專利名稱：檢測化學制品和物質(zhì)混合物的毒性及誘變效應(yīng)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用固定化發(fā)光細菌或者利用通過轉(zhuǎn)入合適的質(zhì)粒載體來發(fā)磷光的基因工程微生物來檢測化學制品與物質(zhì)混合物的毒性及誘變效應(yīng)的方法和裝置。由于生物學效應(yīng)的檢測可能會持續(xù)一段很長的時間，所以本發(fā)明能夠被用來監(jiān)測環(huán)境參數(shù)和控制農(nóng)業(yè)和工業(yè)的生產(chǎn)。
可被利用來檢測毒性及誘變效應(yīng)的微生物和離體培養(yǎng)的細胞是眾所周知。為了檢驗有毒物質(zhì)的毒性，可以使用細菌(DE-OS3902982；LüMMEN,P.:forum mikrobiologie 10,428-434(1998))，離體培養(yǎng)的細胞(ROSSI,A.et al.:Pharmacol.&Toxicol.68,424-429(1991))，原生動物(BRINKMANN,G.:Z.Wasser-und Abwasser-Forsch.11,210-215(1978))，植物原生質(zhì)體(OVERMEYER,S.et al.:UWSF-Z.Umweltchem.kotox.6,5-8(1994))和綠藻(BRINKMANN,G.u.R..Kühn:Z.Wasser-und Abwasser-Forsch.10,87-98(1997))。此外，腸桿菌(ODA,Y.et al.:Mutation Res.147,219-229(1985))和發(fā)光細菌(ULITZUR.S.et al.:Mutation Res.74,113-124(1980))被建議用來檢測誘變效應(yīng)。以前使用的檢測方法存在著一些不足即其不但費時而且還需要有特殊設(shè)備的實驗室。因此，只能進行一些樣品的單一檢測而不可能開展田間的研究。
本發(fā)明的目的是研制可用于有毒物質(zhì)檢測的方法。基于此考慮，發(fā)光細菌以及微生物被固定化。被固定化了的細胞和光檢測裝置連接構(gòu)成了一個生物傳感器。這種新研制的生物傳感器被用在模型的已知的流動注射系統(tǒng)中來控制樣品的供應(yīng)。
自然的發(fā)光細菌和基因工程產(chǎn)生的發(fā)光細菌以及其它相應(yīng)的微生物，其固定化的步驟如下1．將微生物的機械內(nèi)含物置于一個帶有多孔膜的測量室內(nèi)，多孔膜可透過污染物。
2．在基質(zhì)內(nèi)進行固定化，基質(zhì)如瓊脂、膠原或聚丙烯酰胺。
3．包埋在海藻酸鈣或硫酸纖維素的鋇鹽中。
4．在合適的固定劑的作用下，吸附在膜或其它載體物質(zhì)的表面上，固定劑為戊二醛或帶有環(huán)氧基團的物質(zhì)。
生物傳感器的光檢測裝置是由一個通過例如光電二極管可以檢測到相當微弱放射線的測量系統(tǒng)和相應(yīng)的信號預(yù)放大器及顯示裝置構(gòu)成。
將固定化細胞(生物傳感器的生物學成分)在有一些部分可透光的測量容器內(nèi)培養(yǎng)，可透光的部分安裝著一個光測量系統(tǒng)，以用來測量微生物的生物發(fā)光。也可以使用一個遮光測量室，此測量室僅和一個纖維光束相連接以傳導信號到光測量裝置。樣品的供應(yīng)是通過置于模型的已知的流動注射系統(tǒng)中的生物傳感器的附件來完成的，流動注射系統(tǒng)由幾個可以被一個微處理器或一個外部計算機控制的泵和磁性通口構(gòu)成(附

圖1)。
本發(fā)明是將已知技術(shù)和新改進特征相結(jié)合，現(xiàn)有技術(shù)和新改進的特征是相互影響的，且二者結(jié)合后可以用來檢測化合物和物質(zhì)混合物經(jīng)過一段時間間隔后的生物學效應(yīng)以監(jiān)控環(huán)境參數(shù)及控制農(nóng)業(yè)和工業(yè)的生產(chǎn)過程，并產(chǎn)生了預(yù)料的成功。
