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標(biāo)記產(chǎn)品以確定特征和來(lái)源的制作方法

文檔序號(hào):5875949閱讀:250來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::標(biāo)記產(chǎn)品以確定特征和來(lái)源的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及標(biāo)記產(chǎn)品以確定其特征和來(lái)源。在世界各地發(fā)生的、與許多不同產(chǎn)品有關(guān)的主要問(wèn)題是產(chǎn)品假冒、未經(jīng)許可的產(chǎn)品銷售(例如半黑市交易、平行交易、產(chǎn)品轉(zhuǎn)向)以及基于產(chǎn)品換代的欺詐傾向。在全世界,商家為他們銷售的產(chǎn)品提供一種可見(jiàn)的有特色的外觀、包裝或標(biāo)簽,這樣顧客就可以將他們的產(chǎn)品與其他人的產(chǎn)品相區(qū)別。結(jié)果,顧客學(xué)著把這種可見(jiàn)的有特色的外觀與某些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來(lái),而且如果他們對(duì)那些標(biāo)準(zhǔn)感到滿意,他們就會(huì)優(yōu)先于其它產(chǎn)品而購(gòu)買帶有可見(jiàn)的有特色的外觀的產(chǎn)品。一旦顧客形成了對(duì)帶有特定的可見(jiàn)的有特色的外觀的產(chǎn)品的偏愛(ài),商家就變得容易受到產(chǎn)品假冒的侵害。假冒產(chǎn)品由帶有簡(jiǎn)直可以亂真的可見(jiàn)的有特色的外觀的產(chǎn)品構(gòu)成。顧客看到提供給假冒產(chǎn)品的可見(jiàn)的有特色的外觀,就購(gòu)買這種產(chǎn)品,還以為自己買的是真貨。已有許多已知的方法提供可見(jiàn)的有特色的外觀。一般說(shuō)來(lái),可見(jiàn)的有特色的外觀或者是直接提供給產(chǎn)品或者是提供給與材料有關(guān)的物品,例如標(biāo)簽、包裝物或容器。例如,可見(jiàn)的有特色的外觀可以是有特色的形狀或構(gòu)造,有特色的標(biāo)記或者是二者的結(jié)合。特別優(yōu)選的可見(jiàn)的有特色的外觀是商標(biāo)。假冒產(chǎn)品的材料可以與真貨的材料相同或不同。通常,假冒產(chǎn)品的材料是與真貨相同的,但質(zhì)量低劣。例如,將一種具有特定化學(xué)式并由一廠家生產(chǎn)的化學(xué)藥品與具有相同化學(xué)式而由一不同廠家生產(chǎn)的化學(xué)藥品相區(qū)分是很困難的。兩個(gè)廠家用相同生產(chǎn)工藝的話,情況尤為如此。因此,對(duì)無(wú)恥之徒來(lái)說(shuō),確定一組合物中活性成分的化學(xué)式和該組合物中各成分的相對(duì)量、然后以他自己的產(chǎn)品冒充另一廠家的產(chǎn)品并不困難。除產(chǎn)品假冒之外,產(chǎn)品摻假是另一主要問(wèn)題。產(chǎn)品摻假發(fā)生在產(chǎn)品被竄改例如被稀釋之時(shí)。這一問(wèn)題的一個(gè)實(shí)例是潤(rùn)滑油或其它油基產(chǎn)品的摻假,方法是向真貨中加入假冒的油。這種摻假不僅給油品廠家造成經(jīng)濟(jì)損失而且由此發(fā)生產(chǎn)品性能的降低,這會(huì)給客戶造成損失并由此損害真貨的聲譽(yù)。先前已經(jīng)提出一種克服這一問(wèn)題的方法,就是在產(chǎn)品中摻入染料。這種方法容易被模仿。WO87/06383揭示了一種用大分子特別是DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記物品或基質(zhì)的方法。歐洲專利申請(qǐng)公布號(hào)EP—A—0260829揭示了單克隆抗體和多克隆抗體,它們可用于識(shí)別材料中的氯化酚類特別是五氯苯酚并且能檢測(cè)那些材料中化學(xué)品的濃度。在說(shuō)明書的引言中提出,五氯苯酚作為農(nóng)藥或防腐劑加入材料之中。EP—A—0260829并未揭示以氯化苯酚作為標(biāo)記化合物的產(chǎn)品中氯化苯酚的鑒定。M.J.Wraith等人在the6thInternationalCongressofPesti-cideChemistry,August10—15th,1986inOttawa,Canada,題目為“DevelopmentofImmunoassayMethodsforPyrethroidInsecti-cides”作出的更近期的描述中,揭示了間苯氧基苯甲酸和二氯乙烯環(huán)丙烷羧酸的蛋白質(zhì)結(jié)合物以及用這些蛋白質(zhì)結(jié)合物制備的多克隆抗體。還揭示了分析紅茶、水和土壤中的氯氰菊酯代謝物、間苯氧基苯甲酸和二氯乙烯環(huán)丙烷羧酸。沒(méi)有揭示用間苯氧基苯甲酸或二氯乙烯環(huán)丙烷羧酸作為標(biāo)記化合物,也沒(méi)有揭示用免疫測(cè)定法檢測(cè)任何帶有可見(jiàn)的有特色的外觀的材料中兩者中任一化合物。總的看來(lái),本發(fā)明以一種標(biāo)記一種鑒定用產(chǎn)品的方法為特征,其中由半抗原構(gòu)成的或者由與另一種化合物(優(yōu)選聚合物)共價(jià)結(jié)合的半抗原構(gòu)成的標(biāo)記與該產(chǎn)品相結(jié)合。這種標(biāo)記對(duì)該產(chǎn)品無(wú)害而且尚未與該產(chǎn)品結(jié)合。因此,只有那些知道標(biāo)記的特征的人才能簡(jiǎn)便地證實(shí)標(biāo)記的存在,而假冒者或其他不熟悉這種標(biāo)記的人不能用常規(guī)方法測(cè)定。所以,假冒產(chǎn)品和真貨可以通過(guò)前者沒(méi)有這種標(biāo)記而后者有這種標(biāo)記來(lái)加以區(qū)分。通常,這種產(chǎn)品是一種商品而且可以是固體、液體或半固體或者氣體。標(biāo)記可以直接加入產(chǎn)品(例如,附在產(chǎn)品表面上或與產(chǎn)品本身混合)或者與標(biāo)簽、標(biāo)記或其它產(chǎn)品包裝材料相結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選標(biāo)記的一種類型是由與聚合物共價(jià)結(jié)合的半抗原組成的,這里標(biāo)記的制造是首先將半抗原與功能性單體共價(jià)結(jié)合,然后將半抗原—單體化合物聚合以形成帶有共價(jià)結(jié)合半抗原的聚合物。在用這種方法制造的標(biāo)記中,半抗原與聚合物的摩爾比可簡(jiǎn)便地加以改變,方法是改變聚合混合物中半抗原標(biāo)記的單體和未標(biāo)記的單體的相對(duì)量。優(yōu)選的功能性單體包括取代的苯乙烯和丙烯酸單體族。本發(fā)明還以檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中一種或多種半抗原標(biāo)記的測(cè)試盒為特征。測(cè)試盒的一種形式包括帶有與其表面相結(jié)合的待檢測(cè)半抗原的樣品接受載體、含有專門針對(duì)半抗原的特性異結(jié)合體的容器以及用來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合體—半抗原復(fù)合物的形成的檢測(cè)工具。