專利名稱：網(wǎng)織紅細胞的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對血樣中的網(wǎng)織紅細胞進行檢測與計數(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及一種染料，這種染料適合于對核糖核酸(RNA)和核糖核酸聚合物染色，并且特別適合于用熒光流式細胞計量技術(shù)檢測網(wǎng)織紅細胞。
網(wǎng)織紅細胞是已經(jīng)失去了核的未成熟紅細胞。已知網(wǎng)織紅細胞中含有RNA，對血樣中網(wǎng)織紅細胞進行檢測與計數(shù)對臨床醫(yī)師是有價值的。血樣中網(wǎng)織紅細胞的個數(shù)被用作急性出血、溶血性盆血和骨髓移植中紅細胞生成活性、診斷及預(yù)測值的指示，以及對鐵、維生素B12和葉酸療法的反應(yīng)的一種量度。本領(lǐng)域中眾所周知，網(wǎng)織紅細胞是成熟紅細胞的前體，因此網(wǎng)織紅細胞這一術(shù)語包含了細胞的演化和發(fā)展過程，在此過程中產(chǎn)生了成熟的紅細胞。
過去，血樣中網(wǎng)織紅細胞是通過人工和自動方法采用適當?shù)娜旧珓┤缧聛喖姿{(NMB)、亮甲酚藍(BCB)、吖啶橙、哌洛寧Y以及噻唑橙來測定的。
用新亞甲藍這種染料進行的活體染色被認為是確定網(wǎng)織紅細胞的參考方法，在使用這種染料時沉淀出RNA。這種方法是人工的，需要在顯微鏡下統(tǒng)計大量的細胞數(shù)目(例如500到1,000)，而且緩慢、繁瑣且有統(tǒng)計誤差。新亞甲藍是無熒光的，而且真正沉淀的RNA經(jīng)常難于與沉淀的染色劑區(qū)分開。
吖啶橙在用人工及自動方法對網(wǎng)織紅細胞進行染色時已有所應(yīng)用。吖啶橙能沉淀RNA；這就由于潛在的猝滅而阻礙了對RNA含量的定量測定。此外，吖啶橙不會導(dǎo)致被染色細胞的擴散熒光分布。細胞的年齡分布(依據(jù)與熒光成正比的RNA含量)就是不可靠的。吖啶橙對流式細胞儀中的塑料管有很大的親和力，這將導(dǎo)致背景增加，并且延長從流式細胞儀管道清除染料的過程。此外，用吖啶橙染色的細胞也難于同自發(fā)熒光的紅細胞峰分開，所獲得的網(wǎng)織紅細胞個數(shù)通常要低于用新亞甲藍獲得的值。
使用派洛寧Y需要先用福爾馬林固定紅細胞；這很不方便而且費時，并且結(jié)果一般都不好。而且，派洛寧Y的量子效率非常低，導(dǎo)致熒光信號也非常弱。
使用噻唑橙來檢測網(wǎng)織紅細胞的一個例子可見于1989年11月28日公布的美國專利No.4,883,867，它是在1985年11月1日申請的申請序號為No.793，813的部分繼續(xù)申請，現(xiàn)已放棄。
使用硫黃素T來檢測網(wǎng)織紅細胞的例子可見于1986年2月18日公布的美國專利No.4,571,388。
Shapiro，Howard M.，Practical Flow Cytometry，P.144，AlanR.Liss，Inc.1985，在表7-3列出了用于對DNA和/或RNA染色的三環(huán)雜芳族化合物。同時表7-3列出了coriphosphine O(CPO)，但它并未將CPO作為一種網(wǎng)織紅細胞或RNA的染色劑。
本發(fā)明提供一種染料和摻有該種染料的試劑，以定量測定全血中的網(wǎng)織紅細胞。
本發(fā)明提供了一種定量測定網(wǎng)織紅細胞的方法，其中的染料為coriphosphine O。
本發(fā)明還提供一種檢測網(wǎng)織紅細胞的方法，包括用coriphosphine O對樣品染色；用激發(fā)波長的光激發(fā)樣品；測量由上述樣品中發(fā)出的熒光。
還提供一種檢測網(wǎng)織紅細胞的方法，其中樣品受到激發(fā)，并且熒光是通過流式細胞儀來測量的。
本發(fā)明還提供一種對細胞分類染色的方法，使得受血小板、有核紅細胞和Howell-Jolly Bodies的干擾較小。
本發(fā)明提供一種對細胞染色的方法，該方法產(chǎn)生一種RNA-染料復(fù)合物，它比其它已知的方法產(chǎn)生的復(fù)合物更為穩(wěn)定，持續(xù)時間較長，使得由RNA-染料復(fù)合物產(chǎn)生的全部顏色都能被看清。


圖1所示是可用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的流式細胞儀光學(xué)系統(tǒng)的示意圖。
圖2所示是來自一個正常供體的流式細胞計量直方圖的實例；
圖3所示是一種來自異常(高)病人的流式細胞計量直方圖的實例；圖4所示是RNA和coriphosphine O試劑的劑量/響應(yīng)曲線；圖5所示是本發(fā)明的CPO方法與噻唑橙方法的相互關(guān)系；圖6所示是CPO的穩(wěn)定性；圖7給出了紅細胞和血小板的分析情況；圖8給出了紅細胞和白細胞的分析情況。
為方便起見，本發(fā)明用于對網(wǎng)織紅細胞染色的染料被稱作coriphosphine O(CPO)，也稱為堿性黃7號。coriphosphine O可以購自pfaltz & Bauer，Inc.Division of Aceto Corporation，Waterbury，Connecticut.
