專利名稱：定量體液中的bpi的方法
本申請是申請日為1993年12月29日的美國申請系列號08/175,276的部分繼續(xù)申請，而后者又是申請日為1993年9月22日的美國申請系列號08/125,677的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明背景本發(fā)明涉及測定體液樣品(包括血液樣品)中能殺菌并增加通透性的蛋白質(zhì)之存在的方法。這種能殺菌并增加通透性的蛋白質(zhì)(簡稱BPI)是一種陽離子型抗微生物蛋白質(zhì)，它能從人類和動物的嗜中性白細胞的嗜苯胺藍顆粒中純化出來(Weiss等，J.Biol.Chem.，2532664(1978)，Elsbachetal.，J.Bio1.Chem.，25411000(1979).BPI能與革蘭氏陰性細菌外膜上的脂多糖)簡稱LPS(成分結(jié)合)Gazzano-Santoro etal.，Infect.Immun，604754(1992)。最近，一種重組形式的人BPI(rBPI23)已被覽定出來并與天然BPI作了比較。rBPI23片段由完整BPI的氨基端23KDa的部分組成，并保留了天然BPI與LPS結(jié)合的能力及抗微生物活性)Gazzano-Santoro etal，J.Clin.Invest.，901122(1992)，Weiss etal，J.Clin.Invest.，901122(1992))在這以前，任何體液中的BPI水平還沒有被精確地測定過。由于rBPI23和其他BPI蛋白及其蛋白產(chǎn)物具有潛在的治療用途，需要有一種靈敏且可重復(fù)的試驗方法來測定體液BPI的存在和數(shù)量。特別是體液BPI的測量可能對診斷很有用處。Pereira etal，J.Immunol.Methods，11715(1989)公開了一種競爭EIISA法可在人嗜中性白細胞的天然顆粒粗提物中測定BPI。Pereira等還公開了在EIISA法中陽離子蛋白的非特異性相互作用可用多陰離子如肚素或硫酸葡聚糖處理來減小。Pesce etal.，J.Immunol.Methoels，8721(1986)也提到這點。但Pereira等的競爭試驗的特征在于靈敏性有限，因而在本領(lǐng)域內(nèi)仍希望有一種更靈敏的BPI試驗可測量哺乳動物體液中的內(nèi)源性BPI水平。本申請的另一感興趣的是由Von der Mohien等在Abstract，13thInternational Symposium on Intensive Care and EmergenuyMedicine，Brussels(1993年3月)中公開的革蘭氏陰性膿毒癥患者和正常受試者BPI血清水平的試驗結(jié)果。該摘要公開了在其試驗條件下，健康受試者血清中檢測不到BPI而在所有膿毒癥患者中可以檢測到循環(huán)的BPI本發(fā)明概要本發(fā)明根據(jù)對血液樣品(在此指血漿)進行的BPI免疫試驗提出了定量體液樣品(包括血液樣品)中BPI水平的方法。血漿是從新鮮、未凝集的血液中分離出白細胞和紅細胞后保留下來的成分。血清是凝集的血經(jīng)離心分離后保留的血液成分(即不含凝血因子的血漿)。本發(fā)明的一個方面認為血清BPI水平不能代表循環(huán)血液中BPI的內(nèi)源性水平，而血漿BPI水平可代表。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測受試者有無革蘭氏陰性膿毒癥的方法，包括檢測該受試者血漿樣品中內(nèi)源性的胞外BPI濃度，并將此濃度與能指示革蘭氏陰性膿毒癥的標(biāo)準濃度值相比較。這個標(biāo)準值可以是1.7ng/ml，這比正常人血漿BPI的平均值0.8ng/ml高兩個標(biāo)準差。因而凡超出正常人血漿BPI濃度的平均值兩個標(biāo)準差以上的值就能指示革蘭氏陰性膿毒癥。
根據(jù)本發(fā)明，測定體液(如血漿)中胞外BPI的濃度較優(yōu)選的方法是夾心免疫試驗，并進一步使用一種選自由肝素和硫酸葡聚糖組成的一組物質(zhì)中的陽離子非特異性封閉劑。本發(fā)明的BPI免疫試驗也可用于測其他體液BPI濃度。這些體液包括血清、尿、肺灌洗液、玻璃體液、隙液、腦脊液、唾液和滑液，但也不限于此。
作為本發(fā)明的另一方面，還提供了測定受試者活動炎癥狀態(tài)之存在的方法，包括測定得自受試者的液體樣品中內(nèi)源BPI的濃度，并與活動炎癥狀態(tài)的標(biāo)準指示性濃度相比較。其中能測定活動炎癥狀態(tài)之存在的試驗體液是血漿，而能指示活動炎癥狀態(tài)的標(biāo)準可以是1.7ng/ml，它比正常人血漿BPI的平均值0.8ng/ml高兩個標(biāo)準差。因此凡比正常人血漿BPI濃度的平均值高出兩個標(biāo)準差以上的值就能指示存在活動炎癥狀態(tài)。本發(fā)明提供的測定選自由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎組成的組中的活動炎癥狀態(tài)之存在的方法是經(jīng)過測定受試者滑液樣品中內(nèi)源BPI濃度并與指示活動炎癥狀態(tài)的標(biāo)準值濃度比較。就滑液、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎來說，超過152ng/ml就可以是指示活動炎癥狀態(tài)的標(biāo)準，這個值比非炎癥狀態(tài)的滑液BPI的平均值26ng/ml高兩個標(biāo)準差。
盡管尿道感染病人的尿液BPI水平可能會上升，但BPI尿試驗通常檢測出很少或檢測不到BPI。
