專利名稱：網織紅細胞模擬物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液質控物。更具體地講，本發(fā)明涉及網織紅細胞模擬物的制備方法， 由所述方法得到的網織紅細胞模擬物，以及包含所述網織紅細胞模擬物的全血質控物。
背景技術：
血液質控物是一種含有單一或多組分血細胞或血細胞模擬物的液體，具備如同血 液一樣的可檢測特性，用于日常監(jiān)控血液分析儀的準確性和精確性。網織紅細胞相關參數(shù)是中、高端血細胞分析儀所提供的一項重要信息。網織紅細 胞是剛脫去核尚殘留有少量RNA的未完全成熟的紅細胞。網織紅細胞的總數(shù)或百分比對貧 血的臨床診斷及療效觀察非常有價值。是血液學診斷常做的項目之一。使用質控物對網織 紅細胞的計數(shù)進行質量控制則是保證血細胞分析儀給出網織紅細胞準確計數(shù)信息的前提。美國專利5736402、5858789、5945340、6444471公開了一種包含網織紅細胞模擬 物的質控物制備方法，通過離心沉降等方式富集并純化豬血液中的網織紅細胞，采取成熟 停止(maturation-arrest)的方法對網織紅細胞進行保護，然后用特定的保存液對網織紅 細胞進行保存。但是，由于豬血液中網織紅細胞所占比例較低，使得采用該方法的原料處理 量很大；另外，由于白細胞與網織紅細胞具有近似的沉降性質，所以兩者很難通過離心等常 規(guī)手段分離，如果使用白細胞過濾器，由于網織紅細胞在細胞中的比例低，就要用到大量白 細胞過濾器，這會大大增加制備成本；再者，豬網織紅細胞體積明顯小于人網織紅細胞，仿 真性不高。美國專利7195919提出了一種模擬網織紅細胞質控物的方法，該方法主要是通過 核酸、肽核酸或粘多糖等生物高聚物與哺乳動物紅細胞表面相連接，從而使所連接的高聚 物結合染料，模擬網織紅細胞的儀器檢測形態(tài)。由于該方法的原理是在細胞表面連接核酸， 連接強度(特別是在長期的儲存期中)難以保證；并且需要對核酸進行活化，及對活化試劑 進行去除，操作步驟繁瑣不可控。美國專利6399388、6406915、5432089通過滲透壓的變化使紅細胞的胞膜膨脹，產 生小孔，然后將RNA等核酸物質或者所謂聚陰離子注入胞內，從而模擬網織紅細胞的形態(tài)。 其存在的問題是，由于有效注入核酸的細胞比例不高，導致網織紅細胞產率低，制備產物為 紅細胞與類網織紅細胞的混合物，且由于細胞經過了漲縮打孔，其膜強度降低，另外操作步 驟繁瑣，使得此方案難以用于質控物產品的生產。因此，本領域存在通過采用簡單、經濟的方法獲得網織紅細胞模擬物的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明一方面提供了一種制備網織紅細胞模擬物的方法，所述方法包含以下步 驟洗滌與分離抗凝含無核紅細胞的血液，得到純化的無核紅細胞；加入細胞處理液和固定劑，所述細胞處理液中含有蛋白質變性劑以及任選的滲入性試劑和/或表面活性劑，對所述無核紅細胞表面和/或胞內的物質進行處理和固定；對所得的產物進行洗滌。本發(fā)明另一方面提供了一種網織紅細胞模擬物，所述網織紅細胞模擬物通過上述 方法制備得到。本發(fā)明還一方面提供了 一種全血質控物，所述全血質控物包含本發(fā)明所提供的網 織紅細胞模擬物。再一方面涉及一種用于制備網織紅細胞模擬物的組合物，所述組合物包含細胞處 理液和固定劑，所述細胞處理液含有蛋白質變性劑以及任選的滲入性試劑和/或表面活性 劑。所述組合物可用于的制備網織紅細胞模擬物的方法。本發(fā)明所公開的方法采用無核細胞經試劑處理后模擬網織紅細胞，不必使用核酸 或類似生物多聚物，步驟簡單，成本低廉，可方便地實現(xiàn)血液質控物的工業(yè)化生產。


圖1顯示的是通過本發(fā)明說明書所公開的方法制備的網織紅細胞模擬物，在以核 酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測試圖片(僅提供網織紅細胞，簡稱RET通 道)，圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度，黑色散點表示的是網織紅細胞模 擬物。