申請人已發(fā)現(xiàn)coriphosphine O是一種用來對網(wǎng)織紅細胞染色的有效染料。網(wǎng)織紅細胞染色的作用是為了在流式細胞儀中進行光散射計數(shù)而進一步顯示出網(wǎng)織紅細胞的輪廓。這樣，通過使用coriphosphine O作為染色劑就能夠?qū)θ獦悠分械木W(wǎng)織紅細胞進行檢測和計數(shù)。coriphosphine O是一種熒光染料，它不會沉淀出網(wǎng)織紅細胞的胞內(nèi)核糖核酸。
coriphosphine O的使用提供了對細胞分類染色的優(yōu)點，減少了受血小板、有核紅細胞和Howell-Jolly Bodies的影響。coriphosphine O還提供了增加RNA-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的優(yōu)點，從而增加了持續(xù)時間，人們就能觀察到由RNA-染料復(fù)合物產(chǎn)生的全部顏色。所產(chǎn)生顏色的穩(wěn)定時間較之其它技術(shù)所用染色劑產(chǎn)生顏色的穩(wěn)定時間要長得多，例如使用噻唑橙產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定時間約為2小時，而使用coriphosphine O產(chǎn)生的顏色的穩(wěn)定時間約為8到24小時。
根據(jù)本發(fā)明，當對血樣中的網(wǎng)織紅細胞染色時，coriphosphine O優(yōu)選以水溶液形式使用，優(yōu)選在一種等滲鹽溶液中，最優(yōu)選在ISOTONRII，美國專利No.3,962,125，Coulter公司，Miami，F(xiàn)lorida，CPO濃度大約為0.8到80mg/L，優(yōu)選為1-40，最優(yōu)選為5-10mg/L，該溶液可含有微量甲醇。血樣可以是全血或血組分，通過血樣與coriphosphineO溶液混合來用coriphosphine O溶液染色血樣。所用血樣及溶液的體積是保證RBC的濃度足以通過儀器。這樣該濃度范圍就在1∶50-1∶5000，優(yōu)選為1∶100-1∶1000，最優(yōu)選為1∶200-1∶800。然后樣品保溫最少約60秒至大約8小時，優(yōu)選為30分鐘，然后通過一個流式細胞儀。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CPO是一種活體染色劑，因此就不需要有固定措施。
當coriphosphine O從核糖核酸(RNA)上釋放出來時，發(fā)出很少的甚至不發(fā)出紅色熒光，并且在大約491.5nm處顯示一個強的吸收峰.當coriphosphine O與網(wǎng)織紅細胞中的RNA結(jié)合時，其光學(xué)屬性改變十分劇烈.具體說，當coriphosphine O與網(wǎng)織紅細胞中的RNA結(jié)合時，就顯示出很強的紅色熒光。激發(fā)的最大值大約在491.5nm，輻射最大值大約在630-700nm，得到大約160nm的斯托克斯漂移(Stokesshift)。由于結(jié)合的coriphosphine O的激發(fā)峰在大約490nm數(shù)量級，在使用自動流式細胞儀時光源可以是一個汞燈，其能量線在大約485nm，或是一個氬離子激光器，在大約488nm處有強輻射。盡管在其它波長可以形成激發(fā)，用coriphosphine O染色的網(wǎng)織紅細胞優(yōu)選為在大約450nm至大約500nm的波長范圍內(nèi)激發(fā)。
當coriphosphine O未與白細胞中的脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)合時產(chǎn)生很少甚至不產(chǎn)生綠色熒光，但coriphosphine O在與白細胞中的DNA結(jié)合時就會顯示強的綠色熒光。coriphosphine O染料在未與核酸結(jié)合時熒光的缺少提供了一個弱背景，并使操作者可以為自動流式細胞儀選擇一個熒光閾(或“門”)。