附圖的簡單描述

圖1a描繪了在BPI夾心ELISA試驗中肝素，8KDa硫酸葡聚糖，500KDa硫酸葡聚糖，1M Nacl和緩沖液對照對檢測rBPI的影響。
圖1b描繪了BPI夾心ELISA試驗中肝素，8KDa硫酸葡聚糖，500KDa硫酸葡聚糖，1M Nacl和緩沖液對照對檢測rBPI的影響。
圖2a描繪了在BPI夾心ELISA法做三次不同試驗，所得rPBI23的標(biāo)準曲線的可重復(fù)性。
圖2b描繪了用BPI夾心ELISA法做四次不同試驗，所得rBPI23的標(biāo)準曲線的可重復(fù)性圖3描繪了BPI夾心ELISA試驗中rLBP，rBPI和rBPI23的劑量反應(yīng)由線圖4描繪了20名健康供血員提供的血漿和血清配對樣品的內(nèi)源BPI水平。
圖5描繪了20名膿毒癥患者提供的血漿和血清配對樣品的內(nèi)源BPI水平。
圖6描繪了用BPI夾心ELISA試驗測人血漿中內(nèi)源BPI水平時，處理時間和1300g或400g的離心力的影響。
圖7描繪了在用親和純化的抗BPI23抗體包被的微滴板上被捕獲的物質(zhì)的Western印跡免疫反應(yīng)性。
圖8描繪了20份人血清樣品在Western印跡中兩條BPI帶(分子量為62和64KDa)整合峰區(qū)域與在BPI夾心ELISA中的免疫反應(yīng)性之間的關(guān)系。
圖9a描繪了健康供血員和膿毒癥患者血清BPI的散點圖。
圖9b描繪了健康供血員和膿毒癥患者血漿中BPI水平的散點圖。
圖10描繪了膿毒癥兒童和非膿毒癥病危兒童血漿BPI水平的散點圖。
圖11描繪了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑液BPI水平。
圖12描繪了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者滑液BPI水平的散點圖。
圖13描繪了健康供血者和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿BPI水平的散點圖。
圖14描繪了健康受試者經(jīng)LPS處理后的BPI水平。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及定量體液(包括血液)中胞外BPI之存在的方法，包含對所說的受試者血漿進行BPI免疫試驗。盡管此試驗對于測定治療施用的BPI(即外源性的)存在和數(shù)量有用，但它更特別地適于定量循環(huán)血液中的內(nèi)源性胞外BPI，以此作為受試者患膿毒癥(包括革蘭氏陰性膿毒癥)的一項指標(biāo)。而且還認為定量循環(huán)血中內(nèi)源性胞外BPI之存在對評價膿毒癥病人的預(yù)后方法有用。此外，本發(fā)明還提供了測定受試者活動炎癥狀態(tài)之存在的方法，包含測定受試者體液樣品內(nèi)源BPI濃度，并與能指示活動炎癥狀態(tài)的標(biāo)準值濃度相比較。
本發(fā)明提供了用于人BPI的一種夾心ELISA試驗，它具有高試驗靈敏性、高特異性和極好的可重復(fù)性。本文所用的根據(jù)試驗方法定量的“BPI”包括天然BPI，重組BPI及重組的BPI N-末端片段(rBPI23)，還有其他BPI蛋白和蛋白產(chǎn)物。這些蛋白產(chǎn)物在每ml毫微克以下的范圍應(yīng)易于定量。免疫試驗優(yōu)選以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)夾心試驗完成，但也可使用競爭試驗和利用其他標(biāo)記形式的免疫試驗。本發(fā)明優(yōu)選的試驗使用抗BPI抗體，包括單克隆抗體(簡稱單抗)和親和純化的兔多克隆抗體。兔多克隆抗BPI抗體可依據(jù)傳統(tǒng)方法用BPI作免疫原來制備。一種特別優(yōu)選的單抗命名為Xoma 6C2由于其在溶液中結(jié)合BPI的能力而依據(jù)傳統(tǒng)方法論來選擇。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案在稀釋緩沖液中使用了肝素，它看來既能降低本底又能增強試驗信號，從而使試驗效果提高。低分子量(8KDa)硫酸葡聚糖也有相似的作用。相反，高分子量硫酸葡聚糖(500KDa)降低了試驗靈敏性，而且實際上逆轉(zhuǎn)了低分子量多陰離子的有利影響。起始研究揭示rBPI23與微滴板間有非特異性相互作用，導(dǎo)致了高本底信號。加入10單位/ml(大約50μg/ml)的肝素就能降低本底并提高試驗靈敏性(與緩沖液對照相比)。更高濃度的肝素(100單位/ml)產(chǎn)生的結(jié)果與用10單位/ml觀察到的相似。高分子量硫酸葡聚糖引起的抑制作用可能是因它從空間位置上阻礙了抗體針對BPI上的抗原決定基的接口。
本發(fā)明在免疫試驗中加了高鹽濃度(1M Nacl)以降低本底信號。用高鹽濃度比用肝素試驗靈敏性更高，但某些樣品中鹽不如肝素能有效降低本底。據(jù)信當(dāng)標(biāo)本在含肝素或高鹽的溶液中稀釋時，注意到的靈敏性增加是由于破壞了離子相互作用，而其他可能的親水力也可能影響本底信號。
