一種基于全內(nèi)反射的暗場(chǎng)照明方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微成像的照明方法，具體來說，涉及一種暗場(chǎng)照明的方法，特別是利用全內(nèi)反射棱鏡和樣品池的全內(nèi)反射實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品池中微納米顆粒和生物樣品的觀測(cè)和研宄，并且可以廣泛靈活應(yīng)用于現(xiàn)有顯微鏡或者自建成像系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]成像技術(shù)的基于傳統(tǒng)的光學(xué)成像顯微鏡結(jié)合新的激光技術(shù)發(fā)展成現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的熒光顯微鏡，同時(shí)隨著生物分子學(xué)和納米材料科學(xué)等的發(fā)展，研宄的對(duì)象由微米尺度向納米尺度的遞進(jìn)，更高分辨率和信噪比的技術(shù)手段成為影像學(xué)不斷追求的目標(biāo)。最近納米貴金屬顆粒、碳納米管、量子點(diǎn)等具有特殊性質(zhì)的納米材料被廣泛應(yīng)用到合成催化、光電器件、納米載藥和生物影像等領(lǐng)域。例如納米金顆粒具有特殊的等離子體吸收和散射等光學(xué)特性、表面易于化學(xué)修飾、具有優(yōu)良生物相容性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物等領(lǐng)域，但是由于納米材料尺寸遠(yuǎn)小于可見光的波長(zhǎng)時(shí)，超過了普通顯微成像的衍射極限，用傳統(tǒng)的顯微術(shù)無法直接觀察納米級(jí)顆粒成像。因此在成像方面暗場(chǎng)照明技術(shù)利用了納米顆粒自身散射性較強(qiáng)的光學(xué)特性，非常適用于觀察納米尺度材料。
[0003]暗場(chǎng)照明技術(shù)在原理上應(yīng)用了光學(xué)上的丁達(dá)爾效應(yīng)，當(dāng)照明光束進(jìn)入溶膠時(shí)，在照明光的傳播過程中，光線與顆粒作用沿著不同方向按一定統(tǒng)計(jì)規(guī)律被散射可以偏離原來的方向，每個(gè)微粒就成為一個(gè)發(fā)光點(diǎn)，從側(cè)面可以看到一條光柱。通用的暗場(chǎng)照明顯微成像技術(shù)一般采用斜射照明并利用環(huán)形光闌擋住中心的直射照明光，因此照明使用的聚光鏡的數(shù)值孔徑必須要大于成像物鏡的數(shù)值孔徑才能使照明光不能通過聚光器直接進(jìn)入物鏡，而只能從聚光器的光闌四周邊及未遮暗的部位斜射到樣品池中的樣本上。因照明光線是斜射且角度大于物鏡的采集角度的，不能進(jìn)入物鏡，故由顯微鏡觀察到的視野背景是暗的，只能看到因光散射作用而使樣品發(fā)出亮光，從而實(shí)現(xiàn)樣品的暗場(chǎng)觀測(cè)。由于濾除了直射光，采集的只是樣品池中顆粒的散射光，因此暗背景情況下可以有效的提高信噪比。單顆粒的光散射在溶液中，橫向照明光束截面的尺度比顆粒要大得多，所以入射波可以近似為平面波，又由于微粒間距離很大，因此可以看成是單顆粒對(duì)平面波的散射。散射光的空問分布反映顆粒本身的屬性.不同大小、材料、形狀的顆粒的散射光空間分布就有很大差別，可以通過嚴(yán)格的電磁理論計(jì)算，因此利用暗場(chǎng)成像可以有效提取觀測(cè)樣品的物理特性。一般適用于暗場(chǎng)照明的樣品是相對(duì)分散度比較高，背景結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的薄的顆粒樣品例如生物學(xué)中的硅藻、細(xì)菌、酵母、組織培養(yǎng)細(xì)胞、原生動(dòng)物等。適用的非生物標(biāo)本包括晶體礦物和化學(xué)，膠體粒子，包含小夾雜物和聚合物和陶瓷薄片，孔隙度差異，或折射率梯度。暗視野顯微鏡可以看到在明視場(chǎng)里看不到的樣品，生物學(xué)上可以用于檢查未染色生物標(biāo)本的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。
[0004]但是與明場(chǎng)照明區(qū)別的是暗場(chǎng)照明的有效工作區(qū)域相對(duì)較短，當(dāng)聚光鏡固定時(shí)上移或者下移物鏡的范圍超過這一尺度的時(shí)候，由于照明光線的發(fā)散，會(huì)導(dǎo)致采集效率降低和成像質(zhì)量的下降。而且由于聚光鏡必須采用高數(shù)值孔徑，放標(biāo)本放置標(biāo)本時(shí)在聚光鏡前透鏡與載物片之間常常使用浸油，明暗場(chǎng)切換需要更換聚光鏡或者光闌，一般無法在實(shí)驗(yàn)中快速切換，并且由于照明的高數(shù)值孔徑也限制了樣品的厚度。所以樣品和顯微鏡載物片的厚度收到很大限制，傳統(tǒng)的暗場(chǎng)照明樣品因此收到很大的限制。
[0005]另一種利用全內(nèi)反射達(dá)到納米級(jí)分辨率的技術(shù)是全內(nèi)反射顯微成像技術(shù)，通過利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)定樣品的極薄區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常不超過在200nm左右。因?yàn)榻?jīng)過全內(nèi)反射后反射面一側(cè)的激發(fā)光呈指數(shù)衰減，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，很大程度上降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，能幫助研宄者獲得高質(zhì)量的成像質(zhì)量和可靠的觀測(cè)數(shù)據(jù)。但是樣品厚度和成像范圍依然收到很大的限制。