圖2顯示的是實施例1所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的全血質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀 上測試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖3顯示的是實施例2所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的全血質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀 上測試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖4顯示的是實施例3所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的全血質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀 上測試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖5顯示的是實施例4所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測 試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖6顯示的是實施例5所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測 試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖7顯示的是實施例6所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測 試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖8顯示的是實施例7所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比 例混合配制血液分析儀用的質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測 試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。圖9顯示的是實施例8所制備的網織紅細胞模擬物，與其他血液細胞模擬物按比
4例混合配制血液分析儀用的質控物，在以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀上測 試圖片(僅提供RET通道)。圖中橫軸表示熒光強度，縱軸表示前向散射光強度。
具體實施例方式本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點在閱讀以下描述和具體實施方案后將變得顯而易見。本發(fā)明一個實施方案提供了一種用無核紅細胞制備網織紅細胞模擬物的方法。所 述網織紅細胞模擬物采用人或動物的無核紅細胞，通過特定試劑對細胞表面及胞內物質的 處理和固定，使細胞能夠產生對核酸染料，特別是熒光檢測染料產生吸附作用，從而達到模 擬網織紅細胞的目的。所述制備方法包括以下步驟洗滌與分離抗凝含無核紅細胞的血液，得到純化的 無核紅細胞；加入細胞處理液和固定劑，所述細胞處理液中含有蛋白質變性劑以及任選的滲入 性試劑和/或表面活性劑，對所述無核紅細胞表面和/或胞內的物質進行處理和固定；對所得的產物進行洗滌。本發(fā)明一個實施方案通過離心或靜置等方式去除血液中的血漿及血小板等，并用 白細胞濾器或其他等同手段去除白細胞，得到純化的無核紅細胞。用于本發(fā)明實施方案中的血液可以選用任何含有無核細胞的人或動物血液，只要 和人紅細胞平均紅細胞體積(MCV)近似的動物的無核紅細胞都可以通過本方法制備網織 紅細胞模擬物。常用人或哺乳動物血液，使用新鮮血液制備的效果較好。然后往所得的經純化的無核紅細胞中加入包含蛋白質變性劑以及任選的滲入性 試劑和/或表面活性劑等的細胞處理液對細胞組分進行化學處理，并且加入適宜的固定 劑，使性質已發(fā)生變化的細胞的細胞膜進行固定，以增強其穩(wěn)定性。眾所周知，對于一些同時含有極性基團(親水性基團)和非極性基團(疏水性基 團)的大分子化合物(例如蛋白質分子)來說，在極性溶劑(例如水)中，其所攜帶的極性 基團(親水基團)露于分子空間結構的外部，而非極性基團(疏水基團)縮卷在分子空間 結構的內部。雖然不希望受理論約束，但是，用于本發(fā)明實施方案的蛋白質變性劑的作用是使 得紅細胞細胞膜或細胞內中所含的大分子化合物(如蛋白質分子)的空間結構發(fā)生變化， 使得原來位于分子結構內部的疏水基團外露，從而能夠與核酸染料，特別是熒光檢測染料 結合，達到模擬網織紅細胞的目的。因此，本領域技術人員可以理解，只要是能夠使蛋白質分子結構發(fā)生如上所述變 性作用的變性劑均能用作本發(fā)明實施方案的變性劑。例如，可用于本發(fā)明實施方案的變性 劑可為鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素或硫酸銨，也可以是所述試劑的任意組合。蛋白質變性劑在使用中的終濃度可為0.01-10% (w/v) 0例如，蛋白質變性劑可采 用終濃度為0. 05% -10% (w/v)的鹽酸胍、終濃度為0. 01% -5% (w/v)的異硫氰酸胍、終 濃度為0.01%-10% (w/v)的尿素或其任意組合。雖然不希望受理論約束，但是認為用于本發(fā)明實施方案的固定劑在固定細胞結構 的同時，也使發(fā)生結構變性的蛋白質分子空間結構穩(wěn)定，從而使得制得的網織紅細胞模擬 物在一定的時間范圍內保持穩(wěn)定，進行準確測試。
