí)施例 中，處理時(shí)間為約1-2天，但不限于此。又，在一實(shí)施例中，在以上述待測物處理上述包括 CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞之前，可先將待測物對(duì)此免疫系胞進(jìn)行細(xì)胞毒性分析，測 定出此待測物對(duì)此細(xì)胞之半生長抑制濃度，并藉此獲得處理濃度。
[0024] 然后，在以上述待測物處理上述包括⑶54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞之后，測定 經(jīng)上述待測物處理之上述免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)以判定上述待測物是否 有免疫調(diào)節(jié)作用。
[0025] 于本發(fā)明之確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法的一實(shí)施例中，在測定經(jīng)上述待測物處理之 免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)以判定上述待測物是否有免疫調(diào)節(jié)作用的步驟中， 系將經(jīng)待測物處理之免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)與未經(jīng)待測物處理之上述免 疫細(xì)胞之報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)作比較，以判定待測物是否具有免疫調(diào)節(jié)作用。若經(jīng)待測物 處理之免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)高于未經(jīng)待測物處理之免疫細(xì)胞之報(bào)告基 因產(chǎn)物的表達(dá)，則判定此待測物具有免疫調(diào)節(jié)作用，為免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。
[0026] 在于本發(fā)明之確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法的另一實(shí)施例中，在以待測物處理包括 CD54表達(dá)之報(bào)告系統(tǒng)的免疫細(xì)胞的步驟中，進(jìn)一步包含添加免疫誘發(fā)物質(zhì)，以使免疫細(xì)胞 產(chǎn)生免疫反應(yīng)。于此實(shí)施例中，在測定經(jīng)待測物處理之免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物 表達(dá)以判定上述待測物是否有免疫調(diào)節(jié)作用的步驟中，系將經(jīng)待測物與免疫誘發(fā)物質(zhì)處理 之免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)與僅經(jīng)免疫誘發(fā)物質(zhì)處理之免疫細(xì)胞之報(bào)告基 因產(chǎn)物的表達(dá)作比較，以判定待測物是否有免疫調(diào)節(jié)作用。若經(jīng)待測物與免疫誘發(fā)物質(zhì)處 理之免疫細(xì)胞所產(chǎn)生之報(bào)告基因的產(chǎn)物表達(dá)低于僅經(jīng)免疫誘發(fā)物質(zhì)處理之免疫細(xì)胞之報(bào) 告