特異性結(jié)合體優(yōu)選為抗半抗原抗體。檢測(cè)工具優(yōu)選為可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體,它特異性地結(jié)合抗半抗原抗體。優(yōu)選的可檢測(cè)標(biāo)記包括酶、化學(xué)發(fā)光劑(例如熒光素)、發(fā)色團(tuán)(例如染料、有色的膠乳珠、染色顆粒、顏料、金屬溶膠粒子(例如金或銀金屬溶膠粒子)、染料包被的脂質(zhì)體、碳)??蛇x擇地,測(cè)試盒包括一個(gè)樣品接受載體(它有專門針對(duì)結(jié)合于其表面上的標(biāo)記的第一種特異性結(jié)合體)以及一個(gè)含有專門針對(duì)半抗原標(biāo)記的可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種抗體的容器。本發(fā)明的另一類標(biāo)記由一種半抗原標(biāo)記組成,它可以由半抗原組成或者可以由與具有可檢測(cè)的物理特性(如顏色)的化合物共價(jià)結(jié)合的半抗原組成。在標(biāo)記產(chǎn)品中呈現(xiàn)的半抗原標(biāo)記濃度下,半抗原標(biāo)記的物理特性是不能檢測(cè)出的,但在半抗原標(biāo)記濃縮后是可以檢測(cè)出的。因此,標(biāo)記的檢測(cè)是這樣進(jìn)行的,即從標(biāo)記產(chǎn)品的樣品中濃縮半抗原標(biāo)記,以提供使半抗原標(biāo)記的依賴于濃度的物理特征得以檢測(cè)的濃度下的半抗原標(biāo)記。半抗原標(biāo)記的物理特性可以與標(biāo)記的半抗原部分有關(guān)或與標(biāo)記的非半抗原部分有關(guān)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)免疫沉淀反應(yīng)或應(yīng)用采用特異性結(jié)合半抗原的抗半抗原抗體的免疫親和柱,用免疫濃縮法從樣品中濃縮標(biāo)記。本發(fā)明還以一種用于檢測(cè)具有可檢測(cè)的依靠于濃度的物理特性的半抗原標(biāo)記的測(cè)試盒為特征。測(cè)試盒包括一個(gè)樣品接受載體,載體表面上結(jié)合有抗半抗原抗體?!皹?biāo)記”是指由一種半抗原和/或一種與化合物(優(yōu)選聚合物)共價(jià)結(jié)合的半抗原組成的化合物?!鞍肟乖笔侵敢环N低分子量的分子,當(dāng)單獨(dú)用作免疫原時(shí)它不能引起顯著的抗體應(yīng)答。當(dāng)半抗原與更大的載體分(如鑰孔血藍(lán)素、牛血清白蛋白、雞γ球蛋白)偶聯(lián)(即共價(jià)結(jié)合)且半抗原—載體化合物用作免疫原時(shí),產(chǎn)生半抗原特異性抗體。通常,半抗原分子量低于1,000,因而排除了蛋白質(zhì)、DNA分子以及其它抗原。“聚合物”是指一種化合物,通常是大的、高分子量化合物,由不同于半抗原的單體單元組成。如這里所用,“聚合物”是指包括聚合物、共聚物以及復(fù)合共聚物。典型的聚合物包括蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、聚苯乙烯以及本領(lǐng)域中熟知的各種合成聚合物?!肮δ苄詥误w”是指能夠聚合形成聚合物的單體單元。如這里所用,功能性單體能夠共價(jià)結(jié)合半抗原并隨后聚合形成聚合物?!鞍肟乖禺愋钥贵w”是指基本上特異性地結(jié)合半抗原分子的一種抗體。半抗原特異性抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。“標(biāo)記鑒別用產(chǎn)品”是指使標(biāo)記和產(chǎn)品相結(jié)合,這樣就可以確定產(chǎn)品的來(lái)源、特征或者包括生產(chǎn)日期、批號(hào)和保存期在內(nèi)的有關(guān)產(chǎn)品的其它信息。也便于標(biāo)記產(chǎn)品的鑒別1)監(jiān)視生產(chǎn)或其它過(guò)程,包括監(jiān)視工藝液流和混合控制;2)為安全或法規(guī)的目的而進(jìn)行的產(chǎn)品監(jiān)測(cè),例如為海關(guān)標(biāo)記產(chǎn)品的貨源國(guó)和標(biāo)記管制的物品;3)檢測(cè)和監(jiān)視標(biāo)記材料的泄漏,包括檢測(cè)諸如農(nóng)藥、除草劑、化肥、有毒廢物、有機(jī)污染物(例如TBT和二惡英)和其它化學(xué)品這樣的標(biāo)記產(chǎn)品的殘留物;4)示蹤產(chǎn)品,例如標(biāo)記一種加工化學(xué)品從而監(jiān)視向系統(tǒng)(例如水系統(tǒng))中加入化學(xué)品的速率以優(yōu)化化學(xué)劑量;5)研究化合物的生物降解,例如在土壤生物降解的研究中。標(biāo)記鑒別用產(chǎn)品還包括將產(chǎn)品與特定濃度的標(biāo)記相結(jié)合,以便于檢測(cè)用稀釋、改變濃度或加入雜質(zhì)的手段而進(jìn)行的產(chǎn)品摻假?!鞍肟乖瓨?biāo)記的物理特性”是指與半抗原標(biāo)記有內(nèi)在聯(lián)系的特性”,例如顏色、密度、重量和光學(xué)活性?!耙蕾囉跐舛鹊奈锢硖匦浴笔侵敢环N僅能在化合物的一個(gè)特定濃度下被檢測(cè)的物理特性。如這里所用,“依賴于濃度的物理特性”特別是指半抗原標(biāo)記的一種物理特性,在標(biāo)記產(chǎn)品中所用的半抗原標(biāo)記濃度下該特性是檢測(cè)不出的,但是半抗原標(biāo)記濃縮至高于標(biāo)記產(chǎn)品中半抗原標(biāo)記濃度的濃度后(例如通過(guò)從標(biāo)記產(chǎn)品中提取和沉淀半抗原標(biāo)記)是可以檢測(cè)的。“特異性結(jié)合體”是指一種能與標(biāo)記特異性結(jié)合的分子。特異性結(jié)合體可以與標(biāo)記結(jié)合,這種結(jié)合可以通過(guò)與標(biāo)記的半抗原部分結(jié)合也可以通過(guò)和與半抗原共價(jià)結(jié)合的化合物或聚合物(即標(biāo)記的非半抗原部分)結(jié)合。特異性結(jié)合對(duì)是,例如抗體與半抗原;生物素與卵白素以及配體與受體。本發(fā)明使開業(yè)者能夠?yàn)闃?biāo)記產(chǎn)品的目的而開發(fā)或選擇能在低濃度下被開發(fā)或選擇的特異性結(jié)合體(例如抗體)特異性識(shí)別的最小化學(xué)結(jié)構(gòu)(即半抗原),并且能用化學(xué)法使這種最小的可識(shí)別結(jié)構(gòu)附在客戶選擇的化合物上以產(chǎn)生一種標(biāo)記,該標(biāo)記為特定產(chǎn)品標(biāo)記的應(yīng)用提供所需特性。