因此，本領域技術人員可以理解，常用的細胞固定劑均可用作本發(fā)明實施方案的 固定劑，例如丙酮、乙二醛、丙酮醛、丁二醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醛或乙醇，也可以是所述 試劑的任意組合。固定劑的使用濃度可由本領域技術人員根據具體的條件，例如試劑、作用時間等 來確定。例如，在使用中固定劑的終濃度可為0.005-8% (ν/ν)或0.005-5% (w/v) 0例 如，固定劑可為終濃度為0.005%-3% (ν/ν)的丙酮、終濃度為0.005%-2% (ν/ν)的冰 醋酸、終濃度為0.005%-3% (w/v)的苦味酸、終濃度為0.005%-5% (ν/ν)的乙二醛、 終濃度為0.01%-3% (ν/ν)的丙酮醛、終濃度為0.005%-5% (ν/ν)的丁二醛、終濃度 為0.005%-8% (ν/ν)的戊二醛、終濃度為0.005%-3% (w/v)的多聚甲醛、終濃度為 0.01% -5% (ν/ν)的甲醛、終濃度為0.005%-5% (ν/ν)的乙醇或其任意組合。固定劑的作用時間根據具體所用的固定劑以及固定劑濃度而變化，通?？蔀?-8 個小時。但是，本領域技術人員能夠理解，固定劑的作用濃度與時間相關，在較高的濃度下， 可以采用較短的作用時間?？傊?，本領域技術人員仍能根據具體的作用條件而采用合適的 固定劑的濃度和時間。這在本領域技術人員公知的技術范圍內。所公開的細胞處理液中任選包含有滲入性試劑。雖然不希望受理論約束，但是認 為用于本發(fā)明實施方案的滲入性試劑有助于本發(fā)明實施方案所用的其他試劑(例如變性 劑和固定劑等)進入細胞與細胞內相關物質作用。因此，本領域技術人員可以理解用于本 發(fā)明實施方案的滲入性試劑可以為任何具有膜滲透作用的試劑，例如二甲基亞砜、甘油、乙 二醇、丙二醇、甲酰胺或乙酰胺，也可以是所述試劑的任意組合。滲入性試劑在使用中的終濃度可為0. 1-30% (ν/ν)。例如，滲入性試劑可以采用 終濃度為0. 1%-20% (ν/ν)的二甲基亞砜、終濃度為0. 5%-25% (ν/ν)的甘油、終濃度為 1% -30% (ν/ν)的乙二醇、終濃度為-30% (ν/ν)的丙二醇、終濃度為0. 1% -20% (ν/ ν)的甲酰胺、終濃度為0. 1% -20% (ν/ν)的乙酰胺或其任意組合。所公開的細胞處理液中還任選包含有表面活性劑。可用于本發(fā)明實施方案的表面 活性劑可以是本領域常用的任何陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑以及非離子表面活 性劑?？捎糜诒景l(fā)明實施方案的陽離子表面活性劑例如可為具有以下通式的季銨鹽性 陽離子表面活性劑 其中R^R2和R3各自獨立選自氫原子，C1-C8烷基和C6-C2tl芳烷基；R4選自C8-C18烷 基，C8_18鏈烯基，C6-C18芳烷基；X為選自鹵素、硫酸根、磺酸根的陰離子。例如，可用于本發(fā)明實施方案的陽離子表面活性劑可為十六烷基三甲基氯化銨或
十二烷基三甲基氯化銨?？捎糜诒景l(fā)明實施方案的陰離子表面活性劑例如可為具有以下通式的磺酸鹽 R-SO3Na, R SC8-C2tl烷基。例如，可用于本發(fā)明實施方案的陰離子表面活性劑可為十二烷基磺酸鈉。可用于本發(fā)明實施方案的非離子表面活性劑例如可為具有以下通式的聚氧乙烯 類非離子表面活性劑R1-A- (CH2CH2O)n-H R1 選自 H、C1^22 烷基或 C2_22 烷基鏈烯基，A 選自-0-、-C00-和 ph-O-，η 是 10-1000 的整數(shù)。具體化合物是聚乙二醇，優(yōu)選分子量為6000-20000的聚乙二醇。也可以采用各種表面活性劑的任意組合。表面活性劑在使用中的終濃度可為0. 005-5% (w/v)。例如，表面活性劑的終濃度 為0.005%-5% (w/v)的聚乙二醇、終濃度為0.005%-5% (w/v)的十二烷基磺酸鈉、終濃 度為0.005%-3% (w/v)的十六烷基三甲基氯化銨或其任意組合。