由于CPO在與RNA結(jié)合時發(fā)出紅色熒光而與DNA結(jié)合時發(fā)出綠色熒光，CPO的使用就提供了對細胞分類染色而受血小板、有核紅細胞、白細胞、以及Howell-Jolly Bodies干擾較小的優(yōu)點。這就使得人們能夠放入(gate-in)紅細胞而獲得更為精確的計數(shù)。
此外，當CPO結(jié)合時，綠色熒光的數(shù)量或強度根據(jù)CPO與“其它”結(jié)構(gòu)的結(jié)合情況而與背景的數(shù)量或非特異性的染色成比例。這些細胞結(jié)構(gòu)或單元包括DNA和亞細胞小泡，諸如溶酶體，核內(nèi)體以及顆粒體。這些單元各自與CPO有不同的結(jié)合，導(dǎo)致不同數(shù)量的熒光。但是，只有單鏈RNA與CPO結(jié)合并且只發(fā)出紅色熒光。我們將成熟紅細胞群所發(fā)出的綠色熒光的最大數(shù)量既作為紅細胞的“閾”又作為網(wǎng)織紅細胞的“閾”。所有其它細胞將發(fā)出超過這一閾值的綠色熒光。綠色熒光的強度不同提供了對細胞分類染色的優(yōu)點，使人們能放出(gate-out)非特定的細胞如血小板和白細胞。
coriphosphine O染色劑不沉淀RNA，并因此使coriphosphine O所染色的網(wǎng)織紅細胞維持一個相對均一的細胞內(nèi)RNA的分布，因此，在測得的個體網(wǎng)織紅細胞的熒光信號與網(wǎng)織紅細胞RNA含量之間有近乎線性的關(guān)系。這在臨床上就給醫(yī)生提供了除網(wǎng)織紅細胞個數(shù)以外的附加信息，因為RNA含量是網(wǎng)織紅細胞年齡的函數(shù)。因此，使用了coriphosphine O后，臨床醫(yī)師就能獲得網(wǎng)織細胞的年齡分布，以及簡單的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。
在使用coriphosphine O對血樣中網(wǎng)織紅細胞染色時，從染色的網(wǎng)織紅細胞發(fā)出的熒光信號與從成熟紅細胞發(fā)出的那些信號很好地分開，其結(jié)果可以在自動流式細胞儀上直接讀出而無需大量的數(shù)據(jù)計算。
用CPO染色的網(wǎng)織紅細胞、RNA或DNA盡管優(yōu)選是在一個自動流式細胞儀中計數(shù)，但也可以用人工方法或自動的顯微鏡來計數(shù)。
流式細胞計量技術(shù)的基本概念從本質(zhì)上說就是一次一個地將細胞通過特定的敏感區(qū)。通過流體動力聚焦，單個細胞通過敏感區(qū)，該敏感區(qū)由一個聚焦的激光源及用來測量散射光和熒光的檢測系統(tǒng)組成。
自動流式細胞儀是本領(lǐng)域中熟知的，本發(fā)明并不限于使用任何特定的流式細胞儀。
本發(fā)明所用的流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)的一個具體實例將在下文中結(jié)合附圖1進行說明。圖1所示的光學(xué)系統(tǒng)用于為測量直角散射光、紅色熒光及綠色熒光而設(shè)計的流式細胞儀。由10指示的光學(xué)系統(tǒng)使用一個氬離子激光器12作為光源，在488nm波長操作，產(chǎn)生一個15mW的輸出。從激光器12發(fā)出的光由一個圓形透鏡16會聚，照射在以常規(guī)方式流經(jīng)流動池14的血樣上。
當樣品中被染色的紅細胞被激光照射時，它們產(chǎn)生散射光和熒光。直角散射光和熒光用一個聚焦透鏡18聚光，通過孔20落到分色鏡22上。分色鏡22反射直角散射光24并透過熒光26。由分色鏡22反射的直角散射光24在光電倍增管或光電二極管28中檢測。在通過分色鏡22的熒光26中，綠色熒光32由分色鏡30反射，紅色熒光38則透過那面鏡。反射的綠色熒光32通過一片濾色鏡34，在一個光電倍增管36中檢測。透過的紅色熒光38通過一個濾色鏡40并在光電倍增管42中檢測。