這類所需的標(biāo)記特性可以包括(1)在產(chǎn)品或溶劑中的溶解性或不溶性,其中,半抗原自身可溶或不可溶;對(duì)有效地將標(biāo)記摻入產(chǎn)品來(lái)說(shuō)或者對(duì)為檢測(cè)而提取標(biāo)記來(lái)說(shuō),這種溶解性或不溶性都是重要的;(2)在許多加工過(guò)程固有的極端溫度、pH或其它物理或化學(xué)條件中的穩(wěn)定性,否則這些極端條件會(huì)破壞半抗原或半抗原結(jié)合部位;(3)在使用或貯藏條件下在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性或者附著在產(chǎn)品表面,在這種條件下半抗原自身或結(jié)合部位自身是不穩(wěn)定的、不會(huì)附著或不會(huì)保持有效識(shí)別所需的空間取向。另外,用能被特異性結(jié)合體識(shí)別的最小化學(xué)結(jié)構(gòu)標(biāo)記化合物以及以對(duì)未標(biāo)記化合物的固定比例使用這種標(biāo)記化合物,可以在一過(guò)程中、在放入環(huán)境之時(shí)或之后、以使未標(biāo)記化合物的行為密切模型化的方式,追蹤最終產(chǎn)品中的標(biāo)記化合物。不依賴于化合物選擇的結(jié)合對(duì)選擇靈活性還可使一種以上化合物或者實(shí)際上是一大組不同化合物成為可識(shí)別的,方法是使同一特異性結(jié)合體與每種化合物相結(jié)合。這種能力顯著增加了可用于標(biāo)記產(chǎn)品的獨(dú)特標(biāo)記的數(shù)量而且顯著減少了為確定所用標(biāo)記的這種廣范圍而必須開發(fā)和生產(chǎn)的獨(dú)特試劑(結(jié)合對(duì))的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中,每種化合物都具有獨(dú)特但依賴于濃度的物理特性(例如,顏色)的一系列化合物中每一種都可用作獨(dú)特的標(biāo)記,但可用相同的試驗(yàn)濃縮和檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,半抗原的附著使實(shí)施者能使化合物被特異性結(jié)合體所識(shí)別,本領(lǐng)域熟練人員不能開發(fā)針對(duì)這種化合物的特異性結(jié)合體(例如,當(dāng)一種化合物或者單獨(dú)或者與本領(lǐng)域熟知的共同免疫原載體結(jié)合時(shí)注入動(dòng)物體中時(shí),化合物不會(huì)引起針對(duì)這種化合物的免疫應(yīng)答)。這使那些要不然不能用作標(biāo)記的化合物可以有效地用作標(biāo)記,或者可以使目前不能用特異性結(jié)合對(duì)測(cè)定法測(cè)定的化合物能用這類方法測(cè)定。相對(duì)而言不熟練的人員可以用諸如免疫測(cè)定法這樣的特異性結(jié)合對(duì)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)偏遠(yuǎn)地區(qū)里產(chǎn)品中的標(biāo)記。免疫測(cè)定法和相關(guān)技術(shù),例如結(jié)合使用生理化學(xué)分析法(例如HPLC和熒光測(cè)定法)的免疫親和濃縮法,使實(shí)驗(yàn)室中精確的參考方法得以應(yīng)用。這種在現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室中都能進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)合能力能選擇產(chǎn)品的標(biāo)記并且/或者將產(chǎn)品送至可靠的實(shí)驗(yàn)室來(lái)檢測(cè),這取決于哪種檢測(cè)方式最適合于這種應(yīng)用。從下列對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的描述以及權(quán)利要求中可清楚看到本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)記可以用免疫測(cè)定法和/或濃縮標(biāo)記并檢測(cè)依賴于濃度的物理特性來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的標(biāo)記。標(biāo)記應(yīng)該與它所標(biāo)記的產(chǎn)品是相容的,即無(wú)害的。標(biāo)記可以由半抗原或者與聚合物共價(jià)結(jié)合的半抗原組成。如果以意在被吸收的方式使用時(shí),優(yōu)選標(biāo)記是無(wú)毒的。存在于產(chǎn)品中時(shí),優(yōu)選標(biāo)記是憑視力檢測(cè)不出的。通常,標(biāo)記半抗原應(yīng)該是化學(xué)品或混合物中不能正常存在的半抗原;例如,它不是生產(chǎn)方法中的副產(chǎn)物、正常雜質(zhì)或者該化學(xué)品或化學(xué)組合物的標(biāo)準(zhǔn)添加劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中,標(biāo)記化合物以很低的濃度存在,例如百萬(wàn)分之幾或十億分之幾的數(shù)量級(jí)。盡管優(yōu)選標(biāo)記對(duì)產(chǎn)品是惰性的即不與其標(biāo)記的產(chǎn)品發(fā)生反應(yīng),但標(biāo)記必須能結(jié)合特異性結(jié)合體例如抗體,優(yōu)選單克隆抗體。而且,檢測(cè)標(biāo)記的能力不應(yīng)受與產(chǎn)品或其標(biāo)記的化合物的相互作用的不利影響。例如,用免疫測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記時(shí),標(biāo)記仍能結(jié)合標(biāo)記特異性抗體。根據(jù)特殊應(yīng)用,必須考慮能可接受地用作標(biāo)記的合適化合物的選擇標(biāo)準(zhǔn)。最重要的是,化合物必須具有特殊的分子基團(tuán),這種基團(tuán)可被特異性結(jié)合體(例如特異性抗體)識(shí)別。典型的半抗原標(biāo)記化合物通常包括體積大的取代的芳族化合物,例如4-氨基-1-萘磺酸發(fā)現(xiàn)適于用作標(biāo)記化合物的其它半抗原為間苯氧基苯甲酸和媒染黃7。其它優(yōu)選的標(biāo)記用化合物是4-氨基萘-1-磺酸、莧菜紅、dafcolbrown、4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4’-二磺酸、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸酸、4-羥基-3-甲氧基苯基-3-丁烯-2-酮香草醛、乙基-4-羥基-3-甲氧基肉桂、鉻變素FB、麗春紅4R、麗春紅S、金蓮橙O、姜黃素、松柏醇、己基香子蘭酸鹽、乙酰香草酮。一系列這類標(biāo)記化合物列于下面表1中。</tables>應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,很廣范圍的化合物適于用作半抗原標(biāo)記化合物,只要它們與被標(biāo)記的產(chǎn)品相容且對(duì)產(chǎn)品無(wú)害。因此可以設(shè)想,根據(jù)被標(biāo)記的產(chǎn)品來(lái)使用與油相容的、與水相容的和與固體相容的或者食品級(jí)的化合物作為標(biāo)記化合物。使用有光學(xué)活性的標(biāo)記化合物特別有利,因?yàn)橛贸R?guī)分析技術(shù)很難區(qū)分化合物的各光學(xué)活性形式,當(dāng)僅有痕量化合物供分析使用時(shí)尤為如此。