專利名稱：：均相溶膠－溶膠測定的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明的領域本發(fā)明涉及使用包括2種分離的溶膠顆粒的均相溶膠顆粒測定來測定流體樣品中配體量的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種溶膠顆粒測定，其中一種溶膠結合到配體上，另一種溶膠結合到能與特定配體偶聯(lián)的物質上。本發(fā)明的背景在許多分析領域中能檢測或定量樣品中以非常低濃度存在的物質的方法是重要的工具。包含包括測量如尿和血液的生物流體臨床樣品中低濃度的分析物的方法和檢測樣品中少量的藥物和諸如殺蟲劑和除草劑的化學品的痕量殘留的方法。為了有用，測定流體樣品中低水平物質的方法必須高度靈敏和精確。諸如免疫測定的以受體為基礎的測定是該方法的例子且通常用于檢測諸如血液和尿的生物學流體的臨床樣品中非常低濃度的物質。免疫測定經(jīng)過使用與待測物質(例如，第一抗體)特異性反應的抗體來檢測這些物質。免疫測定以許多方式進行分類。一種重要的分類是測定系統(tǒng)中的異相/均相差示，另一分類是測定系統(tǒng)中的競爭/夾層差示。在異相系統(tǒng)中，該測定需要通過一種固定的結合配體(例如，一種抗體)從結合到固相的成份中分離游離成份。在均相系統(tǒng)中，該測定不需要分離結合和游離相。在競爭方式中，感興趣的物質和標準成份競爭諸如抗體上的結合位點，該結合位點在異相系統(tǒng)中存在于或結合在固相上。在夾層測定中，標記成份結合到感興趣的物質上，而該物質是抗體或結合于抗體上。在異相系統(tǒng)中，抗體是一種固相或結合于固相上。大多數(shù)免疫測定經(jīng)過實際測量標記物或標記的二級現(xiàn)象，如放射活性，酶活性，熒光，散射光，生物發(fā)光或化學發(fā)光實現(xiàn)定量初級抗體-抗原反應。這些測定各自存在某些缺陷，如復雜的程序，使用昂貴的設備和有毒試劑。在放射免疫測定(RIA)中，用放射性同位素標記抗原或抗體。RIA測量免疫復合物中放射性標記的量，該復合物是樣品中感興趣的物質或分析物量的一種功能。RIA可使用夾層或競爭測定方式。盡管已證實RIA在許多診斷情況下有用，這類測定有許多缺陷。例如，該測定需要復雜的且昂貴的儀器來測量放射標記。放射性同位素具有有限的保質期，且由于它們是危險品，因此這類測定的使用者需要專業(yè)化訓練。放射性同位素也需要專業(yè)化的處理技術。已建立了使用非放射性標記物的其它測定，例如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，免疫熒光測定和化學發(fā)光測定。ELISA方式經(jīng)過測量酶底物反應來檢測分析物。例如，酶連接到抗體或抗原上以保護酶活性及連接物免疫學反應性的方式形成一種連接物。選定的酶典型地作用于底物產(chǎn)生有色的或熒光產(chǎn)物。反應期間，加入連接物并結合到感光趣的分析物上(以夾層的方式)或與感興趣的分析物進行競爭(以競爭性方式)。然后加入酶的底物。結合到分析物上的酶連接物的量與加入的底物的轉換相關，而該轉換又與分析物的量相關。這些測定相對于放射免疫測定具有某些優(yōu)點，如快速，低花費和去掉了放射活性物質。然而，ELISA具有酶不穩(wěn)定和程序復雜的缺點。在Hansen的美國專利號5286452中描述的另一類測定包括向含有多種分析物的樣品中加入不同大小的或不同包被的單一亞基球形顆粒，例如乳膠珠。作為與分析物相互作用的結果該顆粒凝集或不能凝集。在流式顆粒分析儀(FPA)中測定凝集量。經(jīng)過獲得凝集的乳膠珠的散射光可測量結合的程度。由于需要測量通過流動細胞的光散射而限制了該技術。已知的免疫測定使用金屬膠體顆粒作為標記。美國專利號4,313,734公開了一種“溶膠顆粒免疫測定”(SPIA)，它使用分散于流體介質或“溶膠”中的膠體金或銀顆粒作為標記。(也見J.H.W.Leuveing等，免疫測定雜志，177-91(1980))。前面已描述了使用膠體金屬顆粒的免疫測定的兩種方式。一種方式是競爭性異相方式，其中用配體標記的個體溶膠與自由配體競爭抗配體覆蓋的固相上的有限數(shù)量的結合位點。為了定量，異相免疫測定需要分離游離部分和結合到固相上的部分。這類測定的一個例子是利用結合到固相上的抗半抗原的免疫球蛋白。例如，如在美國專利4313734中所述，試管壁用抗睪酮免疫球蛋白的覆蓋。含有感光趣的半抗原(如睪酮)的樣品在試管中保溫。去掉未結合的樣品后，用銀標記的半抗原(即，睪酮)進行第二次保溫，它結合固相上的未占據(jù)的位點。然后分離該金屬，并測量吸光率以確定樣品中睪酮的量。這一具體測定在超過18小時的時間內需要2步保溫并使用未稀釋的樣品。在Leuvering等，免疫測定雜志，177＝91(1980)中公開的夾層型測定是使用膠體金屬顆粒的異相免疫測定的另一個例子。免疫學成份，例如，抗體固定于固相表面，如微滴度平板的孔表面上。含感興趣的分析物的樣品與孔中的抗體保溫。洗去未反應的樣品后，與金屬標記的抗體進行第二次保溫，該抗體結合經(jīng)第一抗結合到孔表面的分析物。然后在結合或自由相中測量金屬的品紅色，優(yōu)選在分離結合標記后的結合相中，它表示樣品中分析物的量。一種異相金膠體測定使用分散的固相成份，例如用免疫學成份標記的乳膠，玻璃或瓊脂糖珠，它與結合到金膠體上的另一免疫學成份相互作用以形成含金屬的固相，收集該固相用于肉眼觀察。結合的量，收集的固相的顏色或沉降的固相的上清取決于樣品中分析物的濃度(見cole等，美國專利號4859612)。這些測定稱為“金屬溶膠捕獲免疫測定”，因為它們依賴于含金屬固相的分離和測量以顯示分析物的存在(見Ditlovo等，美國專利號5,202,267)。分離步驟可以是主動方法，如離心，或被動方法，如依賴于重力的沉降或濾過多孔膜的表面。任一種分離方法都向程序中增加了額外的步驟且增加了測定的分析時間。而且，這些測定僅給出了定性反應；它們不夠敏感，不能定量測定樣品中的配體量。已描述了使用一標記的成份來測定溶液中半抗原的蛋白質的濃度。(Leuvering等，免疫學方法雜志，376，175-189，181(1986))。稱為均相凝集測定的這些測定不能直接檢測某些分子，如半抗原，它在免疫學上是單價的。這些文獻描述了一個均相方式，其中免疫學成份，典型地是與感興趣的分析物反應的抗體用膠體金標記并加入懷疑含有感興趣的分析物的樣品中。這一單一金標記的成份與加到溶液中的多價半抗原連接物反應。例如，Leuvering描述了將半抗原的多個分子附著到一個諸如牛血清白蛋白(BSA)的分子上形成的多價半抗原復合物(Leuvenng等，免疫學方法雜志，62163-174(1983))。這種BSA-[半抗原]N復合物象多價抗原一樣發(fā)揮作用并能聚集或凝集用抗半抗原的抗體覆蓋的金顆粒。溶液中的游離半抗原抑制用抗體和BSA-半抗原復合物覆蓋的金顆粒的混集。分散的金溶膠顆粒具有品紅色。然而，當顆粒聚集時，根據(jù)聚集的程度溶膠的品紅減退或消失。抗體覆蓋的金顆粒與分析物的凝集程度，由此產(chǎn)生的溶液或凝集顆粒的顏色與反應混合物中分析物的濃度相關。對于夾層測定，樣品中分析物越多，產(chǎn)生的金膠體聚集越大。對于半抗原測定，樣品中的分析物越多，產(chǎn)生的金膠體聚集越少。(T.J.C.Gribnau等，染色體雜志，376，175-189，181(1986))。這些測定不需要分離步驟。在這些測定中，經(jīng)過保溫達2小時后測量溶液中的吸光率來測定凝集程度，由此得到游離半抗原的量。同上，除了必需一段保溫時間外，這些測定的局限性在于它們僅對尿樣品或血清提取物有用，對金血清樣品無用(見T.J.C.Gribnau等，染色體雜志，376175-189，182(1986))。而且，這些測定不能直接檢測以毫微摩爾量存在于血清中的半抗原。建立一個進行定性測定以確定樣品中分析物存在的快速，簡單，靈敏和易于觀察的方法仍是有用的。定性試驗通常用于(例如)篩選生物學樣品中濫用藥物的存在。一個廣泛使用的技術是薄層色譜(TLC)。典型地是，將尿液的小樣品上樣到用薄層硅膠均勻覆蓋的玻璃板的底端。板的底端浸入溶劑中，尿中的成份根據(jù)溶劑和成份的光學性質以不同的速率在平板上遷移。干燥后，樣品成份與特定試劑反應以觀察該成份。將板上的成份位置與在板上相鄰尿樣建立的藥物標準品進行比較以確定該藥物是否存在于樣品中。該定性方法緩慢。昂貴，勞動強度大且產(chǎn)生有害的溶劑廢物。檢測以低濃度存在的環(huán)境污染的試驗最近變得更普遍。諸如殺蟲劑和除草劑的污染物是環(huán)境中最感興趣的。例如，atrazine在一段時間內是普遍感興趣的一個主題。Atrazine是一種用作除草劑的三嗪，用于控制各種食品莊稼中的了芽前后的一年生草本和闊葉雜草(O′Daly，J.P.等，美國專利號5391272)。風，土壤侵蝕，和水沖刷引起這種持久性除草劑出現(xiàn)在供應給農(nóng)場動物的飼料和水中以及在用于人類消費的產(chǎn)品中。也已知atrazine污染施用它的區(qū)域內的飲水。(Lay，J.P.等，臭氧層，13(7)821-832(1984))。在Huber.S.J.，臭氧層，14(11-12)1795-1803(1985)中首先公開了對水中ppt(每1012分之幾)范圍敏感的人工的，異相的，固相免疫測定系統(tǒng)。也已經(jīng)公開了測定土壤、水和食品中atrazine濃度的免疫測定。該測定需要長的培養(yǎng)時間和費力的洗滌步驟。(Bushway，R.J.等，Bull.Environ，Contam.Toxicol.，40647-654(1989)；Bushway，R.J.等，Bull.Euviron，Contam.Toxicol.，42899-904(1989)。通常可得到商用系統(tǒng)來測量水中的atrazine殘留(Klamp.s.，GITFachz.Lab.，37(10)845-846，848-850(1995))。例如，商業(yè)上可獲得的EnviroGard定性試驗試劑盒和Millipore微滴度平板利用了樣品和與微滴度板壁上固定的抗體相連的酶之間的競爭性反應。加入底物后獲得藍色，加入硫酸終止反應時變成黃色。經(jīng)過比較樣品顏色與標準品的顏色或經(jīng)過450nm下讀吸光率來定量atrazine的量。靈敏度是0.1至1.0ppb。EnviroGard試驗需要分別加入硫酸的步驟，而硫酸是危險和腐蝕性的。最近，O′Daly等，美國專利號5,391,272描述了一種電化學免疫測定來檢測在10-20ppb范圍內敏感的atrazine。這一具體的試驗缺乏靈敏性且需要昂貴的儀器。考慮到以殺蟲劑和除草劑形式在環(huán)境中廣泛使用的化學品，需要一種簡單的、定量的和精確的方法來測量這些化學品的水平，這些化學品可能以低濃度存在于土壤、食品和水樣品中。還有些情況是同時測量樣品中超過一種分析物或配體的存在是有用的。例如，同時施用抗驚厥藥品用于治療癲癇發(fā)作。(G.Moriarty，臨床化學，L.Kaplan和A.Pesce編輯，605-606(1989))。因此，建立一個能測定相同樣品中小濃度的2個不同物質的測定方法將是有用的。