本領域技術人員常用的中性等滲緩沖液均可用于本發(fā)明實施方案的洗滌過程。例 如，可采用的洗滌液有中性等滲磷酸鹽緩沖液、中性等滲硼酸鹽緩沖液，中性等滲檸檬酸鹽 緩沖液、中性等滲NaCl溶液，可用于本發(fā)明實施方案的抗凝劑為臨床上常用的抗凝劑。例如，可采用1. 5% (W/ V)EDTA-2NA或EDTA-2K中性等滲抗凝劑，(W/V)檸檬酸鈉中性等滲抗凝劑?？捎糜诒景l(fā)明實施方案的保存液為本領域常用的細胞保存液。添加細胞處理液和固定劑的順序可作變化。一般來說，細胞處理液與紅細胞膜或 細胞內所含物質作用應該在固定劑使得蛋白質分子結構穩(wěn)定之前完成。因此，通常是先加 入細胞處理液，處理一定時間后再加固定劑。但是，也可以同時加入細胞處理液和固定劑； 或者先加入固定劑，反應較短時間后再加入細胞處理液(或者降低固定劑濃度，將其先加 入反應若干時間后，再加入細胞處理液)。本領域技術人員可以理解，這些方案均落入本發(fā) 明所保護的范圍。優(yōu)選先加入細胞處理液處理一段時間后，再加入固定劑。通過適宜的洗滌液將所得產物進行洗滌。在本發(fā)明的實施方案中任選將制備好的網織紅細胞模擬物保存于保存液中。本方法中的保存液是能夠長期保存細胞的溶液，本領域技術人員熟知的細胞保存 液都可以使用。本發(fā)明一個實施方案還提供了通過所公開的方法所制得的網織紅細胞模擬物。成熟紅細胞胞內不含核酸，所以在儀器檢測過程中不能結合特異的網織紅細胞熒 光檢測染料。而在本發(fā)明公開所提供的方法中，通過對無核紅細胞表面及胞內物質進行修 飾，使細胞能夠對熒光染料產生某種吸附作用，在儀器檢測運行中有效吸附結合熒光染料， 從而在激光光源激發(fā)下產生可檢測的熒光信號，最終得到一個明顯有別于成熟紅細胞的、 落在網織紅細胞顯示區(qū)域的細胞聚群，見圖1。如果將制備產物按照一定比例摻入到成熟紅 細胞中，經以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀檢測，可以顯示出兩個有明顯界 限的細胞群，一個位于成熟紅細胞區(qū)，一個位于網織紅細胞區(qū)，從而實現(xiàn)對網織紅細胞計數(shù) 的質量控制。本發(fā)明再一個實施方案提供了包含所公開的網織紅細胞模擬物的血液質控物。所 公開的方法制得的網織紅細胞模擬物可以與紅細胞、白細胞、血小板等其他細胞模擬物相 混合，組成以核酸熒光染色為檢測原理的多參數(shù)血液細胞分析儀的質控物。其中網織紅細 胞相對與紅細胞的比例可進行有效的調整。
本發(fā)明再一個實施方案涉及一種用于制備網織紅細胞模擬物的組合物，所述組合 物包含細胞處理液和固定劑，所述細胞處理液含有蛋白質變性劑以及任選的滲入性試劑和 /或表面活性劑。所公開的組合物可用于公開的制備網織紅細胞模擬物的方法中。實施例以下將通過具體實施例對本發(fā)明作出進一步的描述。所述實施例僅對本發(fā)明作出 示例性說明，并非對本發(fā)明作出任何意義上的限定。實施例中所用到的試劑以下配制中所用的化學試劑，除非特殊說明，均為分析純抗凝劑每升蒸餾水中含EDTA_Na215g。用HCl或NaOH調節(jié)pH至7. 0士0. 2，用 NaCl 調節(jié)滲透壓至 300 士 20m0sm/kgH20。洗滌液每升蒸餾水中含NaCl 8. 5g，Na2HP042. 2g，NaH2PO4O. 4g。用 HCl 或 NaOH 調 節(jié) pH 至 7. 0士0. 2，用 NaCl 調節(jié)滲透壓至 300士20m0sm/kgH20。細胞處理液A 每升蒸餾水中含去離子甲酰胺5ml，尿素5g，十二烷基磺酸鈉0. 5g， NaCl 9g?；靹蚝笥肏Cl或NaOH調節(jié)pH值至7.0 士 0. 1，細胞處理液B 每升蒸餾水中含二甲基亞砜5ml，丙二醇20ml，鹽酸胍5g，十二烷基 三甲基氯化銨0. 5g，NaCl 9g。混勻后用HCl或NaOH調節(jié)pH值至7. 0 士0. 1，細胞處理液C 每升蒸餾水中含甘油10ml，異硫氰酸胍5g，聚乙二醇200000. 5g， NaCl 9g?；靹蚝笥肏Cl或NaOH調節(jié)pH值至7.0 士 0. 1，細胞處理液D 每升蒸餾水中含丙二醇20ml，鹽酸胍5g，十六烷基三甲基氯化銨 0. lg, NaCl 9g?；靹蚝笥?HCl 或 NaOH 調節(jié) pH 值至 7.0 士0. 1，細胞處理液E 每升蒸餾水中含二甲基亞砜5ml，鹽酸胍5g，NaCl 9g?；靹蚝笥?HCl 或 NaOH 調節(jié) pH 值至 7. 0 士 0. 1，細胞處理液F:每升蒸餾水中含尿素5g，聚乙二醇200000. 5g，NaCl 9g。混勻后用 HCl 或 NaOH 調節(jié) pH 值至 7. 