高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于共焦顯微成像技術和質(zhì)譜成像技術領域，將分光瞳共焦顯微成像技術和質(zhì)譜成像技術相結(jié)合，涉及一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質(zhì)譜的高分辨成像。
技術背景
[0002]質(zhì)譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發(fā)生電離，使生成的不同荷質(zhì)比的帶電原子、分子或分子碎片在電場和磁場的作用下分別聚焦而得到按質(zhì)荷比大小順序排列的圖譜儀器。質(zhì)譜成像是對樣品二維區(qū)域內(nèi)多個微小區(qū)域分別進行質(zhì)譜分析來檢測特定質(zhì)荷比(m/z)物質(zhì)的分布。
[0003]自上世紀80年代中期基質(zhì)輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍生物質(zhì)譜成像技術的出現(xiàn)，開拓了質(zhì)譜學一個嶄新的領域一生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術應用范圍擴展到生命科學研宄的眾多領域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白分析等方面的應用，不僅為生命科學研宄提供了新手段，而且也促進了質(zhì)譜技術自身的發(fā)展。
[0004]但現(xiàn)有基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質(zhì)譜探測空間分辨力不高等問題；
[0006]2)質(zhì)譜成像所需時間長，激光質(zhì)譜儀聚焦光斑軸向位置相對被測樣品常發(fā)生漂移冋題。
[0007]而生物樣品“微區(qū)”質(zhì)譜信息的準確獲取對于生命科學研宄具有極其重要的意義。事實上，目前如何高靈敏地探測微區(qū)質(zhì)譜信息是生物質(zhì)譜領域亟待研宄的重要技術問題。
[0008]激光共焦顯微鏡“點照明”和“點探測”的成像探測機制，不僅使其橫向分辨力較同等參數(shù)的光學顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術、徑向偏振光緊聚焦技術等結(jié)合來壓縮聚焦光斑，進一步實現(xiàn)高空間分辨顯微成像。
[0009]基于此，本發(fā)明提出一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，其將激光分光瞳差動共焦顯微鏡聚焦光斑的探測功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經(jīng)超分辨技術處理的分光瞳差動共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對樣品進行高空間分辨成像，利用分光瞳差動共焦顯微鏡同一聚焦光斑對樣品進行解吸電離供質(zhì)譜探測系統(tǒng)進行成像，繼而實現(xiàn)被測樣品微區(qū)的高空間分辨圖像成像和高空間分辨質(zhì)譜顯微成像。
[0010]本發(fā)明提出一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置可為生物質(zhì)譜高分辨成像提供一種全新的有效技術途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的是質(zhì)譜成像的空間分辨能力、抑制成像過程中聚焦光斑相對樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置，以期同時獲得被測對象成分空間信息和功能信息。
[0012]本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的。
[0013]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法，其利用高空間分辨分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)的聚焦光斑對樣品進行定焦與成像，利用高空間分辨分光瞳差動共焦顯微系統(tǒng)的同一聚焦光斑對樣品進行解吸電離來進行質(zhì)譜成像，進而實現(xiàn)樣品微區(qū)圖像與組分的高空間分辨成像，包括以下步驟:
[0014]步驟一、使平行光束通過沿入射光軸方向的壓縮聚焦光斑系統(tǒng)、D型照明收集鏡中的D型照明光瞳聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽；