因此，需要建立一個簡單和快速地測定流體樣品中分析物濃度，特別是低濃度的半抗原的方法。該測定應對任何可勻漿成流體介質的樣品是有用的。特別是希望能測定全血清樣品中的分析物。還需要建立不使用毒素或昂貴試劑的方法。還更高地要求具有不需分離或收集步驟的方法。而且，常常需要增加測定的靈敏性，使能夠定量流體樣品中的配體，如半抗原。本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了一種測定流體樣品中配體量的方法，其靈敏度足以定量毫微摩爾范圍的半抗原，且不需分離或收集步驟。本發(fā)明的一個方面是用于在流體樣品中檢測配體存在或測定其量的方法、包含(a)提供第一試劑，包含具有可檢測的物理特性的結合于配體或配體類似物(以競爭性方式)上的溶膠顆?；蛞环N能與配體特異性偶聯(lián)的物質(以夾層方式)；(b)提供具有可檢測的物理特性的第二試劑，包含結合于能與如果存在的配體和/或配體類似物特異性偶聯(lián)的物質上的溶膠顆粒；(c)混合第一，第二試劑和流體樣品，作為樣品中配體存在的結果所述的試劑互相偶聯(lián)，從而產(chǎn)生溶膠顆粒物理特性的改變，該變化與試劑的偶聯(lián)程度相關；(d)檢測反應前，期間或之后溶膠顆粒的物理特性的改變，該檢測提供了流體樣品中定性或定量的配體指標。第一試劑中能與配體特異性地偶聯(lián)的物質與第二試劑中能與配體特異性地偶聯(lián)的物質可以是相同或不相同的?？蓹z測的物理特征的一個例子是光的吸收率。在該例子中，各試劑在特定波長下具有最大吸光率。第一試劑，第二試劑和流體樣品的混合物的吸光率根據(jù)第一和第二試劑的溶膠顆粒和偶聯(lián)程度而發(fā)生改變，而改變是混合物中配體量的函數(shù)。在本發(fā)明的一個實施方案中，第一試劑，第二試劑和流體樣品大約同時混合。在另一實施方案中，第一和第二試劑混合，經(jīng)過一段預定時間后，加入樣品。在另一實施方案中，加入該樣品和第一或第二試劑，經(jīng)過預定的一段時間后加入未與樣品一起加入的試劑。用于本發(fā)明的溶膠顆粒包括具有可檢測的物理特征的任意顆粒，且包括金屬，熒光團或生色團。溶膠顆粒的大小和組成決定了它吸收的波長。優(yōu)選的溶膠顆粒的顆粒大小具有達到在溶液中沉降的大小的范圍。優(yōu)選的是，溶膠顆粒是金屬，包含金、銀、銅、鐵或鋁，最優(yōu)選金。優(yōu)選的金屬溶膠顆粒具有從大約5nm到大約200nm范圍的顆粒大小。更優(yōu)選的是，溶膠顆粒具有從大約40nm到大約100nm的大小，最優(yōu)選從大約60nm到大約80nm。對于熒光團和生色團，優(yōu)選的溶膠顆粒具有達到1微米的大小。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，可檢測的物理特性是克分子吸光率。本發(fā)明的一個該方法包含使用處于或接近溶膠顆粒最大吸光率處的波長測量反應的吸光率來檢測分析物的存在或測定其量。第一和第二試劑的溶膠顆?？梢韵嗤虿煌?。當需要使吸光率變化達最大時，優(yōu)選兩種試劑中的每一溶膠各具有基本上相同的吸光率最大值，特別是對于所使用的溶膠類型。當試劑在基本上相同的波長下吸光時，由于各偶聯(lián)相互作用能潛在地產(chǎn)生光譜改變，因此能使吸光率減少達最大。吸光率減小達最大有利于測量吸光率的改變，提供足夠靈敏的測定以定量樣品中低濃度的小配體。另外，可使用吸光率測定以產(chǎn)生定性結果，指示樣品中感興趣的一種配體的存在。優(yōu)選的是在各溶膠顆粒中的金屬，生色團或熒光團相同。在優(yōu)選的實施方案中，為了使用金膠體，吸光率最大值優(yōu)選在510至600nm之間。最優(yōu)選的是，金膠體在570nm和580nm之間具有最大吸光率。優(yōu)選的實施方案包括用于檢測和測定小半抗原，例如，但不限于激素，如甲狀腺素(“T4”)以及治療藥物，如地谷新(digoxin)，苯巴比妥和phenytoin，濫用藥物和環(huán)境污染，如殺蟲劑和除草劑，如atrazine的測定。本方法的試劑是穩(wěn)定的且相對于穩(wěn)定性較小的放射性同位素和酶標記具有優(yōu)勢。由于在進行測定中不涉及危險物質，如放射性同位素或有毒化學品，因此不需要采用特別的處理技術。本發(fā)明還提供了用于檢測流體樣品中配體存在或測定其量的試劑盒，該試劑盒包括第一試劑，包括具有可檢測的物理特征且結合于(i)配體或配體類似物(以競爭性方式)或(ii)能特異性地與配體偶聯(lián)的物質(以夾層方式)上的溶膠顆粒，該試劑盒還包括第二試劑，包含具有可檢測的物理特性且結合于能與如果存在的配體和/或配體類似物特異性偶聯(lián)的物質上的溶膠顆粒，作為樣品中配體存在的函數(shù)所說的試劑可互相偶聯(lián)從而產(chǎn)生物理特性的改變，該變化與試劑的偶聯(lián)程度相關。能特異性地與配體偶聯(lián)的第一試劑的物質與能特異性地與配體偶聯(lián)的第二試劑的物質可以相同或不同。在試劑盒的一個優(yōu)選的實施方案中，溶膠顆粒包含金屬，優(yōu)選金，銀，銅，鐵和鋁，最優(yōu)選金。溶膠顆粒的優(yōu)選大小范圍從大約5nm到大約200nm。更優(yōu)選的是，溶膠顆粒大小從大約40nm到大約100nm，最優(yōu)選從大約60nm到大約80nm。一個實施方案提供了用于檢測樣品中抗原或半抗原的免疫測定，其中第一試劑配體是一種抗原或半抗原。能特異性地與配體偶聯(lián)的第二試劑的物質是該抗原或半抗原的抗體。在該免疫測定的一個例子中，溶膠顆粒是金屬，如金，試劑的顆粒具有可檢測的克分子吸光性。混合物吸光率取決于溶膠結合的抗體和溶膠結合的抗原或半抗原的偶聯(lián)程度，是樣品中抗原或半抗原的函數(shù)。當兩個試劑反應時，第一試劑和溶膠結合的抗原或半抗原在樣品中缺乏抗原或半抗原時與第二試劑的溶膠結合的抗體偶聯(lián)，在混合物中產(chǎn)生克分子吸光率的最大變化，例如減少。當含感興趣的抗原或半抗原的樣品與溶膠顆粒反應時，抗原或半抗原與溶膠結合的抗原競爭地結合溶膠結合的抗體上的結合位點，克分子吸光率的改變不如上面大。抗原或半抗原的總量經(jīng)過比較試劑和樣品混合物的吸光率與校準曲線來測定。涉及兩種分離的溶膠顆粒相互作用的這類測定的描述術語是溶膠-溶膠顆粒免疫測定，或“SSPIA”。在產(chǎn)生定性結果的本發(fā)明的一個實施方案中，第一試劑，具有明顯可檢測的物理特性的，結合到配體或配體類似物上的溶膠顆粒與第二試劑，具有明顯可檢測的物理特性的，結合到級特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上的溶膠顆粒在溶液中合并，然后經(jīng)過預定時間期間限后，加入懷疑含有感興趣的配體的樣品。第二試劑的溶膠顆粒結合到多出的能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上。在預定時間期間，第一和第二試劑顆粒偶聯(lián)。在預定時間期間第一和試劑偶聯(lián)使溶液具有明顯可檢測的物理特征，例如，失去顏色。第二試劑的結構使得如果樣品中配體低于閾值量時，配體被試劑吸附而不明顯改變明顯可檢測的物理特性。在該實施方案中，當存在超過閾值量的配體時，配體取代第一試劑并與第二試劑的溶膠顆粒偶聯(lián)以產(chǎn)生溶液物理特性上的可見變化，例如，顏色。經(jīng)過使用偶聯(lián)到溶膠上的低結合親和力的異相半抗原或作為選擇，經(jīng)過使用低結合親和力的抗體可增強該測定的靈敏性。該實施方案對于測定濫用的藥物，如苯異丙胺，大麻素，可卡因，鴉片制劑和phencycidine是有用的。在定性的競爭性測定的另一個實施方案中，分別干燥第一試劑，具有明顯可檢測的物理特性的結合到配體或配體類似物上的溶膠顆粒，和第二試劑，具有明顯可檢測的物理特性的結合到能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上的溶膠顆粒并以干燥的形式混合且經(jīng)過加入流體樣品溶解。如果存在的配體超過閾值量，則觀察到物理特性，例如，顏色。如果配體不存在或以低于閾值量存在，觀察到物理特性的改變，例如，失去顏色。在以夾層形式的定性測定的另一實施方案中，第一和第二試劑均包含具有明顯可檢測的物理特征的溶膠顆粒，能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質結合于其上。能特異性地偶聯(lián)配體的第一試劑的物質與能特異性地偶聯(lián)配體的第二試劑的物質可以相同或不同。如果配體存在于樣品中，第一和第二試劑的溶膠顆粒經(jīng)過均與配體偶聯(lián)而偶聯(lián)，產(chǎn)生缺乏明顯可檢測的顏色的溶液。如果配體不存在，溶膠顆粒不偶聯(lián)且產(chǎn)生顏色上可觀察的變化。這種實施方式也能用于定量方式。本發(fā)明還提供了具有可檢測的物理特性的免疫學復合物。一個優(yōu)選的復合物包括結合于配體或配體類似物上的第一溶膠顆粒和結合于能特異性地偶聯(lián)如果存在的配體或配體類似物的物質上的第二溶膠顆粒，第一和第二溶膠顆粒分別具有可檢測的物理特性，其中物理特性的性質根據(jù)結合到第一溶膠顆粒上的配體和能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物且結合于第二溶膠顆粒上的物質的偶聯(lián)而改變。另一優(yōu)選的復合物包含(I)具有可檢測的物理特性的結合于能特異性地與如果存在的配體或配體類似物偶聯(lián)的物質上的第一溶膠顆粒，和(ii)具有可檢測的物理特性的結合于能特異性地與該配體或配體類似物偶聯(lián)的物質上的第二溶膠顆粒，其中兩種顆粒均偶聯(lián)到該配體或配體類似物上。該復合物的物理特性的性質與單獨的溶膠顆粒的物理性質不同。能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的第一試劑的物質與能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的第二試劑的物質可以相同或不同。在本發(fā)明的免疫學復合物的優(yōu)選的實施方案中，溶膠顆粒包含一種金屬，優(yōu)選金、銀、銅、鐵或鋁，最優(yōu)選金。本發(fā)明還提供了檢測流體樣品中多種配體的存在或測定其量的方法，包含(a)提供對各種所說的多種配體的第一試劑，包含一種溶膠顆粒，它結合于(i)配體或配體類似物上(以競爭性形式)或(ii)能特異性地偶聯(lián)配體的物質上(以夾層形式)；(b)提供對各種所說的多種配體的第二試劑，包含結合于能特異性地結合配體和/或配體類似物的物質上的溶膠顆粒，相應于各種所說的配體的第一和第二試劑的溶膠顆粒具有專一的可檢測的物理特征，并與相應于其它配體的溶膠顆粒的物理特性能區(qū)分；(c)混合該試劑和流體樣品，作為樣品中多種配體存在的函數(shù)，所說的試劑互相偶聯(lián)，從而產(chǎn)生物理特性的變化，該變化與試劑的偶聯(lián)程度相關；(d)檢測或測定反應期間或之后溶膠顆粒的物理特性，該檢測或測定提供了流體樣品中多種配體的定性或定量指標。