可以生產(chǎn)對(duì)化合物的特定光學(xué)活性形式有選擇性的抗體,以利于檢測(cè)產(chǎn)品中這類有光學(xué)活性的標(biāo)記化合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,標(biāo)記具有可檢測(cè)的物理特性。標(biāo)記的可檢測(cè)的物理特性包括,例如顏色、重量、密度、磁力、磷光、熒光、吸光度、化學(xué)反應(yīng)性或能用本領(lǐng)域中熟知的光學(xué)方法檢測(cè)的各種特性。標(biāo)記的物理特性優(yōu)選為顏色或者熒光。通過(guò)用作(或用于)標(biāo)記的半抗原的物理特性和/或通過(guò)與半抗原共價(jià)結(jié)合的化合物或聚合物的物理特性,可將該物理特性賦予半抗原標(biāo)記。優(yōu)選地,在標(biāo)記產(chǎn)品中存在的低半抗原濃度下,不可能檢測(cè)半抗原標(biāo)記的物理特性。當(dāng)把產(chǎn)品樣品中的半抗原標(biāo)記濃縮(例如通過(guò)免疫沉淀反應(yīng)或免疫濃縮)至高于標(biāo)記產(chǎn)品中半抗原標(biāo)記濃度的濃度時(shí),例如通過(guò)檢測(cè)濃縮試樣的特定顏色可以簡(jiǎn)便地檢測(cè)出物理特性。優(yōu)選地,與標(biāo)記產(chǎn)品中半抗原濃度相比,半抗原標(biāo)記的濃度提高了至少2倍、優(yōu)選至少約5倍、更優(yōu)選至少約10到10,000倍后,可以通過(guò)其物理特性檢測(cè)半抗原標(biāo)記。能用依賴于濃度的物理特性檢測(cè)的典型的半抗原包括,4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸、鉻變素FB和麗春紅4R。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,標(biāo)記化合物由與事先存在或預(yù)先形成的聚合物共價(jià)結(jié)合的半抗原組成。通常,聚合物是大的高分子量化合物,由單體單元組成。聚合物可以由單一類型的單體單元組成(即對(duì)單體組合物是均勻的),或者可以由2種或更多種不同類型的單體單元組成(例如共聚物或復(fù)合共聚物)。典型的聚合物包括肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片斷、寡核苷酸和合成聚合物,特別是諸如苯乙烯、酚醛樹脂、聚烯丙胺、丙烯酸酯和改性聚氯乙烯這樣的有機(jī)合成聚合物。選出的聚合物必須能共價(jià)結(jié)合選出的半抗原而且必須對(duì)要標(biāo)記的產(chǎn)品無(wú)害且是惰性的。此外,聚合物必須基本上不影響要檢測(cè)的半抗原的能力,例如與半抗原特異性抗體結(jié)合的能力或提供依賴于濃度的可檢測(cè)物理特性的能力。優(yōu)選地,半抗原標(biāo)記與聚合物的共價(jià)結(jié)合提供了半抗原標(biāo)記的增強(qiáng)的穩(wěn)定性和免疫檢測(cè)性能。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中,半抗原標(biāo)記由與化合物共價(jià)結(jié)合的半抗原組成。可以用半抗原標(biāo)記標(biāo)記的典型化學(xué)品包括農(nóng)業(yè)化學(xué)品如磺酰脲除草劑;工業(yè)化學(xué)品如生物殺蟲劑、染料和熒光示蹤劑;藥品;表面活性劑;粘合劑諸如木材樹脂、異氰酸酯膠和環(huán)氧樹脂這樣的樹脂;印墨粘合劑如酚醛樹脂和環(huán)氧樹脂;食品添加劑如膨脹劑、維生素和調(diào)味劑;以及操作助劑(例如水體系中所用化學(xué)品)如生物殺蟲劑、絮凝聚合物、腐蝕抑制劑和防垢劑。優(yōu)選地,共價(jià)結(jié)合的半抗原大體上不會(huì)有害地影響所需的化合物特性,例如化學(xué)活性、無(wú)毒性(例如在化合物是一種食品添加劑的情形中)以及對(duì)降解的敏感性。用化學(xué)法將半抗原與諸如上述那樣的聚合物或化合物偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。這些化合物可以用一種或多種半抗原分子來(lái)標(biāo)記或者可以用單一類型或多種類型的半抗原來(lái)標(biāo)記,從而提供一種由多種半抗原標(biāo)記結(jié)合而構(gòu)成的標(biāo)記。這樣,多種不同的半抗原-每種可被獨(dú)特的特異性結(jié)合體(例如專門針對(duì)特定半抗原的抗體)識(shí)別—可以與聚合物或化合物共價(jià)結(jié)合。可選擇地,聚合物或化合物的各種分子(不然的話,它們是相同的)可以用不同的半抗原標(biāo)記。因此,在標(biāo)記產(chǎn)品中,可以采用多種結(jié)合形式的半抗原和半抗原標(biāo)記。可選擇地,可以通過(guò)首先將半抗原與功能性單體共價(jià)結(jié)合以提供半抗原標(biāo)記單體的方法來(lái)產(chǎn)生半抗原—聚合物標(biāo)記。要與功能性單體共價(jià)結(jié)合的半抗原必須含有一種分子基團(tuán)或官能團(tuán),這種基團(tuán)能與功能性單體反應(yīng)并且共價(jià)結(jié)合以產(chǎn)生半抗原標(biāo)記的單體。典型的反應(yīng)基包括氨基、羧酸、磺酸、酰氯、羥基、環(huán)氧乙烷、羥基、氯或者酯基。將半抗原與功能性單體共價(jià)結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。然后將標(biāo)記的單體聚合以形成半抗原標(biāo)記的聚合物。優(yōu)選地,共價(jià)結(jié)合的半抗原大體上不會(huì)對(duì)單體的聚合能力造成有害影響。更為優(yōu)選的是,半抗原標(biāo)記的單體通過(guò)與未標(biāo)記的單體以及半抗原標(biāo)記的單體的聚合都能形成一種聚合物。選擇一種與特定半抗原反應(yīng)的功能性單體至少需要兩種功能1)能接受自由基、加聚作用的雙鍵,或者能進(jìn)行縮聚的雙功能;和2)能與半抗原反應(yīng)并共價(jià)結(jié)合的活性部位。在未飽和單體的一般情形中,典型的功能性單體包括基于取代苯乙烯的功能性單體以及諸如(甲基)丙烯酸酯這樣的功能性丙烯酸單體。典型的取代苯乙烯和(甲基)丙烯酸酯列舉如下因此,可以用于產(chǎn)生半抗原-聚合物標(biāo)記的功能性單體是那些能共價(jià)結(jié)合半抗原并且保持形成半抗原標(biāo)記的聚合物的聚合能力的單體。典型的功能性單體包括氨基酸、核苷酸、具有半抗原活性功能的苯乙烯、環(huán)氧乙烷、表氯醇和氧化丙烯。由半抗原標(biāo)記的單體聚合合成半抗原標(biāo)記的聚合物提供了對(duì)聚合物標(biāo)記的增強(qiáng)的控制并且還有助于提高聚合物上半抗原的負(fù)荷。例如,改變聚合過(guò)程中存在的未標(biāo)記單體和半抗原標(biāo)記單體的相對(duì)濃度,可以產(chǎn)生具有不同半抗原量的聚合物。所得半抗原-聚合物標(biāo)記可以由約1∶1至10∶1的半抗原對(duì)聚合物的摩爾比組成,優(yōu)選約2∶1至100∶1,更優(yōu)選約10∶1至1,000∶1,這取決于產(chǎn)品中所需的半抗原濃度。