[0015]步驟二、使計算機控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向在D型照明收集鏡焦點附近上下移動，利用沿采集光軸方向的D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡和位于中繼放大透鏡焦面并關于采集光軸對稱放置的第一光強點探測器和第二光強點探測器對放大艾里斑進行分割探測，得到艾里斑第一微區(qū)和艾里斑第二微區(qū)的強度特性曲線分別為第一離軸共焦軸向強度曲線和第二離軸共焦軸向強度曲線；
[0016]步驟三、將第一離軸共焦軸向強度曲線和第二離軸共焦軸向強度曲線相減處理得到雙軸差動共焦軸向強度曲線；
[0017]步驟四、計算機依據(jù)雙軸差動共焦軸向強度曲線的零點位置zA值控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向運動，使D型照明收集鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上；
[0018]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測樣品產(chǎn)生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質(zhì)譜探測系統(tǒng)中進行質(zhì)譜成像，測得對應聚焦光斑區(qū)域的質(zhì)譜信息;
[0019]步驟六、利用由D型照明收集鏡、D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡、第一光強點探測器、第二光強點探測器和三維工作臺構成的激光分光瞳差動共焦探測系統(tǒng)對聚焦到被測樣品的微區(qū)進行成像，測得對應聚焦光斑區(qū)域的形態(tài)信息；
[0020]步驟七、計算機將激光分光瞳差動共焦探測系統(tǒng)測得的激光聚焦微區(qū)形態(tài)信息與質(zhì)譜探測系統(tǒng)同時測得的激光聚焦微區(qū)的質(zhì)譜信息進行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區(qū)的形態(tài)和質(zhì)譜信息；
[0021]步驟八、計算機控制三維工作臺使D型照明收集鏡焦點對準被測樣品的下一個待測區(qū)域，然后按步驟二?步驟七進行操作，得到下一個待測聚焦區(qū)域的形態(tài)和質(zhì)譜信息；
[0022]步驟九、重復步驟八直到被測樣品上的所有待測點均被測到，然后利用計算機進行處理即可得到被測樣品形態(tài)信息和質(zhì)譜信息。
[0023]本發(fā)明高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法中，包括步驟一可為使平行光束通過沿入射光軸方向放置的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、光瞳濾波器后整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束再經(jīng)圓形照明收集鏡的圓形照明光瞳聚焦到被測樣品上解吸電離產(chǎn)生等離子體羽。
[0024]本發(fā)明高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法中，包括D型照明收集鏡中D型照明光瞳和D型收集光瞳的照明、收集功能可以通過圓形照明收集鏡中圓形照明光瞳和圓形收集光瞳來完成。
[0025]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置，包括點光源、沿入射光軸方向放置的準直透鏡、壓縮聚焦光斑系統(tǒng)、聚焦光斑到被測樣品的D型照明收集鏡和D型照明光瞳，包括D型收集光瞳、采集透鏡、中繼放大透鏡和位于中繼放大透鏡焦面并關于采集光軸對稱放置的第一光強點探測器和第二光強點探測器，以及用于D型照明收集鏡聚焦光斑解吸電離的離子體羽組分的電離樣品吸管和質(zhì)譜探測系統(tǒng)，入射光軸和采集光軸之間的夾角為2 α，并關于測量面法線對稱。
[0026]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括壓縮聚焦光斑系統(tǒng)可以用沿入射光軸方向放置的產(chǎn)生矢量光束的矢量光束發(fā)生系統(tǒng)和光瞳濾波器替代。
[0027]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括D型照明收集鏡可替換為圓形型照明收集鏡。