可用兩種方法證明BPI ELISA的特異性。其一，當(dāng)免疫反應(yīng)性蛋白從血清“捕獲”到ELISA平板上，再被洗脫、電泳分離、印跡、用抗rBPI23抗體探測后，唯一能檢測到的物質(zhì)是約60KDa的一個對偶物，它與人嗜中性白細胞中提取的天然BPI一起遷移與此類似，當(dāng)同樣經(jīng)印跡過的樣品用抗rBPI抗體探測時，先測得的ELISA信號與BPI帶的強度之間有顯著性相關(guān)關(guān)系(R2＝0.807，P＝0.0001)。其二，人LBP，雖同樣可結(jié)合LPS，且顯示與BPI有相當(dāng)大的序列同源性，它產(chǎn)生的信號卻分別比rBPI和rBPI23低30,000倍和100,000倍。即使100μg/ml rLBP在ELISA中產(chǎn)生的信號也只等同于不到3ng/mlBPI的信號。由于已有報道(Leturcq et al.，J.Cell.Biochem.，16C161(1992))正常人血清樣品中LBP水平在1到25μg/ml之間(平均7μg/ml)，這些數(shù)據(jù)說明LBP在BPI ELISA中產(chǎn)生的干擾極小。
本發(fā)明另一方面發(fā)現(xiàn)內(nèi)源BPI水平因用血漿還是血清做試驗而有明顯不同。血漿是血液中非細胞液體部分，它是因加抗凝劑(如檸檬酸，酸-檸檬酸-葡萄糖(ACD)，EDTA，肝素及水蛭素)防凝固而得。而血清是血液經(jīng)凝固分離出的液體。正常血漿只含低水平BPI(＜0.2到2.1ng/ml)，而同時來自同一個體的血清樣品BPI平均要高出37倍(4.9到72.1ng/ml)。而且BPI水平還隨收集和處理時間的延長而變化。這些數(shù)據(jù)對于評價和解釋正常及病理性個體的BPI水平很重要，因為它們提示了(i)正常個體的血漿BPI水平很低，(ii)在凝集過程中BPI有可能從嗜中性白細胞釋放到血清里。因此BPI的內(nèi)源性水平應(yīng)在血漿中測定，而不應(yīng)在血清中測定，以避免因體外釋放和/或嗜中性白細胞破壞而致的人為假象。與此類似，含重組形式BPI的臨床樣品的分析最好在血漿中進行。
Weiss and Olsson，Blood 69652(1987)曾報道每108個嗜中性白細胞平均有65μg BPI。假設(shè)每毫升全血有5×106個嗜中性白細胞，那為每毫升血中將有約3.2μg/ml的BPI。由于血清中BPI濃度低(＜100ng/ml)，故總可得物質(zhì)中因凝集而釋放的BPI量將只占很小的百分比(約1％)。這種釋放的BPI可能不具備生理性意義，只代表了從受損嗜中性白細胞中滲漏出的BPI。作為選擇存在的可能性是體內(nèi)凝集可能是從嗜中性白細胞中定位釋放抗微生物物質(zhì)(包括BPI)的一般信號，用以對損傷或創(chuàng)傷作出反應(yīng)。此時BPI可能就作為損傷部位定點抗細菌的一種御機制。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將在理解以下解說性實施例的基礎(chǔ)上弄清楚。實施例1涉及親和純化的兔抗BPI抗體的制備；實施例2涉及這些抗體的生物素標(biāo)記；實施例3涉及應(yīng)用這些抗體的ELISA過程，實施例4涉及單克隆抗BPI抗體的制備；實施例5涉及肝素、硫酸葡聚糖和Nacl濃度對BPI夾心試驗靈敏性的影響；實施例6涉及rBPI和rBPI23標(biāo)準曲線的特征。實施例7涉及加入到混合人血漿中的rBPI和rBPI23的測量；實施例8涉及rLBP、rBPI和rBPI23免疫反應(yīng)性的比較，實施例9涉及處理時間和離心力對ELISA試驗的影響。實施例10涉及對血清和血漿樣品的SDS-PAGE和Western印跡分析；實施例11涉及人血漿和血清中內(nèi)源性BPI免疫反應(yīng)性的測量。實施例12涉及膿毒癥病人BPI的臨床相關(guān)性；實施例13涉及膿毒癥及非膿毒癥病危兒童血漿中內(nèi)源BPI的比較；實施例14涉及正常人及囊性纖維變性病人的肺灌洗標(biāo)本中內(nèi)源BPI水平；實施例15涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑液中內(nèi)源BPI水平；實施例16涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎病人滑液中內(nèi)源BPI水平；實施例17涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血漿樣品中內(nèi)源BPI水平。實施例18涉及在健康受試者身上使用LPS對內(nèi)源性BPI水平的影響。
實施例1親和純化的兔抗BPI23抗體的制備依據(jù)本實施例可制備出親和純化的兔抗rBPI23抗體。具體地說將依照Gazzano-santoro et al.，Infect，Immun604754-4761(1992)的方法制備的rBPI23(20mg)與10ml經(jīng)溴化氰活化的Sepharose 4B(sigma Chemical CO.，St.Louis，MO(在0.2M PH8.6的碳酸氫鹽溶液(含0.5M Nacl)中偶聯(lián)。大約97％的rBPI23偶聯(lián)到樹脂上。合并抗血清(150ml，取自兩只用rBPI232超免疫的免子)，用等體積磷酸鹽緩沖液(PH7.2，簡稱PBS)稀釋。將部分稀釋抗血清(50ml)通過10ml的rBPI23-Sephargse柱；PBS洗柱后，用0.1M PH2.5的甘氨酸將結(jié)合的抗體洗脫下來，收集部分立刻用1M PH8.0的磷酸緩沖液中和。峰值部分通過在280nm下測吸光率來確定(根據(jù)HarloW et al AntibodiesA Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press，New York，P.312(1988)的方法)。最后能回收45mg親和純化的抗rBPI23抗體，或者說每毫升兔抗血清能回收300微克抗體。