所述的固定化發(fā)光細菌或通過轉(zhuǎn)入合適的質(zhì)粒載體來發(fā)磷光的基因工程細菌的使用，出現(xiàn)了令人驚訝的解決了普通問題的新的用途。例如一些環(huán)境參數(shù)監(jiān)測任務(wù)，如空氣、地表水、廢水或瀝濾液的控制和農(nóng)業(yè)與工業(yè)的生產(chǎn)過程的控制。此外，固定化細菌的使用可以允許重復多次的單獨測量，因此在不同樣品的研究過程中固定化細菌有著多重的用途。
除了在環(huán)境參數(shù)的研究上的新的應(yīng)用外，還可以應(yīng)用于化合物、化妝品、藥物、殺蟲劑、部分物體或食品的毒性與誘變性的篩選。
附圖11帶有飽和氣載體一液體的容器2氣動泵3-5 液體泵6六道磁性通口7注入口8三道磁性通口9帶有固定化細胞的測量室10 帶有固定化細胞的暗室P1-P4樣品1-4S1-S2標準1和標準2Pu1-Pu4 緩沖劑卜4Aw 廢水本發(fā)明可期望通過下面的實施例得到說明典型實施例實施例1將費氏弧菌的自然產(chǎn)生的黑色突變體置于每升含5g蛋白胨、3g甘油、15.5g NaCl、0.75g KCl、12.3g MgSO4.7H2O、1.45g CaCl2.2H2O、0.075g K2HPO4.2H2O和1.0g NH4Cl的溶液內(nèi)培養(yǎng)。通過消光可以檢測到所需要的細胞濃度(大約105個細胞ml-1)并將pH值調(diào)整到7.0。用生理鹽水配成1.2％的褐藻酸鈉溶液并進行過濾除菌。加入細菌的懸浮液，直到褐藻酸鈉溶液的終濃度為1％。通過一個已安裝了皮下注射用針頭的細微注射器，在持續(xù)地加壓下，上述溶液被逐滴地加到0.2M的CaCl2溶液中。在褐藻酸鹽的凝固作用后，將固定化細胞用生理鹽水潤洗幾次。通過與誘變性物質(zhì)的接觸，細菌的生物性發(fā)光增強了。因此，與陰性對照的控制測量相反的放射光的加倍是非常有價值作為物質(zhì)的誘變效應(yīng)的證據(jù)的。此外，用肝酶組分對樣品的前處理(S9-mix)，也可以進行并發(fā)突變的檢測。
實施例2在加熱和攪拌的條件下，將1.5g的瓊脂溶解在100ml的蒸餾水中。冷卻到40-45℃后，將費氏弧菌細菌的懸浮液(在30g NaCl、6.10gNaH2PO4.3H2O、0.204g MgSO4.7H2O、0.50g(NH4)2HPO4、3ml甘油、5g蛋白胨、0.5g酵母提取物中加水填充到11-1，用NaOH或HCl調(diào)pH值為7.2+/-0.2)混入已加熱的溶液中。然后，此混合物在流動注射系統(tǒng)的測量室內(nèi)凝固成瓊脂斜面。通過與含有有毒物質(zhì)，代謝物的樣品接觸，結(jié)果生物發(fā)光受到了抑制。因此，發(fā)光細菌的20％的生物發(fā)光量被抑制是存在毒性的證據(jù)。
實施例35ml費氏弧菌細菌的懸浮液(見實施例2)置于冰上冷卻。在5ml的用冰冷卻的0.2M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中混入1.63g丙烯酰胺、0.08g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和5mg過氧化亞硫酸氨并且攪拌至完全溶解。在不斷地攪拌下，將細菌懸浮液和0.08ml的N,N,N’,N’-四甲基乙烯二胺逐滴加入上述溶液中。60至90分鐘后聚合反應(yīng)結(jié)束。獲得的凝膠用緩沖液洗滌并且培養(yǎng)在流動注射系統(tǒng)的測量室內(nèi)。與實施例2一樣，含化合物的樣品的毒性效應(yīng)就可測定了。
實施例4通過轉(zhuǎn)入LUX-基因復合體的基因工程大腸桿菌，如同實施例3中描述的一樣，被固定化并用于毒性的研究。
實施例5將如同實施例l的含4％纖維素硫酸鈉的溶液，逐滴加在含聚二烯丙基二甲基氯化銨的0.9％NaCl溶液的2％溶液中，固化8分鐘。通過低滲溶液中的已獲得的球型體的傳遞，穩(wěn)定、光滑、可滲透污染物的膠囊便形成了。利用注射器細小的皮下注射用針，發(fā)光細菌如費氏弧菌、哈氏弧菌、Ph.hosphoreum或Ph.leiognathi或其它有發(fā)光能力的微生物的懸浮液，可以被插入到膠囊內(nèi)的空隙里。這些膠囊被送入流動注射系統(tǒng)的測量室中用來檢測物質(zhì)混合物或單個物質(zhì)的毒性效應(yīng)。