能特異性地與配體偶聯(lián)的第一試劑的物質與能特異性地偶聯(lián)配體的第二試劑的物質可以相同或不同。在用于檢測流體樣品中多種配體存在或測定其量的方法的一個實施方案中，物理特性是克分子吸光率，與各種多個配體相應的溶膠顆粒是具有不同克分子吸光率的不同金屬。在用于檢測流體樣品中多種配體的存在或測定其量的方法的另一實施方案中，物理特性是克分子吸光率，相應于多種配體中每一個的溶膠顆粒是不同大小且具有不同克分子吸光率的溶膠顆粒。本發(fā)明進一步提供了制備結合于配體或配體類似物上的試劑溶膠顆粒的方法，包含(1)將配體或配體類似物連接到選自第一蛋白質，樹狀體或第一多聚體的載體分子上形成配體連接物；(2)將配體連接物與溶膠顆粒結合形成配體結合的溶膠；(3)用選自第二蛋白質，去污劑或第二多聚體的封閉劑穩(wěn)定配體結合的溶膠顆粒。在一個優(yōu)選的方法中，第一蛋白質包含兔γ球蛋白。優(yōu)選的是，封閉劑選自非脂肪干乳或酪蛋白。附圖的簡要描述圖1是本發(fā)明的方法的一個實施方案的示意圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的總T4測定的吸光率對T4濃度布點的校準曲線。圖3是用于本發(fā)明的一個方法中的T4結合的金和金顆粒的吸光率光譜。圖4是在缺乏T4對抗-T4結合的金溶膠和T4結合的金溶膠的混合物吸光率光譜對時間的曲線。圖5是根據(jù)本發(fā)明的地谷新測定的校準曲線。圖6是根據(jù)本發(fā)明的苯巴比妥測定的校準曲線。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明用于檢測流體樣品中配體存在或測定其量的方法涉及使用至少2種包含不同溶膠顆粒的試劑。第一種試劑包含結合于感興趣的配體或具有相似反應性的該配體的類似物上的溶膠顆粒(用于競爭性形式)或一種能特異性地偶聯(lián)配體的物質(用于夾層形式)。第二試劑包含結合于能特異性地偶聯(lián)配體和配體類似物(如果使用配體類似物)的物質上的溶膠顆粒。能特異性地偶聯(lián)第一和第二試劑的配體的物質可以相同或不同。第一和第二試劑的溶膠顆粒具有可檢測的物理特性，例如吸光率，當結合于包含第一試劑的顆粒上的配體或類似物與結合于能特異性地偶聯(lián)配體或類似物的第二試劑的顆粒上的物質偶聯(lián)時，物理特性改變。本發(fā)明的方法包含將第一和第二試劑與流體樣品反應。作為樣品中配體存在的函數(shù)，結合于一種試劑溶膠顆粒上的配體或配體類似物與另一試劑的顆粒偶聯(lián)，從而產(chǎn)生物理特性的改變，它與試劑的偶聯(lián)程度相關。該方法進一步包含檢測溶膠顆粒的物理特性以提供流體樣品中配體定性或定量的指標。本文使用的術語“配體”指與另一分子偶聯(lián)的分子(配體的例子包括特異性結合的蛋白質，抗原，抗體，半抗原)，廣義上用于包括所有大小的分析物。術語“配體類似物”指功能和反應性上相似于感興趣的配體但有結構差別的分子。本文使用的術語“抗-配體”指能特異性地偶聯(lián)配體的任意分子或其任意片段。本文使用的術語“溶膠顆粒”指包含溶膠的顆粒。本發(fā)明利用了由兩種分離的溶膠顆粒凝集引起的光譜變化。見圖1，它顯示了一種競爭性方式。經(jīng)過將溶膠結合的配體或配體類似物偶聯(lián)到溶膠結合的抗-配體上實現(xiàn)溶膠顆粒的凝集。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是均相測定，它使用了兩個基本上具有相同的最大吸光率的分離的溶膠顆粒。溶膠顆粒的偶聯(lián)產(chǎn)生對各偶聯(lián)事件而的最大信號(即，最大吸光率減小)。使用兩種顆粒比僅使用一種溶膠顆粒產(chǎn)生更強烈的信號，因而有助于測量光譜變化。本發(fā)明的方法產(chǎn)生了測定反應的放大，因而形成了比以前已知的均相溶膠顆粒測定更靈敏的測定。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，樣品中配體的量經(jīng)過在處于或靠近溶膠顆粒最大吸光率處測量含2種溶膠顆粒和樣品的混合物的溶液的吸光率的改變來測定。反應的總吸光率變化與樣品中配體的量相關。在不存在游離配體時，更多的顆粒偶聯(lián)產(chǎn)生吸光率的最大減小。在存在游離配體時，互相偶聯(lián)的溶膠顆粒越少，隨后觀察到吸光率減少越小。因此存在于樣品中的配體量可經(jīng)過測量當配體或抗配體結合的溶膠顆粒存在于含樣品的溶液中時吸光率的改變來測定。本發(fā)明的溶膠包含具有可檢測的物理特性的任意物質。該物理特性的例子包括，但不限于克分子吸光率，熒光或光散射。能產(chǎn)生光譜變化的任何溶膠可在本發(fā)明中發(fā)揮功能。溶膠顆粒優(yōu)選包括金屬，染料或熒光物質。兩種分離的結合的顆粒的偶聯(lián)產(chǎn)生吸光率，熒光或濁度的變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，該顆粒是金屬。優(yōu)選的金屬包括金，但其它金屬溶膠，如銀、銅、鐵、鋁或其它也是合適的。在本發(fā)明中有用的溶膠的大小和組成決定其吸收的波長。本領域的技術人員經(jīng)過產(chǎn)生特定組成和大小的顆?？缮a(chǎn)在特定波長下吸光的溶膠。溶膠顆?？筛鶕?jù)本領域已知的方法來構建(例如，見Beesley.J.E.分子生物學方法，Vol.10免疫學方案，M.Manson編輯，pp163-168(1992)；Frens，G.，自然物理科學，24120-22(1973)；Turkevich.J.，等，Disc.FaradaySoc.，1155-75(1951))。優(yōu)選的是，根據(jù)下列程序構建從金膠體制備的溶膠顆粒。制備的膠體金的小“種”顆粒的最大吸光率優(yōu)選在從大約510到大約520nm的范圍內，更優(yōu)選從大約510至514nm，但最優(yōu)選在512nm處。種生長成更大的溶膠顆粒。溶膠顆粒優(yōu)選的大小范圍從大約5nm到大約200nm，更優(yōu)選從大約40nm到大約100nm，最優(yōu)選從大約60nm到大約80nm。經(jīng)過改變種和金的濃度可控制膠體的生長以調節(jié)顆粒出現(xiàn)最大吸光率時的波長。例如，具有5nm直徑的顆粒在大約510nm處最大吸光，而大約90nm的顆粒在大約590nm處最大吸光。圖3顯示了金粒和T4標記的金溶膠的吸收率光譜，證實了其最大吸光率的差異。優(yōu)選的是，金顆粒生長的大小相應于在大約510nm至大約650nm范圍內的最大吸光率，更優(yōu)選從540至600nm，最優(yōu)選從大約570至580nm。應明白當在本發(fā)明的方法中使用膠體金溶膠時510至650nm的波長范圍是優(yōu)選的范圍。其它金屬溶膠在該范圍外具有不同吸光率最大值且同樣有用。還應明白根據(jù)本文的教導在本發(fā)明中有用的其它溶膠的吸光率最大值可用本領域已知的方法易于測定。制備溶膠顆粒時，使用不引起金顆粒絮凝的反應容器是重要的。經(jīng)過使用硅化玻璃反應容器，或更優(yōu)選的是由諸如聚乙烯或聚丙烯制成的塑料反應容器可防止絮凝。本發(fā)明的溶膠顆粒結合于配體(或配體類似物)或抗配體上。在本發(fā)明的一個實施方案中，當配體是半抗原時，為了制備結合的溶膠，配體首先共價附著于合適的載體分子(如蛋白質，樹狀體(例如見美國專利號4,507,466、4,568,737、4,694,064本文以參考文獻引用)或其它多多聚體)上以形成配體連接物。在一個實施方案中，載體分子是兔γ-球蛋白。將配體附著于載體上形成配體連接物的重要方面包括配體分子上的特定連接位點，配體和載體之間的橋連或間隔物的類型(如果有的話)，附著到載體上的配體量以及連接化學。特定配體的連接化學的選擇可用已知方法確定。(例如，見MichaelBrinkley，生物連接化學，32-13(1992)；BernardF.Erlanger，藥物學回顧，25271-280(1973))。然后將配體連接物結合到溶膠顆粒的表面上。下列因素對于制備配體結合的溶膠是重要的配體連接物濃度，溶膠組成和濃度，pH，離子強度，以及連接物的長度或蛋白質包裹時間。優(yōu)選的這些因素是生產(chǎn)各具體的配體結合的溶膠所必需的。本領域的技術人員易于實施這種優(yōu)選。也選擇這些相同的因素，即抗配體濃度、溶膠組成和濃度、pH、離子強度和包裹時間用于制備抗配體結合的溶膠。用于本發(fā)明的合適的抗配體包括抗體或抗體片段(單克隆或多克隆的)。制備抗體片段，如F(ab′)2、F(ab′)和F(ab)的方法是熟知的。(例如，見P.Parham，實驗免疫學手冊，卷1免疫化學，D.M.Weir編輯，14，1-14.23(1986)；D.R.Stanworth.和M.W.Turner.實驗免疫學手冊，卷1免疫化學，D.MWeir編輯，12.1-12.46(1986))。然后經(jīng)過加入封閉劑穩(wěn)定配體或抗配體結合的溶膠顆粒以減小顆粒間的非特異性相互作用。這些試劑在本領域是已知的，且包括蛋白質，去污劑以及諸如PEG和PVP的多聚體。對于金溶膠，非脂肪干乳和酪蛋白是優(yōu)選的封閉劑最優(yōu)選酪蛋白。以對已知誘導聚集的試劑的抗性，如對金溶膠是鈉離子可監(jiān)測穩(wěn)定過程。穩(wěn)定后，用本領域已知的眾多方法中的一種可去掉未結合兩種類。兩個優(yōu)選的方法是溶膠顆粒的離心和超濾。使用離心時，優(yōu)選經(jīng)避免過多的引力來限制溶膠絮凝。對于不同類型和大小的溶膠優(yōu)選合適的離心條件。當制備小量溶膠顆粒，離心是優(yōu)選的方法。對于各具體的配體測定，根據(jù)許多不同的因素選擇結合于配體或抗配體上的溶膠顆粒的量。這些因素包括測定效果參數(shù)，如靈敏性，特異性，精確性和準確度。其它重要的因素包括檢測系統(tǒng)(例如，分光光度計)的線型范圍以及附著于溶膠顆粒上的配體或抗配體的量。一般來說，各溶膠的量首先以要領域已知的方法來調節(jié)以產(chǎn)生最適劑量/反應曲線，具體實施例在表1中顯示表1測定混合物的金溶膠量<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="806">金溶膠T4測定T4測定苯巴比妥測定地谷新測定半抗原標記的1.270.770.740.68IgG標記的0.540.34F(ab’)標記的0.390.19</table></tables>在表1中，金溶膠的含量如果稀釋成1ml，以λmax下的最終吸光率(在1ml.比色皿中)表達。例如，如果12.3μl苯巴比妥-rgG金溶膠用于測定混合物，儲液溶膠溶液在λmax(580nm)下光密度為60.1，使用的溶膠量最終吸光率為(60.1)×(0.0123)＝0.74。本發(fā)明的方法對于測量任意感興趣的配體有用。本發(fā)明的方法對于測量小配體或半抗原特別有用。