實施例2生物素標(biāo)記的兔抗BPI23抗體的制備在本實施例中取20mg按實施例1的方法制備的親和純化兔抗BPI23抗體與2mg溶于11ml0.1M碳酸氫鈉PH8.3中的生物素己酸酰胺N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)室溫溫育2小時。去掉未偶聯(lián)的生物素并經(jīng)過在用含0.1％疊氮化鈉的PBS平衡的PD-10柱(Pharmacia Biotechlnc.Piscataway，NJ)上對反應(yīng)混合物分級分離來交換堿性緩沖液。生物素標(biāo)記抗體的終產(chǎn)量為17.9mg。
實施例3ELISA程序親和純化的兔抗BPI23抗體以1μg/ml的濃度溶于PBS中，按每孔50μl加在Immulon 2(Dyntech Laboratorieslnc.，Chartilly，VA)微滴板上，置2-8℃溫育過夜(或37℃1小時亦可)。棄去抗體溶液，每孔加200μl含1％脫脂牛奶(作封閉劑)的PBS。室溫封閉lihjf后，每孔以300μl洗滌緩沖液(wynk0.05％吐溫-20的PBS)洗滌，重復(fù)3次。
每個供血員的血被收在兩個Vacutainer(Becton DickinsonRutherford，NJ)管內(nèi)，其一含酸性檸檬酸葡聚糖，第二個含凝固活化因子和血清分離液。收集1小時30分后，同一人的血漿和血清樣品同時用13000g離心5分鐘進行處理。收集合適的部分，以0.5ml的等份試樣貯于-70℃。合并的正常人血清和合并的檸檬酸化血漿均得自Sigma Chemieal Co.(St.Louis，Mo)。
標(biāo)準品、樣品和對照均分別用含1％牛血清白旦白，0.05％吐溫-20的PBS(PBS-BSA/TWeen)加10單位/ml肝素鈉(SigmaChemical Co.St.Louis，Mo)稀釋成一式三份，置于不同的96孔板中。以從100ng/ml做系列倍比稀釋至0.012ng/ml制備rBPI或rBPI23的標(biāo)準溶液。每份重復(fù)并稀釋的標(biāo)準品、樣品和對照(50μl)轉(zhuǎn)移到已封閉好的微滴板上37℃溫育1小時。初次溫育后，用洗滌緩沖液洗板三次。生物素標(biāo)記的兔抗BPI23抗體用PBS-BSA/Tween稀釋至1/4000后每孔加50μl，37℃溫育1小時。然后所有孔用洗滌液洗三次。以堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈球菌抗生物素蛋白(Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)，用PBS-BSA/Tween稀釋至1/2000，每孔加50μl。37℃溫育15分鐘后，用洗滌液洗滌各孔三次，再用去離子水洗三次。然后每孔加50μl體積的底物對硝基苯磷酸(按1mg/ml溶于10％二乙醇胺緩沖液)。室溫顯色1小時后，用50μl 1N NaOH終止反應(yīng)。用Vmax PlateReader(Molecular Devices Corp.，Menlo Park，CA)，檢測所有孔的405nm吸收率。
將所有樣品和標(biāo)準品(均一式三份)405nm下的平均吸收率(A405)減去第一步溫育時所有只含樣品稀釋液(不含BPI)的孔的平均A405以校正本底。將A405與rBPI或rBPI23的ng/ml值相對應(yīng)繪出一個標(biāo)準曲線。選擇好線性有效范圍，進行線型回歸分析，樣品和對照的濃度就可以在標(biāo)準曲線上內(nèi)插而得。
實施例4小鼠單克隆抗BPI抗體的制備本實施例中采用標(biāo)準技術(shù)(Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork.P.196(1988))制備小鼠抗rBPI單抗6C2。具體地說，將NS-1小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)rBPI全蛋白免疫的Balb-c小鼠脾細胞進行化學(xué)融合得到雜交瘤細胞系。經(jīng)過用夾心ELISA試驗篩選細胞培養(yǎng)物上清實現(xiàn)對分泌抗BPI抗體的雜交瘤細胞的鑒定。用有限稀釋法將雜交瘤細胞系6C2連續(xù)克隆三次。細胞系產(chǎn)生的單抗定性為IgG，K型。這個雜交瘤細胞系保藏在American Type CultureCollection 12301 Parklawn Drive，Rockville Md 28032，并被定為ATCC No.HB11512。
用兔多克隆抗BPI抗體或用6C2產(chǎn)生的抗體作捕獲劑得到的rBPI標(biāo)準曲線顯示用6C2單抗比用兔抗體獲得的靈敏性稍高。以6C2為基礎(chǔ)的ELISA中，rBPI23比rBPI全蛋白的免疫反應(yīng)性低約1000倍。所以6C2單抗較易捕獲rBPI或天然BPI而非rBPI23。6C2BPI夾心ELISA也顯示出與rLBP的交叉反應(yīng)性最小。
實施例5肝素、硫酸葡聚糖和Nacl對靈敏性的影響本實施例比較了肝素、硫酸葡聚糖(分子量8KDa和500KDa)或1M氯化鈉對BPI夾心試驗靈敏性的影響。圖1的結(jié)果說明肝素和低分子量硫酸葡聚糖(8KDa)對rBPI(圖1a)和rBPI23(圖1b)都同樣有效地從廣義上降低本底和增加試驗靈敏性。對比之下，高分子量硫酸葡聚糖(分子量500KDa)比緩沖液對照更減小了試驗靈敏性。盡管高鹽最能增加試驗靈敏性，但不如肝素那樣能降低rBPI23的本底。因而在后續(xù)試驗中都用10單位/ml的肝素。