這樣舉個例子，用coriphosphine O染色的網(wǎng)織紅細胞就可以在Florida州Miami的Coulter公司所售之COULTERRXL流式細胞儀中檢測和計數(shù)。在使用這些自動流式細胞儀時，利用樣品中的成熟紅細胞的位置設(shè)置熒光門，這樣就設(shè)置了熒光門來統(tǒng)計網(wǎng)織紅細胞的數(shù)目。
使用自動流式計數(shù)器對用coriphosphine O染色的網(wǎng)織紅細胞進行檢測和計數(shù)所得到的結(jié)果與用一種已知的統(tǒng)計網(wǎng)織紅細胞數(shù)目的標準方法得到的結(jié)果有密切關(guān)系，標準方法使用的是亞甲藍或吖啶橙或噻唑橙。
在自動流式細胞儀中使用由coriphosphine O染色的網(wǎng)織紅細胞特別有利之處在于，熒光背景弱而熒光門可以很容易地選擇。而且沒有胞內(nèi)網(wǎng)織紅細胞RNA沉淀，因而無需固定細胞。此外，在個體網(wǎng)織紅細胞的熒光信號之間有一種線性關(guān)系，提供了網(wǎng)織紅細胞年齡的有關(guān)信息。
盡管用coriphosphine O染色的網(wǎng)織紅細胞優(yōu)選是在自動流式細胞儀中計數(shù)的，但也可以由人工方法或自動的顯微鏡來計數(shù)。
因此，主題方法包括如下步驟(a)將待測血樣與包括主題衍生物染料成分在內(nèi)的主題試劑組合物混合，形成細胞懸浮液；(b)將上述細胞懸浮液在不低于2℃不高于25℃的溫度下保溫不少于一分鐘但不超過24小時；(c)在流式細胞儀中測量得到的細胞熒光；(d)繪出經(jīng)光散射進入的紅色熒光與綠色熒光的相關(guān)數(shù)據(jù)直方圖(LFS對SS)；(e)選擇網(wǎng)織紅細胞群的熒光閾；并且(f)以網(wǎng)織紅細胞百分比×RBC總數(shù)(以十億/ml表示的RBC總數(shù))的形式計算網(wǎng)織紅細胞總數(shù)，其中RBC總數(shù)是從象COULTER STKS(Coulter Corportion，Miami，F(xiàn)lorida)這樣的血液學(xué)分析儀得到的。
下面的非限定性實施例說明本發(fā)明的各種特征。下面染色的例子用以獲得圖4-8所描繪的結(jié)果。實施例1樣品收集到三磷酸鹽EDTA(K3EDTA)中。將0.002mL患者全血樣品加入1.0mL的試劑中。混合樣品并在室溫下保溫至少15分鐘，但不超過8小時。然后樣品就在到一臺校準后的XL流式細胞儀上分析之前再次混合。
圖2-4表示用CPO對正常與異常血液進行網(wǎng)織紅細胞分析的數(shù)據(jù)。具體地說，圖2所示是一個正常人血液的熒光直方圖，顯示了用525nm光電倍增管和用630nm光電倍增管所檢測到的紅細胞分布情況。如圖2所示，區(qū)域E描繪出與白細胞和血小板分開的網(wǎng)織紅細胞。
圖3所示是一個異常血液的熒光直方圖，顯示了用525nm光電倍增管和用630nm光電倍增管檢測到的紅細胞分布情況。由圖3可見，在網(wǎng)織紅細胞區(qū)(區(qū)域E)中數(shù)目增加了。如圖3所示，CPO特異性地與RNA反應(yīng)，而樣品中RNA數(shù)量的增加導(dǎo)致熒光的增強。
圖4所示是一張試劑在與數(shù)量增加的核糖核酸(RNA)混合時的劑量響應(yīng)圖。RNA加入得越多，熒光強度就越大。
圖5所示是本發(fā)明的CPO方法與噻唑橙方法(參考方法)的相互關(guān)系。如圖5所示，CPO方法的結(jié)果與參考方法的結(jié)果是一樣的。這樣CPO就是衡量網(wǎng)織紅細胞的一種尺度。
圖6以時間對網(wǎng)織紅細胞百分比的函數(shù)繪出了CPO的穩(wěn)定性。圖6顯示，在將血液與試劑混合后，大約經(jīng)過15分鐘才建立起平衡。一旦平衡建立，CPO-RNA復(fù)合物維持至少8小時的穩(wěn)定狀態(tài)。而噻唑橙、吖啶橙和硫黃素T的穩(wěn)定時間低于2小時。
圖7給出了對紅細胞和血小板的分析。使用了血小板數(shù)目增加的樣品。對紅細胞和血小板的分析顯示，血小板分布與網(wǎng)織紅細胞分布是不同的。