下面部分列出了在全血清中可應用該測定的物質撲熱息痛，N-乙酰普魯卡因酰胺，氨基羥丁基卡那霉素A，阿米替林，戊巴必妥，仲丁巴必妥，咖啡因，氨甲酰氮卓，可卡因，可待因，皮質醇，苯甲二氮卓，毛地黃毒苷，地谷新，乙琥胺，慶大霉素，導眠能，環(huán)己烯巴必妥，ibuprofen，利度卡因鹽酸鹽，甲琥胺，嗎啡，netimicin，nortriptyline，14-羥基二氫可待因酮，戊巴比通，phencyclidine，苯巴比妥，phenytom，去氧苯必妥，普魯卡因酰胺，丙氧吩，奎尼丁，水楊酸，司可巴必妥，茶堿，甲狀腺素，托普霉素，Valproicacid和萬古霉素。該測定用于檢測大型蛋白質，如人絨毛促性腺激素(HCG)，鐵蛋白，C-反應性蛋白(CRP)，載脂蛋白，肝類抗原和免疫球蛋白。本測定對于檢測和測量非生物學流體的樣品中的低含量的物質有用。例如，本測定在檢測和測定土壤，冰和食品的環(huán)境樣品中的低水平的污染物有用。下面部分例舉了該測定有用的除草劑，殺蟲劑和其它污染物的例子阿特拉津，氯丹，chlorneb(和其它含氯殺蟲劑)，DTT，Demetor，二嗪農(nóng)(和其它有機磷殺蟲劑)，二乙基鄰苯二酸鹽(和其它鄰苯二酸酯)，樂果，二甲基鄰苯二酸鹽，樂果，Etridiazole，六氯苯，馬拉硫磷，甲基對硫磷，草達滅，三九一一，毒草安，西瑪三嗪，Trifkurilin和2，4-D(和其它苯氧酸除草劑)。上面列出的用于舉例而不打算限制本發(fā)明的范圍。在一些優(yōu)選的實施方案中，該測定是競爭性測定。在其它實施方案中，該測定是夾層測定。試劑和樣品可大約同時加入或按需要的特定順序加入。試劑反應產(chǎn)生的物理特性的變化可用本領域已知的來檢測。例如，當測量吸光率時，用諸如在分光光度計或能測量吸光率改變的任意其它檢測系統(tǒng)中進行測量的方法可實現(xiàn)檢測。優(yōu)選檢測物理特性的改變在反應的前30分鐘內測量?？砂炊它c測定進行該方法，它對于定性測定特別有用。對于定量測定，優(yōu)選該方法根據(jù)反應的速率進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，以一定的間隔進行測量，例如，在反應的前10分鐘內每分鐘或每一分半鐘進行，以確定該時間內的反應速率。表1包括顯示溶液中配體結合的溶膠顆粒(T4-兔γ-球蛋白(T4-rgG)金溶膠)與抗配體結合的溶膠顆粒(抗-T4rgG金溶膠)反應的吸光率隨時間減少的數(shù)據(jù)。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="844">圖譜號混合溶膠后的分鐘數(shù)在570nm下的吸光率101.358251.2873101.2504201.151</table></tables>圖4顯示了相應于表1中值的吸光率圖譜，證實了由于更多的配體結合的溶膠顆粒與抗配體結合的溶膠顆粒偶聯(lián)而吸光率減少。本發(fā)明的另一方面是在包含對各個所感興趣的配體具有不同可檢測的物理特性的溶膠顆粒的流體樣品中檢測超過一種配體的存在或測定其量。該方法的一個優(yōu)選的實施方案包括使用具有不同大小的溶膠顆粒并測量物理特性的改變，例如，在相應于不同大小的顆粒的不同吸光率最大值的波長下吸光率的改變。例如，處于或靠近530nm具有吸光率最大值的金顆粒可用作感興趣的一個分析物(例如苯巴比妥)的溶膠顆粒，處于或靠近590nm具有吸光率最大值的金顆?？捎米髁硪桓信d趣的分析物(例如，phenytoin)的溶膠顆粒。用于檢測流體樣品中超過一種配體的存在或測定其量的方法的另一實施方案包括加入由不同材料制成的，對各種感興趣的配體具有不同物理特征的溶膠顆粒。例如，不同的金屬用于各配體，如金和銀，這些顆粒設計成在不同的波長下具有吸光率最大值。該實施方案在生色團，熒光團或比濁檢測系統(tǒng)中也有用。在定性均相測定方式中使用金溶膠提供了容易應用于定性觀察解釋的快速、靈感和簡單的試驗。在本發(fā)明的另一實施方案中，結合于多出的抗特異性配體的抗體上的金溶膠顆粒和結合于配體連接物上的金溶膠在溶液中混合，允許進行偶聯(lián)。這一反應產(chǎn)生溶膠的聚集，肉眼觀察基本上無色。對感興趣的各配體選擇多出的抗體使存在樣品中的配體量能被溶膠吸附而不破壞聚集。當感興趣的配體以特定水平或濃度存在時，該配體破壞溶膠偶聯(lián)，改變最大波長吸光率并增加溶液的克分子吸光度。經(jīng)過使用偶聯(lián)到溶膠上的低結合親和力的異相半抗原，或另外，經(jīng)過使用低結合親和力的抗體可增強該測定的靈敏性。對于金溶膠以形成品紅色檢測摩爾吸光度的增加。例如，在測定尿樣品濫用藥物存在的定性試驗中，可選擇吸附的藥物量特定藥物的NIDA閾值濃度相匹配，如苯異丙胺(1000ng/ml)，大麻素(100ng/ml)，可卡因(300ng/ml)，鴉片制劑(300ng/ml)和phencyclidine(25ng/ml)。超過這些水平時，游離的藥物取代結合于溶膠顆粒上的抗體偶聯(lián)位點上的溶膠結合的藥物。如果觀察到品紅顏色，則藥物試驗呈陽性。在以競爭性方式進行定性試驗的另一實施方案中，根據(jù)本領域已知的方法(例如，凍干)分別干燥包含結合于配體上的溶膠的試劑和包含結合于抗感興趣的配體的抗體上的溶膠的試劑，混合干燥的試劑。使含有未知量的感興趣的配體的流體樣品溶解干燥的混合物。如果在樣品中存在閾值量的配體，它與結合于溶膠上的配體競爭結合于溶膠顆粒上的抗體的偶聯(lián)位點并防止抗體結合的溶膠與配體結合的溶膠聚集，分離的溶膠保留它們的顏色。如果無配體，或在樣品中存在低含量的配體，溶膠聚集并使去可觀察的顏色。例如，在藥物試驗中，待測樣品溶解抗藥物的抗體結合的溶膠與藥物或其類似物結合的溶膠的混合物。如果存在的藥物超過某一閾值量，則觀察到顏色。如果樣品不含藥物，或以低于閾值量存在，則顏色消失。在以夾層方式進行定性測定的另一種類型中，第一和第二試劑的顆粒結合于能偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上。如果配體存在于樣品中，兩種試劑的溶膠顆粒經(jīng)過都與配體偶聯(lián)而偶聯(lián)。這將產(chǎn)生失去觀察上可檢測的顏色的溶液。當配體不存在樣品中時，試劑不經(jīng)過配體發(fā)生偶聯(lián)。缺乏配體導致溶液的顏色無可見的變化。本發(fā)明的另一方面是用于檢測流體樣品中配體存在或測定其量的試劑盒。本發(fā)明的方法所用的試劑穩(wěn)定，具有長貨架壽命且對于生產(chǎn)和使用不昂貴。因此，這些試劑適于試劑盒組合物。本發(fā)明的試劑盒包含對實施本發(fā)明的方法所必需的試劑。該試劑盒優(yōu)選的實施方案包括含有結合于配體上的溶膠顆粒的第一試劑和含有結合于能特異性地偶聯(lián)配體的物質上的溶膠顆粒的第二試劑，第一和第二試劑的溶膠顆粒具有可檢測的物理特性。各試劑的量取決于所感興趣的配體以及待測樣品的性質。本領域的技術人員能根據(jù)本領域已知的方法和本文包含的內容作出決定。而且，該試劑盒不受試劑形式，即粉末、流體或片劑的限制。在本領域中應明白可提供這類試劑用于根據(jù)許多不同形式中任意一種的試劑盒。提供的下面的實施例是為了更清楚地說明本發(fā)明的各個方面而不是用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I金粒的制備所有操作使用塑料的容器，測量裝置和試管進行。向90ml純水中加入HAuCl4三水合物(2.54×10-5mol，0.5ml2％的水溶液，AldrichChemicalCompsny)并充分攪拌1分鐘。加入檸檬酸三鈉二水合物(3.40×10-5mol；1ml1％的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入氫硼酸鈉(1.98×10-5mol，1ml0.75mg/ml溶于檸檬酸三鈉)并充分攪拌混合物5分鐘。金粒通過0.2微米濾膜(醋酸纖維素)過濾并在室溫下貯存。在下文中，相應于最大吸光率的波長稱為“λmax”。典型的金粒的λmax在512至514nm下觀察，吸光率從0.75至0.85(在1cm比色皿中)實施例II-測量總T4a)試劑的制備1.制備T4-辛二酸N-羥基琥珀酸(NHS)酯L-甲狀腺素(“T4”)(0.49g，0.63mmol)加入10mlN，N-二甲基甲酰胺(“DMF”)中(在4A型分子篩上干燥)。用干燥管(氯化鈣)套住反應管并避光。加入三乙胺(176μl，1.26mmol)和二琥珀酸亞胺辛二酸(0.35g，0.95mmol)，攪拌懸液加熱至40℃30分鐘。15分鐘后懸液變成清亮的溶液。再攪拌混合物1小時，同時反應液冷卻到室溫。在不超過40℃的溫度下經(jīng)真空蒸餾去掉DMF以產(chǎn)生亮棕色油狀固體。殘留物溶于氯仿∶甲醇1∶1中，經(jīng)過硅膠上用氯仿∶甲醇∶乙酸9∶1∶0.1展開的預制TLC純化產(chǎn)品。從板上切下Rf＝0.5的主帶，研磨并用氯仿∶甲醇3∶2進行萃取。在真空中去掉溶劑，產(chǎn)生的殘留物用氯仿研磨。在真空中去掉氯仿以產(chǎn)生白色固體的最終產(chǎn)品(0.23g，0.22mmol)。分析產(chǎn)物的NHS酸含量。T4辛二酸衍生物與乙二胺的反應釋放N-羥基琥珀亞胺(NHS)。在260nm下監(jiān)測其形成。使用NHS的E＝10,000LM-1cm-1以克分子基礎測定NHS酯％。具有該消光系數(shù)的NHS酯含量為73％。產(chǎn)品貯存于-20℃避光保存。2.1.制備T4-rgG連接物兔γ-球蛋白(“rgG”)(CohnFractionsII，III，Sigma化學公司)以20ng/ml的濃度溶于25mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.4(PBS)的溶液中。用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)，接著進行0.2微米過濾，rgG濃度調節(jié)成10mg/ml。T4辛二酸以10mg/ml溶于DMF中并以4份相等的等分試樣加入rgG中，使T4-辛二酸rgG的最終摩爾競爭比為3∶1。競爭比率使用以T4-辛二酸的NHS酯百分數(shù)為基礎的相關因子?；旌衔镌谑覝叵卤芄夥庞趽u動混合器中過夜。經(jīng)過用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)去掉未結合的T4-辛二酸，當流出物的A254不超過0.015時判斷為完全去掉。使用以rgG作為內部標準的BSA校準器經(jīng)蛋白質測定(BCA，Pierce)確定T4-rgG連接物的蛋白質濃度。T4附著于rgG上導致干擾蛋白質吸收光譜。盡管不能定量，經(jīng)過測量A280/A300的比率監(jiān)測T4附著于rgG上。對于PBS中的天然rgG該比率典型地是6.0至6.5，而T4-rgG連接物典型地顯示出5.3至5.7的比率。產(chǎn)品在-20℃貯存。3.離心制備T4-rgG金溶膠所有操作使用塑料器皿進行。向900ml純化水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol，10ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)且充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-5mol，20ml10mg/ml的水溶液)且充分攪拌1分鐘。加入金粒(400μl)且充分攪拌溶液5分鐘。發(fā)現(xiàn)使用凝膠填充的電極(FisherScientific)測量的溶液pH為大約2.5。用0.2MK2CO3調節(jié)pH為7.5至7.6。用純水將T4-rgG(4.0mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)過pH的金溶膠，充分攪拌30分鐘。加入脫脂奶粉(CARNAT10N)使奶粉終濃度為0.04％，在室溫下避光攪拌混合物過夜。在558nm下觀察金溶膠的λmax為2.1(1cm)的吸光率。試驗了溶膠對Na+離子絮凝的穩(wěn)定性。向1ml溶膠中加入0.1ml10％NaCl，加鹽后3和10分鐘時監(jiān)測從400至750nm吸光率光譜。在這些條件下該溶膠保留λmax時其100％的吸光率。經(jīng)過在2000xg下20至25℃離心15分鐘去掉未結合的T4-rgG連接物。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。按所述重復洗滌，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃下貯存。在570nm下觀察金溶膠的λmax為28.3的光密度(在1cm比色皿中)。4.制備抗-T4IgG金溶膠所有操作使用塑料器進行。向90ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol，1ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥氨(2.88×10-4mol，2ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(40μl)，溶液充分攪拌5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調到7.5。用純水將抗T4IgG(OEMConceptsInc.，0.2mg)稀釋成9.0ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠中，充分攪拌60分鐘。加入脫脂奶粉(Carnation)，使奶粉終濃度為0.04％，在室溫下攪拌混合物過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的抗T4IgG。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于25ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5的溶液中，接著以2000xg離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃下貯存。在564nm下觀察金溶膠的λmax，光密度為28.0(在1cm比色皿中)。5.測定平均顆粒大小按實施例II.4(抗-T4IgG金溶膠的制備)所述制備溶膠但改變金粒的量。用電子顯微鏡分析溶膠以測定溶膠顆粒的平均大小。如表3所示。7.制備抗-T4·F(ab′)2金溶膠所有操作使用塑料制品進行。向180ml純水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol，2ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)且充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(5.76×10-4mol，4ml10mg/ml的水溶液)且充分攪拌1分鐘。加入金粒(60μl)且溶液充分攪拌5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.6。用純水將抗-T4F(ab′)2(0.3mg)稀釋成9ml，加入pH調節(jié)的金溶膠，充分攪拌15分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終止?jié)舛葹?.04％在室溫上攪拌混合物過夜。在572nm下觀察金溶膠的λmax，吸光率為2.1(在1cm比色皿中)。試驗溶膠對Na+離子絮凝的穩(wěn)定性。向1ml溶膠中加入0.1ml10％NaCl，加入鹽后3和10分鐘時監(jiān)測400至750nm的吸光率光譜。在這些條件下溶膠保留100％的λmax處的吸光率。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的抗T4F(ab′)2。吸出并棄去上清液，沉淀分別重懸于20ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，將溶膠重懸于最小體積的相同緩沖中并在2-8℃貯存。在564nm處觀察金溶膠的λmax，光密度為39.0(在1cm比色皿中)。b).總T4測定的方案制備試驗緩沖液，使試驗混合物含有終濃度為50mM的甘氨酸，pH9.0，0.2mM8-苯胺-1-萘硫酸，110mM碘化鉀，0.2％卵清蛋白，6.3％甘露醇，0.6％L-亮氨酸和0.3％Di-Pac(97％蔗糖)。向各小杯(光徑長度(“l(fā)”)＝0.5cm)中加入溶于測定緩沖液的T4-rgG金溶膠，隨后加入溶于測定緩沖液的抗-T4IgG金溶膠或抗T4F(ab′)2金溶膠，接著加入含T4的樣品(校準品，對照或未知)。最終測定體積為300μl，樣品體積為3μl。調節(jié)測定中的各溶膠的濃度使起始雙色吸光率不超過2.0。兩種溶膠的比例產(chǎn)生最適校準曲線反應性。以0、2.5、5.0、10.0、15.0和25.0μg/dL(0-322nM)將T4稱重加入除去了T4的人血清中制備標準品。以10分鐘的時間間隔取雙色(450/575nm)吸光率讀數(shù)得到吸光率的減少作為L-甲狀腺素濃度的函數(shù)。校準曲線的測定結果在表4中提供。測定反應性是雙色吸光率×10,000。表4<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="843">μg/dLT4抗-T4IgG測定反應性抗-T4F(ab′)2測定反應性0291965222.5251261135.02276585210.01626469615.01086343425.04981955</table></tables>這資料在圖2中以圖示提供，顯示了使用抗T4IgG和抗-T4F(ab′)2的校準曲線。這些結果顯示，F(xiàn)(ab′)2片段比全IgG具有更大的反應性。將未知樣品的吸光率與這些校準曲線進行比較以測定樣品中總T4的濃度。實施例II測量地谷新a)試劑的制備1.地谷新rgG連接物的制備(+)-地谷新(19.7mg，0.025mmol)在55℃溶于3.94ml甲醇中。加入來自100mg/ml貯液(溶于水中)的過碘酸鈉(27mg，0.13mmol)，反應混合物在室溫下避光攪拌過夜。氧化在末端毛地黃毒素糖的糖殘基上導入二醛。將兔γ-球蛋白(rgG，CohnFractionII，III，Sigma化學公司)的緩沖液變?yōu)?用YM-10膜，Amicon)0.1MK2CO3，pH9.0，蛋白質濃度調節(jié)為10.0mg/ml。將過碘酸鹽氧化的地谷新(3.33×10-4mmol)加入到rgG(25mg，1.67×10-4mmol)中，并避光放于搖動混合器上2小時。制備溶于0.1NNaOH中的10mg/ml的硼氫化鈉溶液。使發(fā)生Schiff堿性還原30分鐘。將混合物上樣到脫鹽柱(PharmaciaPD-10)上，用25mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.4洗脫，合并含蛋白質的餾分。使用以rgG作為內部標準的BSA校準品以蛋白質測定(BCA，Pierce)確定地谷新-rgG連接物的蛋白質濃度。產(chǎn)品貯存于2-8℃。2.地谷新-rgG金溶膠的制備所有操作使用塑料制品進行。向900ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol，10ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-3mol，20ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(300μl)并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5。用純水將地谷新-rgG(8.0mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌15分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終止?jié)舛葹?.1％，在室溫下避光攪拌混合物過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的地谷新-rgG連接物。吸出并棄去上清沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物pH7.5中，接著以2000xg離心15分鐘。溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃貯存。在572nm下觀察金溶膠的λmax，光密度為57.3(在1cm比色皿中)。3.制備抗地谷新F(ab′)2片段抗地谷新腹水(BeckmanInstruments，Inc.，)在蛋白瓊脂糖上純化以分離IgG部分。半抗地谷新IgG的緩沖液換成(用YM-10膜，Amicon)0.1M乙酸鈉，0.1MNaCl，pH4.2。且將抗體濃度調成5.8mg/ml。加入胃蛋白酶(2％w/w)且在37℃進行消化23小時。經(jīng)過加入1MTris，pH8.5(20％v/v)終止胃蛋白酶消化。將混合物上樣到AcA44(BicoSepraInc.)柱上，并用0.1M磷酸鈉，0.1MNaCl，5mMEDTA，pH6.0洗脫。F(ab′)2的回收率相對于起始IgG為50％。產(chǎn)品貯存于-80℃。4.抗地谷新F(ab′)2金溶膠的制備所有操作使用塑料制品進行。向180ml純水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol，2ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(5.76×10-4mol，4ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(60μl)且溶液充分攪拌5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.6。用純水將抗地谷新F(ab′)2(0.2mg)稀釋成18ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌15分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使最終濃度為0.04％，室溫攪拌混合物過夜。在558nm下觀察金溶膠的λmax，吸光率為2.2(在1cm比色皿中)。試驗該溶膠對Na+離子絮凝的穩(wěn)定性。向1ml溶膠中加入0.1ml10％NaCl，在加入鹽后的3和10分鐘時監(jiān)測從400到750nm的吸光率光譜。在這些條件下溶膠保留在λmax下的100％的吸光率。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心未結合的抗地谷新F(ab′)2。吸出并棄去上清，各沉淀重懸于20ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化鈉pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃貯存。在562nm下觀察金溶膠的λmax，光密度為57.2(在1cm比色皿中)。b)地谷新測定方案制備測定緩沖液使測定混合物含終濃度為50mM的甘氨酸、pH9.0，110mM碘化鉀，0.2％卵清蛋白，0.07％rgG，6.3％甘露糖，0.6％L-亮氨酸和0.3％Di-Pac(97％蔗糖)。向各小杯(1＝0.5cm)中加入溶于測定緩沖液的地谷新rgG金溶膠，接著加入溶于測定緩沖液的抗-地谷新F(ab′)2金溶膠，隨后加入含地谷新的樣品(校準品，對照或未知樣)。最終測定體積為300μl，樣品體積為20μl。調節(jié)該測定中各溶膠的濃度使起始雙色吸光率不超過2.0，2種溶膠的比例給出了最適校準曲線反應性。以0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0ng/ml(0至5.1nm)將地谷新加入人血清中制備校準品。以10分鐘的時間間隔取雙色(450/575nm)吸光率讀數(shù)以得到吸光率減少作為地谷新濃度的函數(shù)。校準曲線的測定結果在表5中提供。測定反應性是雙色吸光率×10,000。表5圖5顯示了從這些獲得的地谷新測定的校準曲線圖。將未知樣品的吸光率與該校準曲線進行比較以測定樣品中地谷新的濃度。實施例IV-苯巴比妥的測量a)試劑的制備1.苯巴比妥-rgG連接物的制備將苯巴雙妥戊酸(13.8mg，0.042mmol)加入到0.7mlN，N-二甲基甲酰胺(用4A型分子篩干燥)中。用干燥管(氯化鈣)套住攪拌的反應器并在冰/水浴中冷卻。加入三乙胺(8.7μl，0.062mmol)并攪拌10分鐘。加入氯甲酸異丁酯(8.1μl，0.062mmol)，反應混合物在冰/水浴中冷凍攪拌30分鐘。在加入的幾分鐘內觀察沉淀。反應的結果產(chǎn)生混合的苯巴比妥戊酸的酸酐。將兔γ-球蛋白(rgG，CohnFractionII，III，Sigma化學公司)的緩沖液換為(Amicon，YM-10)0.1MK2CO3，pH9.0，蛋白質濃度調成10.0mg/ml并在冰/水浴中冷卻?；旌系谋桨捅韧孜焖狒?2.0×10-3mmol)以4個相等的等分試樣加入到rgG(30mg，2.0×10-4mmol)中并在冰/水浴中攪拌2小時。將混合物上樣到脫鹽柱(PharmaciaPD-10)上并用25mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.4洗脫，合并含蛋白質的餾分并經(jīng)0.2微米過濾。經(jīng)過用0.1MK2CO3，pH9.0超濾(Amicon，YM-10膜)繼續(xù)去掉未結合的苯巴比妥戊酸并以流出物的A248不超過0.015判斷為完全去掉。使用以rgG作內部標準的BSA校準品經(jīng)蛋白質測定(BCA，Pierce)確定苯巴比妥-rgG連接物的蛋白質濃度。產(chǎn)品在2-8℃貯存。2.苯巴比妥-rgG金溶膠的制備所有的操作使用塑料制品進行。向900ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol，10ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-3mol，20ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(300μl)，并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5。用純水將苯巴比妥-rgG(5.0mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌15分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終濃度為0.1％，且混合物在室溫下攪拌過夜。試驗溶膠對Na+離子絮凝的穩(wěn)定性。向1ml溶膠中加入0.1ml10％NaCl，在加鹽后的3和10分鐘監(jiān)測從400至750nm吸光率光譜。在這些條件下溶膠保留在λmax下其吸光率的95％以上。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的苯巴比妥-rgG連接物。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5中。接著在2000xg下離心15分鐘，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中，并在2-8℃下貯存。在580nm下觀察金溶膠的λmax，光密度為60.1(在1cm比色皿中)。3.抗苯巴比妥IgG金溶膠的制備所有操作使用塑料制品進行。向180ml純水中加入HAuCl4三水合物(1.02×10-4mol，2ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(5.76×10-4mol，4ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(60μl)并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5。用純水將抗-苯巴比妥IgG(OEMConceptsInc.，0.4mg)稀釋成18ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌15分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終濃度為0.1％，混合物在室溫下攪拌過夜。試驗了溶膠對Na+離子絮凝的穩(wěn)定性。向1ml溶膠中加入0.1ml10％NaCl，在加入鹽后的3和10分鐘監(jiān)測從400到750nm的吸光率光譜。在這些條件下溶膠保留其λmax下吸光率的95％以上。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的抗苯巴比妥IgG。吸出并棄去上清，將沉淀分別重懸于20ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化鈉，pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。溶膠以最小體積重懸于相同緩沖液中并在2-8℃下貯存。在584nm下觀察金溶膠的λmax，光密度為76.1(在1cm比色皿中)。b)苯巴比妥測定的方案該方案與用于總T4測定的方案相同，除了1)測定緩沖液不含8-苯胺-1-萘磺酸；和2)苯巴比妥校準品為0、5、10、20、40和60μg/ml(0至260μM)。校準曲線的測定結果在表6中提供。圖6顯示了從這些結果獲得的苯巴比妥測定的校準曲線圖。將未知樣品的吸光率與這一校準曲線進行比較以測定樣品中苯巴比妥的濃度。實施例VAtrazine的測量a)試劑的制備1.Atrazine-rgG連接物的制備經(jīng)過使用Atrazine(2-氯-4-乙胺-6-異丙胺-s-三嗪)的氨基與rgG的羧酸基之間的常規(guī)碳二亞胺反應實現(xiàn)該連接。將兔γ-球蛋白(CohnFractionII，III，Sigma化學公司)溶于PBS中。用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)，接著進行0.2微米過濾，將rgG濃度調成10mg/ml。在0.11mgN-羥基琥珀亞胺和0.19mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)存在下將Atrazine(14.3μl10mg/mlatrazine溶于DMF中)加入1mlrgG中。用稀HCl將混合物調成pH5.5并在室溫下放干搖動混合器上過夜。經(jīng)過用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)去掉未結合的atrazine并以流出物的A254不超過0.015判斷為完全除去。使用以rgG作為內部標準的BSA校準品經(jīng)蛋白測定(BCA，Pierce)確定Atrazine-rgG連接物的蛋白質濃度。2.Atrazine-rgG金溶膠的制備所有的操作使用塑料制品進行。向900ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol，10ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-3mol，20ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(400μl)并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5至7.6。用純水將Atrazine-rgG(4.0mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌30分鐘。加入脫脂奶粉(Carnation)使奶粉終濃度為0.04％。在室溫下避光攪拌混合物過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的Atrazine-rgG連接物。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物pH7.5中。接著以2000xg離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，將溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃下貯存。測定金溶膠的λmax。3.抗-AtrazineIgG金溶膠的制備所有的操作使用塑料制品進行。向90ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol，1ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-4mol，2ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(40μl)且溶液充分攪拌5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5。用純水將atrazineIgG(Biodesign，Inc.，0.2mg)稀釋成9.0ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌60分鐘。加入脫脂奶粉(Carnation)使奶粉最終濃度為0.04％。室溫攪拌混合物過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的atrazine-rgG。吸出并棄去上清，各沉淀重懸于25ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物pH7.5中，接著以2000xg下離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃貯存。然后測定金溶膠的λmax。a)Atrazine測定的程序制備測定緩沖液使測定混合物含終濃度為50mM的甘氨酸、pH9.0，0.2％卵清蛋白，6.3％甘露糖，0.6％L-亮氨酸和0.3％Di-Pac(97％蔗糖)。測定緩沖液還含有選定濃度的離液劑，如碘化鉀。向各小杯(l＝0.5cm)中加入溶于測定緩沖液的atrazine-rgG金溶膠，接著加入溶于測定緩沖液的抗-atrazineIgG金溶膠，隨后加入含atrazine的樣品(校準品，對照或未知樣)。最終測定體積為300μl，樣品體積為3μl。調節(jié)該測定中各溶膠的濃度使起始雙色吸光率不超過2.0，2種溶膠的比例給出了最適校準曲線反應性。以0至1000ppb將atrazine加入測定緩沖液中制備校準品。在10分鐘內取雙色(450/575nm)吸光率讀數(shù)得到吸光率的減少作為atrazine濃度的函數(shù)。這些結果用于繪制校準曲線。將未知樣品的吸光率改變與該曲線進行比較以確定樣品中atrazine的濃度。實施例VI.同時測定苯巴比妥和Phenytoin通過使用對各分析物在不同波長下吸光的溶膠顆粒實現(xiàn)同時測定苯巴比妥和phenytoin。溶膠可以由不同的金屬(如金和銀或金與鐵)組成或是相同金屬的溶膠顆粒但具有不同的直徑使其視覺上或化學測量上可分辨或分析。a)試劑的制備1.用于苯巴比妥測定的金溶膠的制備用于苯巴比妥測定的金溶膠的制備按實施例IV.a所述進行。2.用于phenytoin測定的銀溶膠的制備所有操作使用塑料的容器，測量裝置和試管進行。通過使用銀溶膠實現(xiàn)phenytoin測定。例如，根據(jù)M.Moeremans等，分析生物化學，145315-321(1985)的方法制備在394nm具有最大吸光率的溶膠銀。3.制備phenytoin-rgG連接物經(jīng)過使用二苯基乙內酰脲-3-羧丙基-N-羥基琥珀亞胺酯(BoehringerMannheim)將phenytoin附著于載體蛋白，例如rgG上。兔γ-球蛋白(CohnFractionsII，III，Sigma化學公司)以20mg/ml的濃度溶于25mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.4(PBS)中。用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)，接著進行0.2微米過濾并將rgG濃度調成10mg/ml。二苯基乙內酰脲-3-羧丙基-N-羥基琥珀亞胺酯以19mg/ml溶于DMF中，并以4份相等的等分試樣加入rgG中使最終摩爾競爭比率為酯∶rgG為10∶1?；旌衔镌谑覝叵卤芄夥庞趽u動混合器上過夜。經(jīng)過用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)去掉未結合的phenytoin，當流出物的A248不超過0.015時判斷為完全除掉。使用以rgG作內部標準的BSA校準品經(jīng)蛋白質測定(BCA，pierce)確定phenytoin-rgG連接物的蛋白質濃度。4.Phenytoin-rgG銀溶膠的制備所有操作使用塑料制品進行。用0.2MK2CO3將銀溶膠(吸光率單位(“AU”)1.2，900ml)pH調成7.5。用純水將Phenytoin-rgG(8mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的銀溶膠，充分攪拌30分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終濃度為0.1％?；旌衔锏厥覝叵卤芄鈹嚢柽^夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的Pheneytoin-rgG連接物。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中，并在2-8℃貯存。然后測定銀溶膠的λmax。5.制備抗-PhenytoinIgG銀溶膠所有操作使用塑料制品進行。用0.2MK2CO3將銀溶膠(AU1.2，900ml)pH調成7.5。用純水將Phenytoin-rgG(2mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的銀溶膠，充分攪拌30分鐘。加入酪蛋白(鈉鹽，Sigma化學公司)使終濃度為0.1％。混合物地室溫下攪拌過夜。經(jīng)過在20到25℃下以2000xg離心15分鐘去掉未結合的抗Pheneytoin-rgG。吸出并棄去上清，將沉淀分別重懸于25ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物，pH7.5中，接著在2000xg下離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，將溶膠以最小體積重懸于相同緩沖液中，并在2-8℃下貯存。測定銀溶膠的λmax。b)苯巴比妥和Phenytoin測定的方案制備試驗緩沖液，使試驗混合物含有終濃度為50mM的甘氨酸，pH9.0，110mM碘化鉀。向各小杯(l＝0.5cm)中加入溶于測定緩沖液的苯巴比妥-rgG金溶膠，隨后加入溶于測定緩沖液的抗-苯巴比妥IgG金溶膠，溶于測定緩沖液中的phenytoin-rgG銀溶膠，接著加入溶于測定緩沖液中的抗phenytoinIgG銀溶膠，接著加入含苯巴比妥和phenytoin的樣品(校準品，對照或未知)。最終測定體積為300μl，調節(jié)樣品體積使產(chǎn)生最適校準曲線反應性調節(jié)測定中的各溶膠的濃度使起始雙色吸光率不超過2.0且兩種溶膠對的比例產(chǎn)生最適校準曲線反應性。以0、5、10、20、40和60μg/ml(0-260μM)將苯巴比妥稱重加入人血清中以及以0、2.5、5、10、20和40μg/ml(0至160μM)將phenytoin稱重加入人血清中制備校準品。苯巴比妥和Phenytoin的校準溶液可都在相同溶液中或在2個分開的溶液中。用同時能監(jiān)測多種波長的分光光度計在10分鐘內監(jiān)測575nm(苯巴比妥)下吸光率的改變和在394nm(Phenytoin)下吸光率的改變以得到吸光痃的減少作為苯巴比妥和phenytoin濃度的函數(shù)來實現(xiàn)兩種分析物的同時測定。這些結果用于繪制校準曲線。將未知樣品中吸光率的改變與該曲線進行比較以確定樣品中苯巴比妥和phenytoin的濃度?；瘜W測定(PartialLeastSquares或基本成份分析)用于補償重疊光譜改變的影響。實施例VIIMethamphetamine(d-N，α-dimethylphenethyamine)的兩性測量a)制備試劑1.Methamphetamine-rgG連接物的制備經(jīng)過使用methamphetamine(d-N，α-dimethylphenethyamine)上的氨基與rgG上的羧酸基團間的常規(guī)碳二亞胺反應實現(xiàn)連接。將兔γ-球蛋白(CohnFractionsII，III，Sigma化學公司)溶于PBS中。用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)，接著進行0.2微米過濾，將rgG濃度調成10mg/ml，在10mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)存在時將Methamphetamine(1ml，10mg/ml的DMF溶液)在室溫下放于搖動混合器上過夜。經(jīng)過用PBS超濾(Amicon，YM-10膜)去掉未結合的methamphetamine，當流出物在methamphetamine的λmax下紫外吸光率不超過0.015時判斷為完全去掉。經(jīng)過蛋白質測定(BCA，Pierce)，使用以rgG作內部校準的BSA校準器測定methamphetamine-rgG連接物的蛋白質濃度。2.制備methamphetamine-rgG金溶膠所有操作使用塑料制品進行。向900ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-4mol，10ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-3mol，20ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(400μl)并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5至7.6。用純水將Methamphetamine-rgG(4.0mg)稀釋成90ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌30分鐘。加入脫脂奶粉(Carnation)使奶粉終濃度為0.04％，在室溫下避光攪拌混合物過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉末結合的methamphetamine-rgG連接物。吸出并棄去上清，沉淀分別重懸于100ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物pH7.5中，接著以2000xg離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，溶膠重懸于最小體積的相同緩沖液中并在2-8℃貯存。測定金溶膠的λmax。3.抗Methamphetamine-rgG金溶膠的制備所有操作使用塑料制品進行。向90ml純水中加入HAuCl4三水合物(5.08×10-5mol，1ml2％的水溶液，Aldrich化學公司)并充分攪拌1分鐘。加入鹽酸羥胺(2.88×10-4mol，2ml10mg/ml的水溶液)并充分攪拌1分鐘。加入金粒(40μl)并充分攪拌溶液5分鐘。用0.2MK2CO3將pH調成7.5。用純水將抗-Methamphetamine-rgG(Biodesign，Inc.，0.2mg)稀釋成9.0ml，加入調節(jié)了pH的金溶膠，充分攪拌60分鐘。加入脫脂奶粉(Carnation)使奶粉終濃度為0.04％，混合物在室溫下攪拌過夜。經(jīng)過在20至25℃下以2000xg離心15分鐘去掉末結合的抗-methamphetamine-rgG。吸出并棄去上清，將沉淀分別重懸于25ml10mMHEPES，0.1％BSA，0.01％迭氮化物pH7.5中，接著以2000xg下離心15分鐘。按上面所述重復洗滌，溶膠以最小體積重懸于相同緩沖液中并在2-8℃貯存。然后測定金溶膠的λmax。b)Methamphetamine測定的方案測定1使兩種金溶膠(methamphetamine-rgG金溶膠和抗-methamphetamine金溶膠)在pH7.4，0.05M的磷酸緩沖液中達到平衡。選擇的抗體量超過1000ng/mlmethamphetamine的當量。methamphetamine的均相定性測定由離液劑(選定其濃度使減小非特異性溶膠相互作用)，過量的自由rgG(也選擇來防止樣品與methamphetamine-rgG溶膠間的非特異性反應)和反應的金溶膠組成。在合適的干凈容器中混合已知體積的尿樣(3μl)和測定試劑(300μl)時，如果在尿樣中存在超過1000ng/ml的藥物時，methamphetamine-rgG金溶膠和抗-methamphetamine金溶膠分散。在575nm下溶液的吸光率會增加，引起溶液變成品紅色且由此表明存在methamphetamine。測定2分別干燥溶膠(methamphetamine-rgG金溶膠和抗-methamphetamine金溶膠)，與緩沖劑，離液劑，和rgG一起干燥保存于干凈的塑料容器中。根據(jù)本領域已知的方法(如凍干)來干燥溶膠和其它成份。當已知體積的尿樣(3μl)和水(300μl)在試劑容器中混合時，如果在尿液中存在的藥物不超過1000ng/ml時，methamphetamine-rgG金溶膠和抗-methamphetamine金溶膠會聚集。在575nm下溶液的吸光率會減少，引起溶液變清，表明不存在methamphetamine。品紅顏色的保留將表明在尿樣液中存在超過1000ng/ml的藥物。本發(fā)明具體參考其優(yōu)選的實施方案進行了描述。然而，在本發(fā)明的實質和范圍內本領域的技術人員根據(jù)本說明書作出修改和改進將是可預料到的。權利要求1.一種檢測流體樣品中配體的存在或測定其量的方法，該方法包含(a)提供第一試劑，包含具有可檢測的物理特性且結合于(i)配體或配體類似物或(ii)能特異性地與配體偶聯(lián)的物質上的溶膠顆粒；(b)提供第二試劑，包含具有可檢測的物理特性且結合于能特異性地偶聯(lián)配體和/或配體類似物的物質上的溶膠顆粒；(c)混合第一試劑，第二試劑和流體樣品，作為樣品中配體存在的函數(shù)(function)，所說的第二試劑與第一試劑偶聯(lián)；以及(d)在反應期間或之后檢測或測定溶膠顆粒物理特性的改變，該檢測或測定與試劑的偶聯(lián)程度相關且提供了流體樣品中配體的定性或定量指標。2.權利要求1的方法，其中能特異地與配體偶聯(lián)的第一試劑和物質與能特異性地偶聯(lián)第二試劑的配體的物質可以相同或不同。3.權利要求1的方法，其中配體是一種抗原，能特異性地偶聯(lián)配體的物質是一種抗該抗原的抗體。4.權利要求1的方法，其中的溶膠顆粒包含一種金屬。5.權利要求4的方法，其中的金屬包含金、銀、銅、鐵或鋁。6.權利要求1的方法，其中的溶膠顆粒包含金。7.權利要求6的方法，其中的溶膠顆粒具有大約5nm到大約200nm范圍的顆粒大小。8.權利要求1的方法，其中的第一試劑，第二試劑和流體樣品在大約同時混合。9.權利要求1的方法，其中混合第一試劑和第二試劑，然后在預定的時間期間后加入樣品。10.權利要求1的方法，其中第一試劑和第二試劑均是干燥的且以干燥的形式混合并經(jīng)過加入流體樣品溶解。11.權利要求1的方法，其中物理特性是克分子吸光度，第一和第二試劑的溶膠顆粒在一個波長范圍內吸光且在該范圍內具有最大吸光率，其中物理特性的改變是溶膠吸光率光譜的改變。12.權利要求1的方法，其中第一和第二試劑的溶膠顆粒是結合于選自生色團和熒光團的可檢測分子上的多聚體。13.權利要求1的方法，其中配體包含T4，地谷新、苯巴比妥、atrazine或人絨膜促性腺激素。14.權利要求1的方法，其中的物理特性是散射光。15.權利要求14的方法，其中的檢測或測定包含比濁檢測。16.一種檢測流體樣品中配體存在的方法，包含(a)提供第一試劑，包含具有明顯可檢測的物理特性的結合于配體或配體類似物上的溶膠顆粒；(b)提供第二試劑，包含具有明顯可檢測的物理特性且結合于能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上的溶膠顆粒；(c)在溶液中混合第一和第二試劑使第一和第二試劑偶聯(lián)，這使得與混合前的第一和第二試劑相比溶液產(chǎn)生不同的明顯可檢測的物理特性；(d)加入樣品；(e)觀察溶液的物理特性；(f)將物理特性與樣品中配體的存在與否相關聯(lián)。17.權利要求16的方法，其中能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質的量是當樣品中配體的低于閾值量時，配體被溶膠吸附而不破壞聚聚集，當配體高于閾值量時，配體破壞聚集，在溶液的物理特性上產(chǎn)生明顯的改變。18.權利要求17的方法，其中的配體是濫用的藥品。19.權利要求18的方法，其中的配體選自ampheramine、大麻麥、可卡因、鴉片制劑和phencyclidine。20.一種檢測流體樣品中配體的存在或測定其量的試劑盒，包含(a)第一試劑，包含具有明顯可檢測的物理特性且結合于(i)配體或配體類似物或(ii)能特異性地與配體偶聯(lián)的物質上的溶膠顆粒；(b)第二試劑，包含具有明顯可檢測的物理特性且結合于能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上的溶膠顆粒，作為樣品中配體存在的函數(shù)，所說的第二試劑與第一試劑偶聯(lián)從而產(chǎn)生物理特性的變化，該變化與該試劑的偶聯(lián)程度相關。21.權利要求20的試劑盒，其中能特異性地與配體偶聯(lián)的第一試劑的物質與能特異性地偶聯(lián)配體的第二試劑的物質可以相同或不同。22.權利要求20的試劑盒，其中的溶膠顆粒包含一種金屬。23.權利要求22的試劑盒，其中的金屬包含金、銀、銅、鐵或鋁。24.權利要求23的試劑盒，其中的溶膠顆粒具有從大約5nm到大約200nm范圍的顆粒大小。25.權利要求20的試劑盒，其中物理特性是克分子的吸光度，第一和第二試劑的溶膠顆粒在一定的波長范圍內吸光且在該范圍具有最大吸光率。26.權利要求25的試劑盒，其中的檢測或測定包含使用溶膠顆粒最大吸光率處的波長測量反應的吸光率。27.一種具有可檢測的物理特性的免疫學復合物，包含(a)具有可檢測的物理特性且結合于(i)配體或(ii)能特異性地偶聯(lián)配體的物質上的第一溶膠顆粒；和(b)具有可檢測的物理特性且結合于能特異性地偶聯(lián)配體的物質上的第二溶膠顆粒，其中物理特性的性質根據(jù)第一和第二溶膠顆粒的偶聯(lián)而改變。28.權利要求27的免疫學復合物，其中能特異性地與第一試劑的配體偶聯(lián)的物質與能特異性地偶聯(lián)第二試劑的配體的物質可以相同或不同。29.權利要求27的免疫學復合物，其中的溶膠顆粒包含一種金屬。30.權利要求29的免疫學復合物，其中的金屬包含金、銀、銅、鐵或鋁。31.權利要求29的免疫學復合物，其中的溶膠顆粒具有從大約5nm到大約200nm范圍的顆粒大小。32.權利要求31的免疫學復合物，其中的物理特性是克分子吸光度。33.權利要求32的免疫學復合物，其中的配體是T4、地谷新、苯巴比妥、人絨膜促性腺激素或atrazine。34.一種檢測流體樣品中多種配體的存在或測定其量的方法，其中該方法包括(a)提供針對所說的多種配體中每一種的第一試劑，包含結合于(i)該配體或配體類似物或(ii)能特異性地偶聯(lián)該配體的物質上的溶膠顆粒；(b)提供針對所說的多種配體中每一種的第一試劑，包含結合于能特異性地偶聯(lián)配體或配體類似物的物質上的溶膠顆粒，相應于各種所說的配體的第一和第二試劑的溶膠顆粒具有專一的可檢測的物理特性，它與相應于其它配體的溶膠顆粒的物理特性能區(qū)分開；(c)混合該試劑與流體樣品，作為樣品中多種配體存在的的函數(shù)，所說的試劑互相偶聯(lián)，從而產(chǎn)生物理特性的改變，該改變與試劑的偶聯(lián)程度相關；且(d)在反應期間或之后檢測或測定溶膠顆粒的物理特性，該檢測或測定提供了流體樣品中多種配體的定性或定量指標。35.權利要求34的方法，其中的能特異性地偶聯(lián)第一試劑的配體的物質與能特異性地偶聯(lián)第二試劑的配體的物質可以相同或不同。36.權利要求34的方法，其中的相應于多種配體中每一種的溶膠顆粒包含一種金屬。37.權利要求36的方法，其中的金屬包含金、銀、銅、鐵或鋁。38.權利要求36的方法，其中的物理特性是克分子吸光度且其中相應于多種配體中每一種的溶膠顆粒是具有不同克分子的吸光度的不同金屬。39.權利要求36的方法，其中的物理特性是克分子吸光度，且其中相應于多種配體中每一種的溶膠顆粒是不同大小且具有不同克分子吸光度的相同金屬的溶膠顆粒。40.權利要求38的方法，其中的多種配體包含苯巴比妥和phenytoin。41.一種制備結合于配體或配體類似物上的溶膠顆粒試劑的方法，包含將配體連接到選自第一蛋白質，樹狀體或第一多聚體的載體分子上形成配體連接物；將配體連接物結合到溶膠顆粒上形成配體結合的溶膠；且用選自第二蛋白質，去污劑或第二多聚體的封閉劑穩(wěn)定配體結合的溶膠顆粒。42.根據(jù)權利要求41的方法，其中的第一蛋白質包含免γ球蛋白。43.根據(jù)權利要求42的方法，其中的封閉劑選自脫脂奶粉或酪蛋白。44.根據(jù)權利要求43的方法，其中的封閉劑是酪蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了用于檢測流體樣品中配體的存在或測定其量的方法。該方法包含提供第一試劑,包含具有可檢測的物理特性且結合于配體或配體類似物(以競爭性形式)或能特異性地偶聯(lián)配體的物質(以夾層形式)上的溶膠顆粒,提供第二試劑,包含具有可檢測的物理特性的包括結合于能特異性地與配體和/或配體類(如果存在的話)偶聯(lián)的物質上的溶膠顆粒,混合第一試劑,第二試劑和流體樣品并在反應之前,期間或之后檢測溶膠顆粒物理特性的改變,它提供了流體樣品中配體的定性或定量指標。作為樣品中配體的函數(shù),試劑互相偶聯(lián),從而產(chǎn)生溶膠顆粒物理特性的改變,該改變與試劑的偶聯(lián)程度相關。本發(fā)明還提供了用于檢測流體樣品中配體的存在或測定其量的試劑盒。本發(fā)明進一步提供了具有可檢測的物理特性的免疫學復合物。文檔編號G01N33/94GK1178580SQ9719005公開日1998年4月8日申請日期1997年1月30日優(yōu)先權日1997年1月30日發(fā)明者T·J·胡恩特爾,E·H·法登豪爾申請人:達德國際有限公司