實施例6標(biāo)準曲線的特征在本實施例中，發(fā)現(xiàn)圖2a和2b顯示的幾個不同試驗中rBPI和rBPI23的標(biāo)準曲線具有可重復(fù)性。用觀測到的A405對濃度作線性回歸分析證實rBPI和rBPI22均有線性濃度反應(yīng)(R2分別為0.997和0.999)。rBPI標(biāo)準曲線的線性有效范圍是100到6000pg/ml，而rBPI23的是25到800pg/ml。
實施例7加入到合并的人血漿中的rBPI和rBPI23的測量在本實施例中合并的檸檬酸化的人血漿中加入了不同濃度的rBPI或rBPI23，然后冷凍和融解，隨后在夾心ELISA中測量。加入的BPI的回收率是這樣規(guī)定的如入人血漿樣品中所測BPI的總量減去未加對照的濃度，再除以實際加入樣品中的總量。此分數(shù)乘100，結(jié)果用輸入濃度的百分數(shù)表達。不同濃度的BPI加入人血漿樣品中后的回收率平均為83％，變動范圍從65％(300ng/ml)到97％(3ng/ml)。rBPI23的回收率平均56％，變動范圍從30％(0.Sng/ml)到90％(50,000ng/ml)。表I和表II概括了每種BPI加入血漿樣品后的回收率數(shù)據(jù)。
表I加入混合檸檬酸化人血漿的rBPI23的回收率加入量 測量值 回收量 百分(ng/mL) (ng/mL)(ng/mL) 回收率0 0.23 --- ---0.50.38 0.15 30％5 2.32.1 42％50 29 29 58％500230230 46％5,000 3,500 3,500 70％50,000 45,000 45,000 90％平均回收率- 56％表II加入混合檸檬酸化人血漿的rBPI23的回收率加入量測量值 回收量 百分(ng/mL) (ng/mL)(ng/mL) 回收率0 0.2 --- ---3 3.1 2.9 97％30 25.4 25.2 84％300 195 195 65％3,0002,540 2,54085％平均回收率-83％
實施例8rLBP，rBPI和rBPI23的免疫反應(yīng)性比較本實施例比較了rLBP、rBPI和rBPI23在BPI夾心ELISA試驗中的免疫反應(yīng)性，以確定可能出現(xiàn)的免疫交叉反應(yīng)。若不考慮LBP與BPI有相當(dāng)大的序列同源性(見Schumann etal.，Science，2491429(1990))圖3的結(jié)果顯示從廣義說，rLBP產(chǎn)生的信號約比rBPI23小5個數(shù)量級，比rBPI小4個數(shù)量級。例如100,000ng/ml(100μg/ml)的rLBP產(chǎn)生的信號與3ng/ml的rBPI或0.6ng/ml的rBPI23產(chǎn)生的相同。當(dāng)rBPI濃度低于3，125ng/ml時，BP2夾心ELISA中檢測不出可定量的信號。
這些結(jié)果證實抗體與LBP間交叉反應(yīng)性很小。從而確保了BPI試驗的特異性。
實施例9處理時間和離心力的影響本實施例還調(diào)查了處理時間和離心力對測量含檸檬酸鹽的血漿中BPI的影響。一般地，不論離心力為400g(帶橫格的線段)或為1300g(實心線段)(圖6)對檸檬酸鹽血漿處理時間越長，用BPI夾心ELISA測得的內(nèi)源BPI量越多。血漿標(biāo)本中內(nèi)源BPI水平最低值是在收集后處理30分鐘之內(nèi)且在約1300g的離心力作用下測得的。
實施例10血清和血漿樣品的SDS-PAGE和Western印跡分析本實施例完成了對血清和血漿樣品的SDS-PAGE和Wstern印跡分析。具體地說，血清和血漿樣品用等體積、含10單位/ml肝素鈉的PBS-BSA/Tween稀釋。將稀釋的血清和血漿樣品按每孔50μl加到微滴板上的6個平行孔內(nèi)(此微滴板已先用親和純化的兔抗rBPI23抗體包被，并用脫脂牛奶按前面BPI夾心ELISA試驗描述的方法進行了封閉)。37℃溫育1小時后，各孔用洗滌緩沖液洗9次。在每個樣品的6個平行孔中，均每孔加60μl SDS-PAGE樣品緩沖液(0.125M Tris-HCl，4％SDS，10％甘油，0.004％溴酚藍，0.02％疊氮鈉，PH6.8)，經(jīng)過連續(xù)的溫育和轉(zhuǎn)移(每次室溫振蕩3分鐘)，就能使被捕獲的有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)被溶解下來。每個樣品捕獲并溶解的有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)終體積約50μl。
每個溶解好的樣品取15ml，按Laemmli，Nature，227680(1970)的條件在10％非還原膠中電泳。蛋白質(zhì)用標(biāo)準技術(shù)(Towbin etal.，1979)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。印跡好的蛋白用生物素標(biāo)記的兔抗BPI23抗體(用TBST稀釋到1/2000，TBST為0.025MTris-Hcl，Ph7.2，含0.2M Nacl.0.3％吐溫-20)或兔抗rBPI抗血清(用TBST稀釋至1/1000)來探測。生物素標(biāo)記的兔抗BPI23抗體接著用在TBST中稀釋至1/4000的堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈球菌抗生物素蛋白(Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)標(biāo)記。