另外,用不同半抗原標(biāo)記的單體可以聚合,提供一種由多種類型半抗原標(biāo)記組成的半抗原-聚合物標(biāo)記。半抗原聚合物的結(jié)合物不僅可以用于標(biāo)記表面,而且還可以摻入產(chǎn)品(或?yàn)橐后w或?yàn)楣腆w)中。而且,與功能性單體結(jié)合的半抗原可以用于檢測(cè)單體本身,也可用于檢測(cè)聚合物中存在的半抗原標(biāo)記的功能性單體。半抗原標(biāo)記的功能性單體、化合物或聚合物還可以具有其它化學(xué)基團(tuán),它們可以是1)第二種半抗原,以便于檢測(cè)半抗原標(biāo)記和/或提高檢測(cè)分析的靈敏度,在檢測(cè)分析是一種夾心片式結(jié)合分析的情形中尤為如此;2)一種信號(hào)化合物,它能被檢測(cè)以使檢測(cè)靈敏度得以提高(例如,可用載體上的抗體結(jié)合半抗原并濃縮單體或化合物,檢測(cè)與單體或化合物結(jié)合的信號(hào)化合物以測(cè)定結(jié)合的半抗原標(biāo)記的存在);以及/或者3)一種功能性化學(xué)基團(tuán),可以用非免疫(例如基于抗體的)手段在載體上結(jié)合或濃縮。例如,功能性化學(xué)基團(tuán)可以提供整個(gè)半抗原標(biāo)記分子的離子電荷,這樣半抗原標(biāo)記可以通過(guò)離子相互作用與載體結(jié)合。優(yōu)選地,功能性化學(xué)基團(tuán)可以與包被于固體表面的化合物反應(yīng)以使半抗原標(biāo)記與載體共價(jià)結(jié)合。隨著為鑒定和區(qū)分不同批號(hào)高附加值產(chǎn)品而使用小有機(jī)分子的能力的增強(qiáng),有可能將許多不同聚合物(例如氨基酸)與給定的半抗原結(jié)合,已為這種給定的半抗原制備了抗體。盡管這沒(méi)有改變半抗原的檢測(cè)(例如,標(biāo)記的半抗原與免疫親和柱的結(jié)合),但通過(guò)象HPLC這樣的檢測(cè)方法或通過(guò)與專門針對(duì)結(jié)合到半抗原上的聚合物(例如氨基酸)的抗體的結(jié)合,它使半抗原的檢測(cè)更易區(qū)分。實(shí)際上,借助HPLC或免疫沉淀法可以很容易地分離不同的氨基酸和/或相同氨基酸的不同序列。可能結(jié)合形式的數(shù)量非常巨大,因?yàn)榇嬖?0種天然氨基酸和許多可用于這一方法的合成化學(xué)品。結(jié)合物的選擇取決于它們?cè)诳拱肟乖蚩闺慕Y(jié)合物抗體與半抗原標(biāo)記結(jié)合過(guò)程中所用溶劑中的溶解性。標(biāo)記用產(chǎn)品應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,標(biāo)記化合物可以許多種方式與產(chǎn)品結(jié)合。所以標(biāo)記化合物可以存在于整個(gè)產(chǎn)品或產(chǎn)品的某部分之中或之上,或者存在于標(biāo)簽、包裝、容器或其它與產(chǎn)品相關(guān)的包裝材料的整體或某部分之中或之上。標(biāo)記化合物通常與產(chǎn)品相混合,但可選擇的是不依賴于產(chǎn)品而存在,例如標(biāo)記可存在于產(chǎn)品包裝或標(biāo)簽中。被標(biāo)記的產(chǎn)品可以是固體、半固體、液體或氣體。固體產(chǎn)品的例子包括聚合物、塑料和橡膠;藥片、膠囊和粉劑;農(nóng)業(yè)化學(xué)品的固體制劑如殺蟲劑、除草劑、殺真菌劑和化肥;紡織品例如布;設(shè)計(jì)品或特產(chǎn)如水晶飾品、瓷器和銀器;藝術(shù)品原作如畫和雕刻,記錄品如唱片、磁帶、軟盤和硬盤;電子產(chǎn)品如電視機(jī)、計(jì)算機(jī)和收音機(jī);汽車配件和照相機(jī);紙張如文件、機(jī)密文件、票據(jù)、債券、標(biāo)簽和包裝;化學(xué)品如生物殺蟲劑、化妝品例如膏;以及食品。流體產(chǎn)品的例子包括油基產(chǎn)品如潤(rùn)滑油、汽油、柴油和液化石油產(chǎn)品;油漆和涂料;香水;化妝品;墨汁;飲料如葡萄酒、威士忌酒、雪利酒、杜松子酒和伏特加;液體藥劑如糖漿、乳劑和懸液;液體農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑;化學(xué)組合物;以及工業(yè)溶劑。優(yōu)選流體產(chǎn)品是液態(tài)的。一類優(yōu)選產(chǎn)品包括油基產(chǎn)品例如潤(rùn)滑油。氣體的例子包括煙囪排放氣體(例如,用于污染的跟蹤),氣塊(例如用于氣象研究)以及儲(chǔ)器中的氣體樣品(例如,為了確保這些容器未被打開過(guò))。當(dāng)產(chǎn)品是諸如潤(rùn)滑油這樣的油基產(chǎn)品時(shí),用作標(biāo)記化合物的化合物優(yōu)選具有-2.5至+5.0范圍內(nèi)的logP,優(yōu)選-1.5至4.5,最優(yōu)選0至4.0(如此處所用,logP是指25℃下化合物在辛醇和水之間的分配系數(shù)的對(duì)數(shù))。所以,例如間苯氧基苯甲酸的logP為3.9。當(dāng)產(chǎn)品為液體時(shí),優(yōu)選標(biāo)記化合物在標(biāo)記產(chǎn)品中的濃度下是無(wú)色的而且可溶于液體產(chǎn)品,這樣只能用后繼測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記化合物的存在。還優(yōu)選標(biāo)記化合物在標(biāo)記產(chǎn)品中的標(biāo)記濃度下是無(wú)味的。優(yōu)選僅使用痕量的標(biāo)記。通常,標(biāo)記化合物與產(chǎn)品相混合,濃度范圍從1份每十億份(ppb)到25份每百萬(wàn)份(ppm)。優(yōu)選濃度在20ppb-500ppb的范圍內(nèi)。當(dāng)要通過(guò)直接檢測(cè)產(chǎn)品表面上的半抗原標(biāo)記(例如在置于產(chǎn)品表面上的印墨或涂料中)來(lái)測(cè)定半抗原標(biāo)記的情形中,半抗原摻入聚合物中的百分?jǐn)?shù)通常在0.1%-5%(重量)的范圍內(nèi)。在很低的濃度下即ppb范圍內(nèi)檢測(cè)標(biāo)記化合物濃度的能力是本發(fā)明方法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。所以只需使用少量標(biāo)記化合物。根據(jù)另一方面,本發(fā)明提供一種油基產(chǎn)品,它含有1ppb-25ppm的不能用視力檢測(cè)、基本上溶于水的標(biāo)記化合物,標(biāo)記化合物的logP在-2.5至5.0范圍內(nèi)。優(yōu)選的是,一些標(biāo)記包含在化學(xué)產(chǎn)品或化學(xué)組合物中。被標(biāo)記的每種化學(xué)品或組合物中標(biāo)記的濃度比則優(yōu)選為單位比,例如在存在兩種標(biāo)記的情形中,一種標(biāo)記對(duì)另一種標(biāo)記的濃度比可以是1∶1,1∶2,1∶3,1∶4等等。所加入的標(biāo)記化合物的總量是這樣的,即優(yōu)選地以不高于10ppm(重量)的濃度、更優(yōu)選地以不高于100ppb(重量)的濃度加入每種標(biāo)記化合物。在一種實(shí)施方案中,有多種標(biāo)記,它們具有一個(gè)共同部位,它能讓多種標(biāo)記與其結(jié)合,并在相同的特異性結(jié)合體上濃縮,盡管他們?nèi)钥捎煤罄^分析技術(shù)來(lái)區(qū)分。