0 士 0. 1，細胞處理液G 每升蒸餾水中含尿素5g，NaCl 9g?；靹蚝笥肏Cl或NaOH調節(jié)pH 值至 7. 0 士 0. 1，固定劑A 戊二醛(25% )100ml，冰醋酸20ml，苦味酸30ml，室溫混勻后補蒸餾水 至1L。固定劑B 甲醛(37% ) 300ml，戊二醛(25% ) 40ml，乙醇10ml，丙酮5ml，室溫混勻 后補蒸餾水至1L。保存液每升蒸餾水中含葡萄糖9. Og,甘露醇5. Og,氯化銨1. 3g，甘氨酸10. Og,腺 嘌呤0. 14g，磷酸氫二鈉2. 2g，磷酸二氫鈉0. 4g，硫酸鏈霉素1. 0g，青霉素20萬單位，混勻 后用HCl或NaOH調節(jié)pH值至7. 0 士 0. 1，用NaCl調節(jié)滲透壓至300 士 10m0sm/kgH20。全組分質控物的配制將以下實施例1-8中所制備的網織紅細胞模擬物按照下表配制方法，與紅細胞模 擬物、血小板模擬物、白細胞模擬物用適量的保存液進行混合，配制成不同水平的全組份質 控物，即可用于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司所生產的檢測波長635nm的BC系列流 式細胞分析儀的日常質量控制。
8 實施例1取新鮮抗凝牛全血，每800ml牛血中含抗凝劑200ml。將抗凝全血離心2400rpm， 5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌，再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉 上清液，用白細胞過濾器過濾除去白細胞。用細胞處理液A將上述濾液的紅細胞濃度調整 至IX IO12個/L，攪拌混勻1-5分鐘，加入固定劑A至終濃度為2% (固定劑體積占總反應 液的體積比，下同)，室溫下作用5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗滌反應產物三 至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述，與其他細胞模 擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血液細胞分析儀 對上述質控物檢測，結果參見圖2 (僅提供RET通道圖像)。實施例2取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液B將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑A至終濃度為2%,室溫下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖3 (僅提供RET通道圖像)。實施例3取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液C將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑A至終濃度為8%，4°C下反應2小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖4 (僅提供RET通道圖像)。實施例4 取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去白 細胞。用細胞處理液D將上述濾液的紅細胞濃度調整至IX IO12個/L，攪拌混勻1-5分鐘， 加入固定劑A至終濃度為0. 2%，37°C下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖5 (僅提供RET通道圖像)。實施例5 取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液E將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑A至終濃度為2%,室溫下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖6 (僅提供RET通道圖像)實施例6 取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液F將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑A至終濃度為2%,室溫下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖7 (僅提供RET通道圖像)。