而未標(biāo)記的抗rBPI抗血清，用生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(用TBST稀釋至1/2000)(Zymed Laboratories Inc.San Francisco，CA)溫育后，再與堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈球菌抗生物素蛋白溫育。每次溫育后均用TBST洗4次。然后將印跡物浸于50μl/ml溶于含0.01％(W/V)硝基藍四氮唑和4mM MgCl2的0.12M佛羅那乙酸緩沖液(PH9.8)底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的溶液中。室溫顯色1小時。用光密度計(Shimadzu Model Cs9000U，Shimadzu corp.，Kyoto，Japan)以反射方式對Western印跡的泳道進行掃描，并對得出的光密度曲線以面積積分法定量。
本實施例還用兩種不同的抗體探針對血漿和血清標(biāo)本進行了Western印跡分析，以查明ELISA免疫反應(yīng)性的產(chǎn)生到底是由于有全BPI，還是因有BPI片段，或者根本是無關(guān)的免疫反應(yīng)性物質(zhì)引起的。在這些試驗中，包被了親和純化兔抗BPI23抗體的微滴板被用來直接從血漿和血清中捕獲免疫反應(yīng)性物質(zhì)。這些親和力捕獲的物質(zhì)經(jīng)樣品處理液洗脫，在非還原條件下電泳分離，印跡到硝酸纖維素膜上，再用抗阻抗體探測。至于圖T印跡圖頂部的數(shù)字是指泳道，而右邊的數(shù)字表示分子量。印跡膜A第1泳道為空白，第2道為rLBP(100μg/ml)，第3道為rBPI(100μg/ml)，第4至12道為人血清樣品，第13道為天然BPI。印跡膜B第1至3道與印跡膜A相同，第4至14道為人血清樣品，第15道為天然BPI。(在硝酸纖維素印跡膜A的第T10和12道，膜B的第4，5，6和14道上，在62和64KDa處理模糊可見有區(qū)帶，但在圖示上未復(fù)印好。在膜A和膜B的第2道于69.5KDa和114.4KDa處也可測到區(qū)帶，但在圖示中復(fù)制較差。)當(dāng)以親和純化的抗BPI23抗體探測印跡膜時，ELISA免疫反應(yīng)性看來與表現(xiàn)分子量為62KD2和64KDa的兩條帶的存在相關(guān)。從人嗜中性白細胞提取的天然BPI也跑出了62KDa和64KDa的兩條帶。在從嗜中性白細胞提取的BPI及來自少部分人血清樣品的BPI中都檢測到一條50KDa的很微弱的帶(圖7中看不見)。這條帶可能代表BPI的一個未糖基化形式(分子量50,659)，它在測出的總BPI中占不到7％。rBPI只跑出64KDa的一條帶。在這些血漿或血清樣品的Westem印跡中未發(fā)現(xiàn)其他有免疫反應(yīng)的區(qū)帶。加入人血漿中的rBPI23用這些方法也測得到，且很易與rBPI和天然BPI區(qū)分開(未顯示數(shù)據(jù))。將rLBP以100,000ng/ml的量加到已包被抗BPI23的孔中，并按上述程序操作。則在表觀分子量為69.5KDa和114.4KDa處能分辨出兩條微弱的免疫反應(yīng)區(qū)帶(圖7中看不見)。rLBP帶的綜合強度(通過對峰面積積分而測得)，從廣義上說約比rBPI的峰面積小大約5,000倍。
當(dāng)這同一批的血清樣品用抗rBPI抗血清探查時，ELISA免疫反應(yīng)性與62KDa/64KDa蛋白對的存在又相關(guān)在ELISA信號和Western印跡的兩條BPI帶的峰面積積分之間發(fā)現(xiàn)有顯著性相關(guān)關(guān)系(R2＝0.807，P-0.0001)(圖8)。以100μg/ml加入的rLBP用抗rBPI血清探查時測不到信號。這些數(shù)據(jù)暗示用ELISA測出的血清和血漿內(nèi)源免疫反應(yīng)性是由于全BPI而非BPI片段或其他交叉反應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生的。
實施例11人血漿和血清中內(nèi)源BPI免疫反應(yīng)性的測量本實施例測定了人含ACD抗凝劑的血漿和血清中內(nèi)源BPI的免疫反應(yīng)性。血漿和血清樣品從20例不同的健康供血員中收集。用BPI夾心ELISA法，以rBPI作標(biāo)準，測得每份樣品的BPI水平(ng/ml)。所有測試個體的結(jié)果顯示在圖4上，可見血清樣品的BPI水平(帶橫格的線段)一致比相應(yīng)的血漿樣品BPI(實心線段)要高。血漿BPI平均濃度為0.8ng/ml，血清中為27.1ng/ml。血漿中濃度范圍是從0.2ng/ml以下直到2.1ng/ml。血清中是從4.9ng/ml到72.1ng/ml。在含檸檬酸鹽或EDTA的血漿中測得的BPI值與在ACD血漿中的相似。初步的結(jié)果暗示加肝素的血漿中值可能會稍高一些。
隨后用20例膿毒癥病人的EDTA血漿和血清重復(fù)該實驗。結(jié)果顯示在圖5?？梢娡徊∪说难獫{和血清水平并不相同。而且BPI水平也不同于那些健康人，其中健康人的血漿BPI水平總是很低。對正常人和膿毒癥病人的血清BPI水平進行統(tǒng)計分析顯示兩者并無顯著區(qū)別(P＝0.10)。圖9a顯示了健康個體和膿毒癥個體的血清BPI水平之散點圖。相比之下，圖9b顯示的散點圖中，正常人和膿毒癥病人的血漿BPI水平的差異具有高度統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＝0.0014)。