因此,在一些實(shí)施方案中,半抗原標(biāo)記化合物中的至少一種與不影響標(biāo)記化合物與其特異性結(jié)合體結(jié)合的氨基酸、核酸、寡核苷酸或寡肽取代物共價(jià)結(jié)合。這類取代物使各種標(biāo)記化合物更易于用分析技術(shù)如HPLC加以相互區(qū)分。例如,4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸抗原可以與不同長(zhǎng)度的寡肽偶聯(lián),而〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-寡肽用作標(biāo)記。接著,由采用抗〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕抗體的免疫沉淀法從標(biāo)記產(chǎn)品中提取標(biāo)記。然后,免疫沉淀出的標(biāo)記可以采用SDS—PAGE凝膠上的粒析法或采用HPLC法作進(jìn)一步分析。在本發(fā)明的一種應(yīng)用中,用擊打印刷法或非擊打印刷法將半抗原施于表面上。使用特異性結(jié)合對(duì)的另一部分可以將施涂好的半抗原可視化。由于半抗原與印墨不相容要么不具有對(duì)表面的良好粘附性,所以最好以共價(jià)結(jié)合的半抗原-聚合物的方式提供標(biāo)記,其中半抗原與聚合主鏈共價(jià)結(jié)合。半抗原-聚合物可溶于印墨配方中,而且施用之后仍可被檢測(cè)(例如,被特異性結(jié)合對(duì)體識(shí)別)。優(yōu)選地,半抗原-聚合物標(biāo)記很好地粘附于諸如玻璃、塑料、金屬、涂覆包裝、壓敏標(biāo)記、全息圖和聚酯這樣的表面上??蛇x擇地,半抗原標(biāo)記可以摻入涂層中,涂層再涂覆于要標(biāo)記的產(chǎn)品的表面上。典型的涂層包括油漆、清漆、基于塑料或橡膠的涂層,以及本領(lǐng)域中熟知的其它涂層。這些涂層可以施于信用卡、壓敏標(biāo)記、債券標(biāo)記、全息圖、產(chǎn)品包裝或其它可靠的可視標(biāo)記(例如商標(biāo)或標(biāo)識(shí))上。用半抗原標(biāo)記的涂層可以直接施于產(chǎn)品(例如電子設(shè)備、用具、照片、玻璃、金屬和塑料)表面上??梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定產(chǎn)品涂層的樣品來(lái)檢測(cè)涂層中的半抗原標(biāo)記??蛇x擇地,可以用這樣的方法檢測(cè)涂層中的半抗原標(biāo)記,即以一種可逆的、非破壞性的方式、通過(guò)與專門針對(duì)涂層中半抗原標(biāo)記的可檢測(cè)地標(biāo)記的特異性結(jié)合體的反應(yīng),直接測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)品的表面。一旦將半抗原標(biāo)記在產(chǎn)品表面可視化,就可以用本領(lǐng)域中熟知的包括有機(jī)溶劑、高離子鹽緩沖液以及改變pH在內(nèi)的各種方法從半抗原標(biāo)記中離解出特異性結(jié)合體。優(yōu)選地,用一種保持半抗原標(biāo)記完整性的方式進(jìn)行離解,以便將來(lái)的可視化。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中,用合適的共軛化學(xué)法將半抗原與聚合物結(jié)合。將所得的與半抗原反應(yīng)過(guò)的聚合物溶于或懸浮于印墨配方中,可以通過(guò)噴墨印刷法或本領(lǐng)域中熟知的其它印刷法使用該配方。一旦干燥,使用連接到諸如酶、膠乳珠或熒光標(biāo)記這樣的信號(hào)化合物上的特異性結(jié)合對(duì)將半抗原-聚合物顯示出來(lái)。標(biāo)記的檢測(cè)可以定性或定量檢測(cè)產(chǎn)品樣品中的半抗原標(biāo)記。對(duì)產(chǎn)品中半抗原標(biāo)記進(jìn)行定量分析有助于檢測(cè)通過(guò)稀釋真貨而進(jìn)行的產(chǎn)品摻假。半抗原標(biāo)記的定量還可用于估計(jì)流體體系的物理參數(shù)。例如,人們可以標(biāo)記出已知濃度液體(例如水)的已知體積,向未知體積的流體體系中加入這種標(biāo)記的樣品,將標(biāo)記樣品分散于流體體系中,分析流體體系中的樣品,并計(jì)算稀釋效應(yīng)以確定流體體系的體積。可在水介質(zhì)中將標(biāo)記化合物與產(chǎn)品混合,可以直接對(duì)其樣品進(jìn)行針對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)分析。需要的話,可將樣品過(guò)濾以除去固體。另外,可將標(biāo)記化合物置于水溶液中。產(chǎn)生用于測(cè)定水溶液中標(biāo)記化合物的產(chǎn)品樣品通常包括選自下列的一個(gè)或多個(gè)步驟從產(chǎn)品中溶劑萃取標(biāo)記化合物;用水溶劑稀釋產(chǎn)品;過(guò)濾;蒸發(fā);沉淀;以及標(biāo)記化合物的固相萃取,例如用離子交換樹脂、層析法(例如使用硅石)或免疫親和層析法純化標(biāo)記化合物。在標(biāo)記的油基產(chǎn)品情形中,溶劑萃取似乎是必要的。選出的用來(lái)在分析前從產(chǎn)品中萃取標(biāo)記的溶劑當(dāng)然取決于產(chǎn)品和標(biāo)記的性質(zhì)。根據(jù)產(chǎn)品和標(biāo)記的性質(zhì),溶劑通常含有一種或多種下列物質(zhì)水;烴,例如苯、甲苯、二甲苯、己烷、庚烷和辛烷;亞砜,例如二甲亞砜;鹵代烴;氯化了的溶劑,例如氯苯、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳;醚,例如二乙醚、二噁烷和四氫呋喃;酰胺,例如二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺;腈,例如乙腈;醇,例如甲醇、乙醇和丙醇;酯,例如乙酸乙酯;以及酮,例如丙酮。優(yōu)選溶劑含有水和/或一種水溶性有機(jī)溶劑。例如,當(dāng)檢測(cè)用間苯氧基苯甲酸標(biāo)記的潤(rùn)滑油時(shí),適宜的萃取劑是油用稀釋劑如己烷、水溶性有機(jī)溶劑如乙腈和水的混合物??蛇x擇地,萃取劑還可含有緩沖鹽例如Tris緩沖液(Tris〔羥甲基〕氨基甲烷)。優(yōu)選的是,所用溶劑體系可得到直接適用于后繼檢測(cè)分析的萃取于水相中的標(biāo)記化合物。本發(fā)明有助于借助單一標(biāo)記化合物鑒定幾種不同批號(hào)的產(chǎn)品(例如化學(xué)品或化學(xué)組合物)。這是因?yàn)椴煌?hào)中可以采用不同濃度的單一標(biāo)記化合物,確定批號(hào)中標(biāo)記的濃度可鑒定各個(gè)批號(hào)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中,化學(xué)品或組合物中含有多種標(biāo)記半抗原。在此情形中,濃度和標(biāo)記的可能變化增加了,通過(guò)測(cè)定標(biāo)記的相對(duì)濃度可更確切地鑒定批號(hào)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,檢測(cè)前將標(biāo)記半抗原從產(chǎn)品中萃取到溶劑中。