實施例6在發(fā)光細菌或其它微生物(實施例1和5)的懸浮液中溶解2％的褐藻酸鈉。將規(guī)定尺寸的無菌玻璃纖維過濾器完全浸入到上述溶液中，然后置于0.2M的CaCl2溶液中培養(yǎng)并且在0.9％的NaCl溶液中洗滌數(shù)次，這樣穩(wěn)定的玻璃纖維褐藻酸鈉固定劑就獲得了。然后將上述獲得的固定劑插入生物傳感器系統(tǒng)的測量室中。
實施例7在如實施例1所述的細胞懸浮液中，完全溶解4％的硫酸纖維素鈉。采用注射器和不同直徑的皮下注射用針，在聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液中沉淀，再用0.9％NaCl溶液洗滌之后，就得到了不同直徑大小的穩(wěn)定的硫酸纖維素膠囊。這種固定化技術(shù)適合于不同的野生種以及發(fā)光細菌的暗色突變株和其它的有發(fā)光能力的細菌。
權(quán)利要求
1．通過生物傳感器來檢測化合物和物質(zhì)混合物的毒效及誘變效應(yīng)的方法，所述的生物傳感器由具有生物發(fā)光能力的固定化細胞以及與其連接的光檢測裝置組成。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用了發(fā)光細菌或通過適當?shù)馁|(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化而具有發(fā)光能力的基因工程生物體。
3．如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于，生物傳感器是如附圖1的流動系統(tǒng)。
4．如權(quán)利要求1至3所述的方法，其特征在于，生物傳感器用于多次重復的單一檢測。
5．用于檢測化學制品和物質(zhì)混合物的毒效及誘變效應(yīng)的生物傳感器裝置，其由固定化的生物發(fā)光的生物體和光檢測裝置構(gòu)成。
6．如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，所述的生物體是發(fā)光細菌或者是通過合適的質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化而具有生物發(fā)光能力的基因工程生物體。
7．如權(quán)利要求1至6所述的方法和裝置，其特征在于，此方法和裝置可以被用于環(huán)境的監(jiān)測，例如空氣、地表水、廢水或瀝濾液的控制及農(nóng)業(yè)和工業(yè)的生產(chǎn)過程的控制。
8．如權(quán)利要求1至7所述的方法和裝置，其特征在于，此方法和裝置可以被用于環(huán)境參數(shù)的檢測和化合物、化妝品、藥劑、殺蟲劑、部分物質(zhì)或食品的毒性與誘變性的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種方法和裝置,該方法和裝置通過使用固定化發(fā)光細菌或合適的質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化而被賦予生物發(fā)光能力的微生物來檢測化學制品和物質(zhì)混合物的毒性及誘變效應(yīng),所述裝置裝有光檢測的光電子部分以便于通過這種方式形成生物感應(yīng)器。由于生物學效應(yīng)的檢測可以在很長的一段時間內(nèi)進行,所以本發(fā)明能夠被用來進行監(jiān)測環(huán)境參數(shù)及控制農(nóng)業(yè)和工業(yè)的生產(chǎn)過程。
文檔編號G01N33/18GK1237211SQ98801234
公開日1999年12月1日 申請日期1998年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月15日
發(fā)明者霍斯特·伯徹 申請人:Iut環(huán)境毒物學私人研究有限公司