實施例12膿毒癥病人血漿中的內(nèi)源性BPI免疫反應(yīng)性的臨床相關(guān)性有66例膿毒癥病人，懷疑是革蘭氏陰性細菌引起的。本實施例中收集了他們的EDTA血漿樣品，用BPI夾心ELISA試驗定量其中的內(nèi)源性BPI免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)BPI水平與取自相同樣品的各種臨床參數(shù)和測量值相關(guān)。此外在BPI水平和超過30天期的存活者之間也做了相關(guān)性分析。為簡化這種存活分析，把這些樣品的BPI水平中值計算為4.8ng/ml，這個水平用來把那些有高水平BPI(＞4.8ng/ml)和有低水平BPI(＜4.8gn/ml)的病人分開。當(dāng)用這種方式劃分59例病人的數(shù)據(jù)時，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性BPI水平與14天存活者之間有明顯的相關(guān)關(guān)系。特別是BPI水平低于中間值的受試者有較高的14天存活水平，這就暗示盡管相關(guān)性沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。但較低水平BPI與較高的存活期之間有一定聯(lián)系。就30天存活率而言未發(fā)現(xiàn)兩組之間有區(qū)別。
該結(jié)果揭示了治療前的BPI水平與年齡，和APACHE II(急性生理學(xué)年齡的長期健康評價)分數(shù)之間均有明顯的反向相關(guān)關(guān)系。APACHE II是長期存活的預(yù)后指標(biāo)，當(dāng)APACHE II分數(shù)較低時就指示有較好的機會存活。因而根據(jù)APACHE II分數(shù)較高的初始內(nèi)源BPI水平與較大機會的長期存活相關(guān)，盡管BPI水平與14天存活是負相關(guān)的。結(jié)果還指示初始內(nèi)源BPI水平與下列因素不相關(guān)(i)開始診斷后的小時數(shù)，(ii)白細胞數(shù)，(iii)純嗜中性白細胞數(shù)，(iv)血小板數(shù)，(v)發(fā)病次數(shù)，(vi)主要發(fā)病次數(shù)和次要發(fā)病次數(shù)，(vii)性別，(viii)種族，(ix)感染類型，或(x)發(fā)病類型。
實施例13膿毒癥和病危的兒童的內(nèi)源BPI水平有9例膿毒癥兒童和13例非膿毒癥病危兒童，取其ACD血漿樣品，按實施例3的ELISA程序測得BPI免疫反應(yīng)性，并與圖10顯示的結(jié)果相比較。健康成人血漿BPI水平的平均值加工個標(biāo)準差就是1.7ng/ml，與它相比，9例膿毒癥兒童有8例其血漿BPI水平升高了。而受試的非膿毒癥病危兒童中只有大約50％有BPI血漿水平升高。
實施例14正常人及囊性纖維變性病人肺灌洗樣品的內(nèi)源BPI水平本實施例比較了正常個體和囊性纖維變性病人肺灌洗液樣品中內(nèi)源性BPI的免疫反應(yīng)性。一般而言，正常受試者肺灌洗液樣品中BPI濃度低于0.05ng/ml，而囊性纖維變性病人的肺灌洗液樣品中BPI濃度有升高，范圍是從10ng/ml到100ng/ml或更高。
實施例15類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑液樣品中內(nèi)源BPI水平本實施例用BPI夾心試驗測定了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑液中內(nèi)源BPI的免疫反應(yīng)性。滑液樣品取自13例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)，其中某些樣品是在不同的時期從同一病人身上取的。由于滑液粘性大，這些樣品均用透明質(zhì)酸酶以終濃度100單位/ml在37℃處理15分鐘，然后10,000g離心10分鐘。圖11中提供的對這些樣品的分析結(jié)果顯示，除1例外所有樣品的BPI濃度都升高到超過25ng/ml。滑液中BPI濃度基本上超過健康受試者血漿中的濃度，這有可能是活動性關(guān)節(jié)炎的存在或嚴重性的指標(biāo)。
實施例16類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎病人滑液樣品中內(nèi)源性BPI水平本實施例用BPI夾心試驗測定了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎病人的滑液樣品中內(nèi)源性BPI的免疫反應(yīng)性。滑液樣品照實施例15的方法取自病人有關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)處，病人包括8例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，8例骨關(guān)節(jié)炎和8例反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。圖12中提供的這些樣品的分析結(jié)果顯示所有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人和大多數(shù)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎病人的BPI水平都升高了，而這些病人都是發(fā)炎性關(guān)節(jié)病人。相比之下，大部分骨關(guān)節(jié)炎病人滑液中沒出現(xiàn)升高的BPI水平，而這種病是種非炎癥性退化性關(guān)節(jié)病。具體地說，骨關(guān)節(jié)炎受試者滑液BPI平均濃度約26ng/ml，比它高兩個標(biāo)準差的濃度約為152ng/ml。