在檢測(cè)方法采用特異性結(jié)合體(例如半抗原特異性抗體)的情形中,優(yōu)選溶劑是一種與特異性結(jié)合體相容的溶劑。可選擇地,在萃取劑與特異性結(jié)合體不相容的情形中,在與特異性結(jié)合體結(jié)合之前可用相容溶劑將萃取物稀釋。特異性結(jié)合體是這樣一些分子,它們大體上特異性地結(jié)合標(biāo)記產(chǎn)品樣品中要檢測(cè)的半抗原標(biāo)記。典型的特異性結(jié)合體—半抗原標(biāo)記對(duì)包括,抗體—抗原對(duì)、受體—配體對(duì)(例如激素受體—激素對(duì))、糖類—凝集素對(duì)、親和素—鏈霉親和素對(duì)、或者是其它分子,其作用能通過(guò)特異性的分子內(nèi)相互作用使該對(duì)中第一種分子與第二種分子的結(jié)合基本上是特異性的。優(yōu)選特異性結(jié)合體是一種抗體或其保持抗原特異性結(jié)合的片斷(例如Fab),特別優(yōu)選單克隆抗體。該特異性結(jié)合體或多個(gè)特異性結(jié)合體按照需要結(jié)合到載體如免疫親和柱上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)完成通過(guò)與抗原接觸而進(jìn)行的標(biāo)記半抗原的測(cè)定,盡管也可以采用其它免疫測(cè)定法,這些方法包括酶介導(dǎo)免疫測(cè)定、夾心片式免疫測(cè)定、采用側(cè)流裝置的免疫測(cè)定以及本領(lǐng)域中熟知的其它免疫測(cè)定法。這些測(cè)定法中每一種方法的眾多變化形式在本領(lǐng)域中都是熟知的。例如,夾心片式測(cè)定可以三種不同方式進(jìn)行。首先,樣品接受載體具有一種表面結(jié)合抗體,其特異性地結(jié)合標(biāo)記的非半抗原部分(例如,與半抗原共價(jià)結(jié)合的聚合物、單體或化合物)以捕獲載體上的標(biāo)記。然后檢測(cè)半抗原標(biāo)記的結(jié)合,方法是通過(guò)結(jié)合第二種可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體,這種抗體特異性地結(jié)合半抗原標(biāo)記的半抗原部分。可選擇地,通過(guò)半抗原標(biāo)記與載體表面或載體表面上涂層之間的非特異性相互作用,可以將半抗原標(biāo)記結(jié)合到載體上。例如,通過(guò)半抗原標(biāo)記與載體間的離子相互作用將半抗原標(biāo)記結(jié)合到載體上(例如,在微量滴定板孔中BSA與聚苯乙烯的結(jié)合)。增強(qiáng)這類非特異性相互作用的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(例如,用帶電分子涂覆載體表面以增強(qiáng)與半抗原標(biāo)記的離子相互作用)。在免疫測(cè)定的另一變化形式中,表面結(jié)合抗原可以是專門針對(duì)半抗原標(biāo)記的半抗原的,第二種、可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體也可結(jié)合該半抗原,可以專門針對(duì)相同的半抗原表位或不同的半抗原表位。檢測(cè)測(cè)定的進(jìn)一步變化形式采用一種帶有表面結(jié)合、第一種抗體的樣品接受載體,該抗體結(jié)合標(biāo)記中存在的一種或多種半抗原。通過(guò)可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種抗體(其識(shí)別標(biāo)記中存在的第二種、不同的半抗原)的結(jié)合來(lái)檢測(cè)標(biāo)記與第一種抗體的結(jié)合??捎帽壬ɑ蛘哂每蛇x擇的檢測(cè)方法如化學(xué)發(fā)光法和熒光法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。在標(biāo)記產(chǎn)品含有多種半抗原標(biāo)記的情形中,可用不同標(biāo)記的抗體(它們專門針對(duì)每種特定類型的半抗原)同時(shí)檢測(cè)各種標(biāo)記的存在。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中,半抗原標(biāo)記具有可檢測(cè)的、依賴于濃度的物理特性,例如顏色或熒光。盡管優(yōu)選半抗原標(biāo)記在產(chǎn)品中不能檢測(cè),但是當(dāng)標(biāo)記濃縮至高于產(chǎn)品中標(biāo)記濃度的濃度時(shí),半抗原標(biāo)記的物理特性變得容易檢測(cè)(即物理特性的檢測(cè)依賴于濃度)。所以,這類半抗原標(biāo)記的檢測(cè)是這樣完成的,即例如用沉淀法、免疫沉淀法或本領(lǐng)域中熟知的其它方法從產(chǎn)品中濃縮半抗原標(biāo)記。一般說(shuō)來(lái),與標(biāo)記產(chǎn)品的半抗原濃度相比,半抗原濃度提高至少2倍,優(yōu)選至少約5倍,更優(yōu)選至少約10至10,000倍后,用其物理特性檢測(cè)半抗原標(biāo)記。在可檢測(cè)的、依賴于濃度的物理特性是顏色的情形中,可用直接觀測(cè)法或用分光光度計(jì)檢測(cè)半抗原標(biāo)記的存在。優(yōu)選地,通過(guò)產(chǎn)品樣品與特異性結(jié)合體接觸來(lái)濃縮半抗原標(biāo)記,優(yōu)選特異性結(jié)合體是一種專門針對(duì)半抗原標(biāo)記的抗體??箻?biāo)記抗體可在溶液中,也可以結(jié)合到載體上。產(chǎn)品樣品與抗標(biāo)記抗體共同保溫足夠長(zhǎng)的時(shí)間以形成半抗原標(biāo)記和抗體的免疫復(fù)合物。在抗體存在于溶液中的情形中,濃縮(例如沉淀)免疫復(fù)合物。半抗原標(biāo)記與結(jié)合于載體上的抗體結(jié)合后,或者濃縮抗體—標(biāo)記免疫復(fù)合物之后,半抗原標(biāo)記的物理特性變得更加明顯。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,這類檢測(cè)方法很適于現(xiàn)場(chǎng)操作,因?yàn)闊o(wú)需復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備。檢測(cè)標(biāo)記用半抗原特異性抗體的生產(chǎn)半抗原標(biāo)記是這樣一些分子,它們與載體分子一起使用能產(chǎn)生針對(duì)它們的抗體。用已知方法引發(fā)這類抗體,這些方法使人們能得到專門針對(duì)一種特定半抗原的單克隆抗體或多克隆抗體。抗體是由稱為B淋巴細(xì)胞的抗體產(chǎn)生細(xì)胞對(duì)動(dòng)物體暴露于外源化合物(抗原)之中作出反應(yīng)而在動(dòng)物體中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。用免疫原性化合物對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行過(guò)免疫后,動(dòng)物脾內(nèi)產(chǎn)生了抗體產(chǎn)生細(xì)胞。并非所有化合物都是免疫原性的。