圖8給出了對紅細胞和白細胞的分析。使用了白細胞數(shù)目增加的樣品。對紅細胞和白細胞的分析顯示，白細胞分布與紅細胞和網(wǎng)織紅細胞分布是不同的。
根據(jù)上面的教導(dǎo)可以對本發(fā)明做各種改動和變化，因此本發(fā)明也可以有除上述具體描述外的其它實施方式。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中網(wǎng)織紅細胞的方法，其特征在于網(wǎng)織紅細胞是通過用coriphosphine O染色；用激發(fā)波長的光激發(fā)上述樣品；以及測量由上述樣品發(fā)出的熒光來檢測的。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于樣品受到激發(fā)，而熒光是通過一臺流式細胞儀來測量的。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于樣品受到激發(fā)，而熒光是通過熒光顯微術(shù)來測量的。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于樣品是在流式細胞儀中用汞弧燈發(fā)出的光激發(fā)的。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于樣品是在流式細胞儀中用氬激光器發(fā)出的光激發(fā)的。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于網(wǎng)織紅細胞處于含有全血的樣品中。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于檢測網(wǎng)織紅細胞無需對其進行固定。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于細胞是分類染色的。
9.一種用于對定量用全血樣品中的網(wǎng)織紅細胞進行染色的試劑，該試劑的特征在于它包括一種coriphosphine O的水溶液和一種緩沖體系。
10.權(quán)利要求9的試劑，其特征還在于該緩沖體系的pH值為6.0-8.0。
11.一種產(chǎn)生穩(wěn)定的RNA-染料復(fù)合物的方法，其特征是將待測血樣與包含coriphosphine O水溶液的試劑混合，并使該懸浮液反應(yīng)足夠長的時間以便衍生物能被網(wǎng)織紅細胞有效地吸收。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征還在于RNA-染料復(fù)合物穩(wěn)定時間約為8到24小時。
13.一種用流式細胞計量術(shù)定量全血樣品中網(wǎng)織紅細胞的方法，其特征在于下列步驟(a)將待測血樣與含有coriphosphine O水溶液的試劑混合；(b)使該懸浮液反應(yīng)足夠長的時間，以便衍生物被網(wǎng)織紅細胞有效地吸收；(c)將懸浮液通過一個流式細胞儀；(d)測量經(jīng)光散射進入的紅細胞群的紅色熒光對綠色熒光的強度；以及(e)根據(jù)上述測量確定樣品中網(wǎng)織紅細胞的量或百分比。
全文摘要
一種用來測定血樣中網(wǎng)織紅細胞的方法，該方法包括用Coriphosphine O對網(wǎng)織紅細胞染色，該方法特別適合于用流式細胞計量術(shù)進行的檢測。在本方法中用到的流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)(10)包括一個氬離子激光器(12)，它作為照射流經(jīng)流動池(14)的血樣的光源。散射光和熒光落到一個用來反射直角散射光(24)并透過熒光(26)的分色鏡(22)上。分色鏡(30)用來反射綠色熒光(32)并透過紅色熒光(38)。
文檔編號G01N33/49GK1149337SQ95193233
公開日1997年5月7日 申請日期1995年5月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月23日
發(fā)明者M·L·沈金 申請人:科特公司