實施例17類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血漿樣品中內(nèi)源性BI水平本實施例用實施例3的BPI夾心試驗測定了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的EDTA血漿中內(nèi)源性BPI的免疫反應(yīng)性。圖13表現(xiàn)了80例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病伯和23例健康受試者血漿BPI水平的散點圖，它顯示受試者之間有統(tǒng)計上的顯著性差異。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人平均血漿BPI水平為25.7ng/ml，而健康受試者的是0.8ng/ml。
實施例18對健康受試者給予LPS對內(nèi)源BPI水平的影響本實施例測定了對健康受試者用LPS對內(nèi)源性BPI的免疫反應(yīng)性的影響。具體地說，對8例健康受試者予以靜脈注射4ng/kgLPS，另14例不注射LPS，然后在不同時間點用BPI夾心試驗監(jiān)測其血漿BPI水平的變化。結(jié)果表示在圖14中，它顯示了血漿BPI濃度平均值隨時間的改變情況那些用了LPS的受試者BPI水平在用藥1小時后就開始上升。大多數(shù)受試者在施用LPS后2到4小時內(nèi)BPI血漿水平達到峰值。從基線到峰值BPI水平平均增加約8倍。在同樣的時間段內(nèi)對照組的平均BPI水平保持在正常范圍內(nèi)(＜2.1ng/ml)。
預(yù)期另外的分析將說明BPI血漿水平與臨床癥狀之間的相關(guān)關(guān)系，這些癥狀有細菌性感染，內(nèi)毒素血癥和膿毒癥(包括與包含DIC和ARDS的膿毒癥相關(guān)的癥狀)。而且，因外源施用的rBPI和rBPI23在動物循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除，在人體內(nèi)rBPI23也被快速清除，因此人體液BPI水平的升高很可能反映了一個活躍的炎癥過程，這過程是在收集樣品的同時發(fā)生的。
根據(jù)上面描述的目前優(yōu)選的實施例，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，對本發(fā)明做出的各種修改和變化是可預(yù)料到的。因此，對本發(fā)明范圍的唯一限制是所附權(quán)利要求書中出現(xiàn)的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.在血液樣品中定量BPI之存在的免疫試驗方法，其改進包括化驗血漿。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中在選自由肝素和硫酸葡聚糖組成的組中的陽離子型非特異性封閉劑存在下進行血漿免疫試驗。
3.一種測定受試者革蘭氏陰性膿毒癥之存在的方法，包括測定所說受試者血漿樣品中的內(nèi)源性BPI的濃度并與能指示革蘭氏陰性膿毒癥的濃度標(biāo)準值相比較。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中用BPI免疫試驗的方法來測定BPI的濃度。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所說的免疫試驗是夾心免疫試驗。
6.權(quán)利要求5的方法，其中在選自由肝素和硫酸葡聚糖組成的組中的陽離子型非特異性封閉劑存在下進行免疫試驗。
7.測定受試者活動性炎癥狀態(tài)之存在的方法，包括測定所說受試者體液樣品中內(nèi)源性BPI的濃度，并與能指示活動性炎癥狀態(tài)的濃度標(biāo)準值相比較。
8.權(quán)利要求7的方法，其中活動性炎癥狀態(tài)選自由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎組成的組中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的液體樣品為滑液。
10.權(quán)利要求7的方法，其中的液體樣品為血漿。
11.權(quán)利要求7的方法，其中的BPI濃度的測定用BPI免疫試驗方法。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所說的免疫試驗是夾心免疫試驗。
13.權(quán)利要求7的方法，其中免疫試驗是在有選自由肝素和硫酸葡聚糖組成的組中的陽離子型非特異性封閉劑存在的情況下進行的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量受試者體液(包括血液)中胞外BPI存在的方法，該方法包括對來自所說的受試者的體液樣品進行BPI免疫試驗。
文檔編號G01N33/564GK1133634SQ94193898
公開日1996年10月16日 申請日期1994年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月22日
發(fā)明者M·L·懷特, S·F·卡羅爾, J·K·馬 申請人:愛克斯歐瑪公司