[0028]本發(fā)明的一種高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，包括第一光強點探測器和第二光強點探測器可以用一個CCD探測器替代。
[0029]有益效果
[0030]本發(fā)明對比已有技術，具有以下優(yōu)點:
[0031]I)將具有高空間分辨能力的分光瞳差動共焦顯微技術與質(zhì)譜探測技術相融合，使分光瞳差動共焦顯微成像系統(tǒng)的光斑實現(xiàn)聚焦探測和樣品解吸電離雙重功能，可實現(xiàn)樣品微區(qū)質(zhì)譜的高空間質(zhì)譜顯微成像；
[0032]2)利用分光瞳差動共焦曲線的過零點進行樣品預先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到樣品表面，可實現(xiàn)樣品微區(qū)高空間分辨質(zhì)譜探測和微區(qū)顯微成像，有效地發(fā)揮分光瞳差動共焦系統(tǒng)高空間分辨的潛能；
[0033]3)利用分光瞳差動共焦曲線過零點進行樣品預先定焦處理，可抑制現(xiàn)有質(zhì)譜儀因長時間質(zhì)譜成像中聚焦光斑相對被測樣品的漂移問題；
[0034]4)利用壓縮聚焦光斑技術，提高了激光質(zhì)譜儀的空間分辨能力；
[0035]5)利用雙軸結(jié)構光束斜入射探測，克服了現(xiàn)有共焦顯微成像技術無法抑制焦面雜散光干擾的缺陷，抗雜散光能力強。
【附圖說明】
[0036]圖1為高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法示意圖；
[0037]圖2為實施例1的高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置；
[0038]圖3為實施例2的高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像方法與裝置。
[0039]其中:1-點光源、2-準直透鏡、3-平行光束、4-壓縮聚焦光斑系統(tǒng)、5-D型照明收集鏡、6-D型照明光瞳、7-D型收集光瞳、8-入射光軸、9-被測樣品、10-測量面法線、11-等離子體羽、12-采集光軸、13-采集透鏡、14-中繼放大透鏡、15-焦面、16-放大艾里斑、17-第一光強點探測器、18-第二光強點探測器、19-艾里斑第一微區(qū)、20-艾里斑第二微區(qū)、21-第一離軸共焦軸向強度曲線、22-第二離軸共焦軸向強度曲線、23-差動共焦軸向強度曲線、24-計算機、25-三維工作臺、26-電離樣品吸管、27-質(zhì)譜探測系統(tǒng)、28-矢量光束發(fā)生系統(tǒng)、29-光瞳濾波器、30-圓形照明收集鏡、31-圓形照明光瞳、32-圓形收集光瞳、33-CXD探測器、34-出射光束衰減器、35-探測光束衰減器、36-脈沖激光器、37-聚光透鏡、38-傳光光纖。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0041]本發(fā)明的核心方法如圖1所示，其中，由壓縮聚焦光斑系統(tǒng)4和D型照明收集鏡5的D型照明光瞳6構成的環(huán)形光橫向超分辨系統(tǒng)，用于壓縮聚焦光斑橫向尺寸。
[0042]以下實施例均是在圖1基礎上實現(xiàn)的。
[0043]實施例1
[0044]如圖2所示的高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置中，壓縮聚焦光斑系統(tǒng)4由矢量光束發(fā)生系統(tǒng)28、光瞳濾波器29替代，D型照明收集鏡5可由圓形照明收集鏡30替代，第一強度點探測器17和第二強度點探測器18由CXD探測器33替代。
[0045]如圖2所示的高空間分辨激光分光瞳差動共焦質(zhì)譜顯微成像裝置包括點光源1、沿入射光軸8方向放置的準直透鏡2、矢量光束發(fā)生系統(tǒng)28、光瞳濾波器29和聚焦光斑到被測樣品9的圓形照明收集鏡30的圓形照明光瞳31，還包括圓形照明收集鏡24的圓形收集光瞳32、位于采集光軸12方向的采集透鏡13、中繼放大透鏡14和位于中繼放大透鏡14焦面15上的CCD探測器33，以及用于圓形照明收集鏡30聚焦光斑解析電離的離子體羽11組分的電離樣品吸管26和質(zhì)譜探測系統(tǒng)27，入射光軸8和采集光軸12之間的夾角為2α，并關于測量面法線10對稱。
[0046]主要構成的功能如下:
[0047]由點光源1、沿入射光軸8放置的準直透鏡2、矢量光束發(fā)生系統(tǒng)28、光瞳濾波器29、聚焦光斑到被測樣品9的圓形照明收集鏡30的圓形照明光瞳31構成的激光聚焦系統(tǒng)用于產(chǎn)生超過衍射極限的微小聚焦光斑，該超衍射微小尺寸光斑具有測量樣品表面和產(chǎn)生表面等離子體的雙重功能。