[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有暗場(chǎng)以及全內(nèi)反射倏逝場(chǎng)照明技術(shù)在樣品厚度和成像范圍等方面的不足，提供一種較低成本，易于實(shí)現(xiàn)的利用照明光與樣品作用的散射特性成像的新型暗場(chǎng)照明方法。本方法可以實(shí)現(xiàn)上下兩側(cè)同時(shí)觀察和激發(fā)等功能，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單能與現(xiàn)有成像、檢測(cè)和激發(fā)系統(tǒng)結(jié)合，調(diào)節(jié)便捷，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)厚樣本中微納米顆粒的照明，進(jìn)而更加便于開展相關(guān)生物影像精確觀測(cè)和膠體特性動(dòng)態(tài)測(cè)量等研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有暗場(chǎng)以及全內(nèi)反射照明技術(shù)在厚尺寸樣品等方面的不足，提供一種利用照明光的散射特性成像的可用于微納米顆粒觀測(cè)及研宄的方法。本方法可以實(shí)現(xiàn)上下兩側(cè)同時(shí)觀察和激發(fā)功能，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單能與現(xiàn)有成像、檢測(cè)和激發(fā)系統(tǒng)結(jié)合，調(diào)節(jié)便捷，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)厚樣本的照明，進(jìn)而更加便于開展相關(guān)生物影像觀測(cè)和膠體特性等研宄。
[0008]為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一種基于全內(nèi)反射的暗場(chǎng)照明裝置，采用以下的技術(shù)方案:
[0009]一種基于全內(nèi)反射的暗場(chǎng)照明裝置，包括全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡包含載物臺(tái)、上成像物鏡、全內(nèi)反射棱鏡、下成像物鏡，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的載物臺(tái)上設(shè)有樣品池，樣品池上設(shè)有全內(nèi)反射棱鏡，樣品池里裝載樣品金納米顆粒的水溶液，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡設(shè)有對(duì)稱的上光路與下光路，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的上光路一側(cè)設(shè)有上成像物鏡，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的下光路一側(cè)設(shè)有下成像物鏡，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的上光路與下光路的成像面互相重疊在樣品池的中待觀察區(qū)域中；
[0010]全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的上光路由上成像光電傳感器、成像透鏡B、濾光片A、上成像物鏡組成，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡上側(cè)設(shè)有上成像物鏡，上成像物鏡遠(yuǎn)離全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的另一側(cè)前面設(shè)有成像透鏡B，成像透鏡B遠(yuǎn)離上成像物鏡的另一側(cè)前面設(shè)有濾光片A，濾光片A遠(yuǎn)離成像透鏡B的另一側(cè)前面設(shè)有上成像光電傳感器，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的上光路發(fā)出的光束經(jīng)過上成像物鏡、成像透鏡B、濾光片A照射到上成像光電傳感器；
[0011]全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡下側(cè)(下光路)設(shè)有下成像物鏡，下成像物鏡遠(yuǎn)離全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的另一側(cè)設(shè)有一個(gè)與光路成45度角的二向色鏡，二向色鏡側(cè)面與下成像物鏡光路垂直方向設(shè)有激光器，激光器與二向色鏡之間設(shè)有擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡組，激光器的光路經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡組后通過二向色鏡反射到達(dá)下成像物鏡，聚焦在樣品池。
[0012]進(jìn)一步，在一些實(shí)施例中，所述全內(nèi)反射的暗場(chǎng)照明裝置還包含照明激光、全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡、全內(nèi)反射棱鏡、樣品池。
[0013]進(jìn)一步，在一些實(shí)施例中，所述二向色鏡下方設(shè)有與之垂直的反射鏡，反射鏡側(cè)面與下成像物鏡光路垂直方向設(shè)有有成像透鏡A和濾光片B，下成像物鏡的成像光束經(jīng)過二向色鏡、反射鏡、成像透鏡A和濾光片B后，將放大的影像投射到下成像光電傳感器上。
[0014]進(jìn)一步，在一些實(shí)施例中，所述照明激光發(fā)出的激光經(jīng)過全內(nèi)反射棱鏡全內(nèi)反射照射到樣品池中的微納米顆粒的水溶液中，照明激光經(jīng)過樣品池池底的全內(nèi)反射后再次進(jìn)入全內(nèi)反射棱鏡，在全內(nèi)反射棱鏡中多次反射出射離開棱鏡。
[0015]進(jìn)一步，在一些實(shí)施例中，所述全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡的激發(fā)光路由激光器、擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡組、二向色鏡、下成像物鏡組成，全內(nèi)反射暗場(chǎng)照明顯微鏡遠(yuǎn)離下成像物鏡的另一側(cè)(上光路)設(shè)有上成像物鏡；下成像物鏡下面首先設(shè)有一個(gè)45度角放置的二向色鏡，二向色鏡偏轉(zhuǎn)激光一側(cè)是擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡組