專利名稱：一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種直接檢測乙型肝炎病毒核心抗原的體外診斷試劑。
乙型肝炎病毒(HBV)顆粒，又稱Dane顆粒，乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)存在于Dane顆粒的核心和乙型肝炎患者的肝細胞核內(nèi)，是乙型肝炎病毒直接復制指標。由于血清內(nèi)極少有游離核心抗原，故用常規(guī)方法不能檢出。有關核心抗原的檢測，從70年代以來國內(nèi)外學者就進行了研究和報道。1975年Kaplan和Jan，Desmyter報道，供血者一受血者臨床和血清學的反應中有HBcAg檢測一項，方法是用Parcell等用的RIA。1976年，Takahashi用IAHA法檢測血清中HBcAg。1977年Howard Zuckerman Roberts報道用離心沉淀法和NP-40及二巰基乙醇檢測HBcAg用RIA。在國內(nèi)也曾報道過以下幾種方法，一種是固相放射免疫法(RIA)，1986年劉錫光等在病毒性肝炎實驗診斷專著中詳細介紹了血清中HBcAg的檢測方法，采用抗原抗體復合物的原理，在待檢標本內(nèi)加入過量的抗-HBs，和適量的NP-40脫蛋白外殼，然后采用固相放射免疫法檢測血清HBcAg。該法特異性好，敏感度高，但需r射線測定儀等設備條件；另一種試管法，1986年黃華芳等在病毒學雜志中關于RIA法及ELISA法檢測血清中HBcAg的報道，在試管中利用抗-HBs與樣品中的HBsAg(即Dane顆粒)形成HBsAg，抗-HBs復合物，然后將此免疫復合物多次離心沉淀，洗凈沉淀物中之抗-HBc，再加NP-40，使Dane顆粒脫殼裂解，釋放出HBcAg。用抗-HBc包被聚苯乙烯酶標板，將裂解物加入酶標板后，加入酶標記抗-HBc，即可檢測樣品中的HBcAg，此方法操作程序繁瑣，流程長，反復離心沉淀，易丟失被檢成份而致假陰性；再一種是斑點ELISA法，1989年，喻植群等在上海免疫學雜志上報道用斑點ELISA檢測血清HBcAg，其方法是在樣品中加入抗-HBs處理后，通過抽濾反應物(Dane顆粒，抗-HBs結合物)至NC(硝酸纖維膜)上，干燥過液后，用硫氰化鈉裂解HBV殼蛋白，暴露HBcAg后再與酶標記抗-HBc反應，即可檢測樣品中HBcAg，此方法陽性檢出率較試管的方法高，但樣品用量大，操作流程也較長，不適于大批量標本檢測。
本發(fā)明的目的是提供了一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，利用雙抗體同時包被于微孔板和固相化孔內(nèi)裂解乙型肝炎病毒Dane顆粒，操作程序簡便快速，結果易判。
為達到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術方案一是采用抗原抗體復合物的形成及乙肝病毒抗原至少有兩個能與抗體結合的位點，將抗-HBs、抗-HBc同時包被于固相載體上，當加入樣品時，樣品中的HBsAg(即Dane顆粒)與載體上的抗-HBs形成固相HBsAg，抗-HBs免疫復合物；二是固相裂解。固相化的免疫復合物的HBsAg若有Dane顆粒，在微孔板內(nèi)經(jīng)裂解劑進行固相裂解HBVDane顆粒殼蛋白，HBcAg即釋放入孔內(nèi)，并與原來固相于孔內(nèi)的抗-HBc結合，形成固相HBcAg，抗-HBc免疫復合物，該復合物的HBcAg可與加入的抗-HBc酶標記物結合形成雙抗體夾心；三是采用促進劑。使用促進劑其目的是為了促使形成更多的固相化的HBsAg。抗-HBs免疫復合物，當固相孔內(nèi)裂解后，HBcAg的釋放量增多，從而提高了檢測HBcAg的靈敏度。其特征采用12孔聚苯乙稀酶標板條、將抗-HBs、抗-HBc同時包被于固相載體上、HRP-抗-HBc、MC-抗-HBc、MC-抗-HBs裂解劑即NP-40、硫基乙醇、Tris緩沖液、促進劑即PEG，按常規(guī)方法操作。包被物抗-HBs?？?HBc包被于12孔聚苯乙烯酶標板條，主要使加入的樣品中的HBsAg(即Dane顆粒)形成固相的抗-HBs、HBsAg復合物，加入促進劑后使固相化的抗原抗體免疫復合物形成更多，加入裂解劑進行孔內(nèi)固相裂解，使HBcAg游離，再次與固相于孔內(nèi)的抗-HBc結合，形成固相的抗-HBc.HBcAg免疫復合物，加入酶標記抗-HBc形成雙抗體夾心，進行檢測HBcAg。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點筒化了檢測血清HBcAg的操作程序，特異性好，與HBV-DNA探針陽性符合率為91.4％，不須特殊儀器設備，直接在微孔板內(nèi)檢測，操作簡便快速，反應模式清晰，結果易判。且與乙肝“二對半”同步檢測，完善了ELISA法檢測血清乙型肝炎病毒三系標志?；颊哐鍍?nèi)如有HBVDane顆粒，經(jīng)裂解劑裂解后，檢測HBcAg陽性，即表示HBV在體內(nèi)復制，具有極強的傳染性，HBcAg檢測可作為疾病傳染性和乙肝活動性病變的標志，作為抗病毒及免疫治療的有效指標。該發(fā)明適用于臨床和基層醫(yī)院。
實施例(按以下方法和步聚)1、包被緩沖液無水Na2co31.6gNaHco32.9gNaN30.2gH2O至 1000ml；2、包被雙抗體將抗-HBs、抗-HBc同時包被于固相載體上；3、HRP-抗HBc稀釋液NaCl 8gKH2PO40.2g無水 Na2HPO41.14gKCl 0.2gNaN30.2g正常人血清10-100mlH2O至1000ml；4、底物緩沖液ANa2HPO47.3g檸檬酸5.1g30％H2O21.0ml無水乙醇 30mlH2O至1000ml；5、底物緩沖液BTMB 1.0g無水乙醇 1000ml無H2O2底物緩沖液A 2000ml；6、終止液 2molH2SO4溶液；7、12孔聚苯乙烯酶標板條；8、MC-抗-HBc工作濃度1∶300-3000；9、MC-抗-HBs工作濃度1∶200-1000；10、HEP-抗-HBc工作濃度 1∶300-1500；11、促進劑PEG 0.05-1.5％；12、裂解劑NP-40 1-9％巰基乙醇 0.05-1.5％
Tris緩沖液0.05-1.0MPH 7.5；13、陽性參考血清；14、陰性參考血清；15、洗滌液 25％吐溫-20 1.0m臨用前洗入500ml 0.85-0.9％生理鹽水內(nèi)。
權利要求
1.一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是A、12孔聚苯乙烯酶標板條；B、將抗-HBs、抗-HBc同時包被于固相載體上；C、HRP-抗-HBc；D、MC-抗-HBcE、MC-抗-HBs；F、裂解劑為NP-40、巰基乙醇、Tris緩沖液；G、促進劑為PEG。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是HRP-抗-HBc工作濃度為1∶300-1500。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是MC-抗-HBc工作濃度為1∶300-3000。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是MC-抗-HBs工作濃度為1∶200-1000。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是PEG為0.05-1.5％。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑，其特征是NP-40 1-9％巰基乙醇 0.05-1.5％Tris緩沖液0.05-1.0M PH7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直接檢測血清乙肝病毒核心抗原試劑,采用抗原抗體復合物進行雙抗體包被、固相裂解和使用促進劑,其特征在于采用12孔聚苯乙烯酶標板條、將抗－HBs、抗－HBc同時包被于固相載體上、HRP－抗－HBc、MC－抗HBc、MC－抗－HBs、裂解劑為NP－40、巰基乙醇、Tris緩沖液、促進劑為PEG,按常規(guī)方法操作。本發(fā)明操作簡便快速,反應模式清晰,結果易判,適用于臨床和基層醫(yī)院。
文檔編號G01N33/576GK1197927SQ97109090
公開日1998年11月4日 申請日期1997年4月25日 優(yōu)先權日1997年4月25日
發(fā)明者胡蔡香 申請人:武漢市第七醫(yī)院