實施例7 取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液G將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑A至終濃度為2%,室溫下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖8 (僅提供RET通道圖像)。實施例8 取新鮮抗凝人全血。將抗凝全血離心2400rpm，5分鐘。去掉上清液，洗滌液洗滌， 再次離心2400rpm，5分鐘。并重復洗滌一至二次。去掉上清液，用白細胞過濾器過濾除去 白細胞。用細胞處理液A將上述濾液的紅細胞濃度調整至1 X IO12個/L，攪拌混勻1-5分 鐘，加入固定劑B至終濃度為2%,室溫下反應5小時，期間不斷混勻攪拌。用洗滌液重復洗 滌反應產物三至四次。用適量保存液對產物進行懸浮，即可如上全組分質控物的配制所述， 與其他細胞模擬物按比例混合配制血液分析儀質控物。用以核酸熒光染色為檢測原理的血 液細胞分析儀對上述質控物檢測，結果參見圖9 (僅提供RET通道圖像)。由附圖可見，本發(fā)明各實施例制得的血液質控物在血液分析儀中檢測分析，得到 與成熟紅細胞區(qū)具有明顯界限的網織紅細胞區(qū)。因此，本發(fā)明各實施例可以實現(xiàn)對網織紅 細胞計數(shù)的質量控制。本文中的所有數(shù)據、圖像、儀器、試劑和步驟應理解為說明性而非限制性的。雖然已結合上述具體實施方案描述了本發(fā)明，許多修改和其它變化對于本領域技術人員是顯而 易見的。所有這種修改和其它變化也落入本發(fā)明的精神和范圍內。
1權利要求
一種制備網織紅細胞模擬物的方法，所述方法包含以下步驟洗滌與分離抗凝含無核紅細胞的血液，得到純化的無核紅細胞；加入細胞處理液和固定劑，所述細胞處理液中含有蛋白質變性劑以及任選的滲入性試劑和/或表面活性劑，對所述無核紅細胞表面和/或胞內的物質進行處理和固定；對所得的產物進行洗滌。
2.權利要求1的方法，其中所述蛋白質變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素、硫酸銨 及其組合。
3.權利要求1-2中任一項的方法，其中所述固定劑選自丙酮、乙二醛、丙酮醛、丁二醛、 戊二醛、多聚甲醛、甲醛、乙醇及其組合。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述滲入性試劑選自二甲基亞砜、甘油、乙二 醇、丙二醇、甲酰胺、乙酰胺及其組合。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述表面活性劑選自具有以下通式的季銨鹽陽 離子表面活性劑R1 其中RpR2和R3各自獨立選自氫原子，C1-C8烷基和C6-C2tl芳烷基；R4選自C8-C18烷基， C8_18鏈烯基，C6-C18芳烷基；X為選自鹵素、硫酸根、磺酸根的陰離子； 或者為具有以下通式的陰離子表面活性劑 R-SO3NaR為C8-C20燒基；或者為具有以下通式的聚氧乙烯類非離子表面活性劑 R1-A- (CH2CH2O)n-HR1選自H、C^22烷基或C2_22烷基鏈烯基，A選自-0-,-C00-和ph-Ο-，η是10-1000的整數(shù)。；及其組合。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述陽離子表面活性劑選自十六烷基三甲基氯 化銨和十二烷基三甲基氯化銨，所述陰離子表面活性劑選自十二烷基磺酸鈉，并且所述非 離子表面活性劑選自聚乙二醇。
7.一種網織紅細胞模擬物，所述網織紅細胞模擬物通過權利要求1-6中任一項的方法 制備。
8.一種全血質控物，所述全血質控物包含權利要求7的網織紅細胞模擬物。
9.一種用于制備網織紅細胞模擬物的組合物，所述組合物包含細胞處理液和固定劑， 所述細胞處理液含有蛋白質變性劑以及任選的滲入性試劑和/或表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明一方面提供了一種制備網織紅細胞模擬物的方法。本發(fā)明另一方面提供了一種網織紅細胞模擬物，所述網織紅細胞模擬物通過上述方法制備得到。本發(fā)明還一方面提供了一種全血質控物，所述全血質控物包含本發(fā)明所提供的網織紅細胞模擬物。
文檔編號G01N33/49GK101881778SQ20091010722
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月6日 優(yōu)先權日2009年5月6日
發(fā)明者夏濤, 徐祖越, 王璐 申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司