一般說(shuō)來(lái),分子量低于2,000的化合物不是免疫原性的。不過(guò),也可以獲得專門針對(duì)這類化合物(稱為半抗原)的抗體,方法是用化學(xué)法使半抗原與一種更大的免疫原性載體如糖或蛋白質(zhì)結(jié)合,并用所得的免疫原性結(jié)合物對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行免疫。在兩步化學(xué)反應(yīng)中采用雙功能分子可以實(shí)現(xiàn)半抗原與免疫原性載體的結(jié)合。這就在半抗原和載體之間提供了手臂,這可以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。為了用化學(xué)法使化合物連接到載體或雙功能分子上,化合物自身應(yīng)該含有一種官能團(tuán)。優(yōu)選的官能團(tuán)有氨基、羥基和羧基。當(dāng)用一種免疫原性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行過(guò)免疫后,刺激了許多種不同的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。由這種應(yīng)答產(chǎn)生的抗體被稱為多克隆抗體。針對(duì)特定化合物而產(chǎn)生的多克隆抗體并非總以相同的特異性結(jié)合該化合物。但是,可能獲得一些抗體,它們總以相同的特異性和親和性結(jié)合一種化合物。這些抗體被稱為單克隆抗體。為獲得這類單克隆抗體,首先要從免疫過(guò)的動(dòng)物的脾中提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。例如,可以用聚乙二醇處理來(lái)完成融合。雜交瘤能象前體抗體產(chǎn)生細(xì)胞那樣產(chǎn)生抗體,不過(guò)是無(wú)限的;它們能在體外連續(xù)生長(zhǎng)。一些適于與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞是本領(lǐng)域熟練人員所熟知、而且容易得到的。合適的、易于得到的骨髓瘤細(xì)胞的一個(gè)例子是PX3—63—AG8—653。例如,這種細(xì)胞可從theAmericanTypeCultureCol-lection,Rockville,Maryland,USA得到,序號(hào)為ATCCCRL1580。一旦抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后,從融合的細(xì)胞中分離出所得雜交瘤細(xì)胞,并通過(guò)重復(fù)進(jìn)行有限稀釋而進(jìn)行克隆。然后檢測(cè)被克隆的雜交瘤以確定哪些在產(chǎn)生所需抗體。例如,可用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)完成這種檢測(cè)。向ELISA檢測(cè)體系加入游離化合物來(lái)估價(jià)對(duì)一種化合物的特異性和親和性,從而評(píng)價(jià)游離化合物對(duì)單克隆抗體與化合物(其結(jié)合到固相上)的結(jié)合的抑制能力。一旦選擇出特定的雜交瘤,就可以用熟知的方法很容易地產(chǎn)生大量單克隆抗體。如需要,可以用酶標(biāo)記這些抗體,例如用辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。生產(chǎn)針對(duì)一種化合物的多克隆抗體和單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟練人員所熟知的。其中描述了這些技術(shù)的文獻(xiàn)的實(shí)例包括MethodsofEnzymologyVolume70andVolume73Immunochem-icalTechniquespartsAandBrespectivelyEditedbyVanVunakis,HandLangone,J.L.,PublishedbyAcademicPress1980(PartA)and1981(PartB),andKohler,G.andMilstein,C,Nature,Vol.265,P.495(1975)。標(biāo)記測(cè)試盒在本發(fā)明的更深入的一方面,為用上述方法標(biāo)記化學(xué)品或化學(xué)組合物和/或鑒定標(biāo)記化學(xué)品或化學(xué)組合物的來(lái)源,提供了一種測(cè)試盒,該測(cè)試盒含有至少一種惰性的標(biāo)記半抗原和各自的特異性結(jié)合體或多個(gè)特異性結(jié)合體。優(yōu)選特異性結(jié)合體與半抗原結(jié)合形成一種免疫結(jié)合對(duì)。根據(jù)本發(fā)明更深入的一個(gè)方面,我們提供了一種測(cè)定盒,用來(lái)檢測(cè)與產(chǎn)品結(jié)合的、不能可見(jiàn)地檢測(cè)的標(biāo)記半抗原的存在,該測(cè)定盒包括提供液體介質(zhì)中該標(biāo)記樣品的工具、包括專門針對(duì)標(biāo)記化合物的抗體在內(nèi)的免疫測(cè)定工具、監(jiān)視免疫測(cè)定的檢測(cè)工具以及將免疫測(cè)定結(jié)果與希望的真貨的結(jié)果作比較的工具。提供液體介質(zhì)中該標(biāo)記樣品的工具可包括將標(biāo)記帶入溶液所需的任何溶劑和/或用來(lái)除去不需要的固體的過(guò)濾工具和/或固相萃取柱(例如,含有離子交換樹脂或象硅石這樣的層析介質(zhì)的柱子)。免疫測(cè)定工具可采用單克隆抗體或多克隆抗體。免疫測(cè)定工具還可包括帶樣品接受區(qū)域的固體或半載體。典型的樣品接受載體包括試管、微量滴定板、浸量尺、膜、測(cè)流裝置(例如,用于小分子(例如成癮藥物)或用于妊娠試驗(yàn)的免疫測(cè)定裝置)、樹脂、PVC或膠乳珠以及硝化纖維素。載體的樣品接受區(qū)域具有表面結(jié)合的捕獲試劑半抗原,它能結(jié)合特異性結(jié)合體(如半抗原特異性抗體)或?qū)iT針對(duì)標(biāo)記的表面結(jié)合抗體。表面結(jié)合半抗原可以只是半抗原自身或者可以是半抗原—蛋白質(zhì)結(jié)合物或能夠給出由特異性結(jié)合體所結(jié)合的半抗原表位的其它半抗原—聚合物。表面結(jié)合特異性結(jié)合體可以具有對(duì)用作(或用于)標(biāo)記的半抗原的結(jié)合特異性(例如,專門針對(duì)半抗原表位的抗體)或者具有對(duì)標(biāo)記的非半抗原部分具有特異性的特異性結(jié)合體(例如,專門針對(duì)與半抗原共價(jià)結(jié)合的聚合物的抗體)。例如,用來(lái)監(jiān)視免疫測(cè)定結(jié)果的檢測(cè)工具可以是產(chǎn)生和/或測(cè)定可見(jiàn)反應(yīng)的工具。所以,檢測(cè)工具可以包括一種酶和這種酶的底物。優(yōu)選的可測(cè)標(biāo)記包括酶(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光劑(例如熒光素)以及發(fā)色團(tuán)(例如染料、有色的膠乳珠、染色顆粒、顏料、金屬溶膠粒子(例如金或銀金屬溶膠粒子)、染料包被的脂質(zhì)體、碳)??蓽y(cè)標(biāo)記可以附于半抗原上、抗半抗原抗體上或者針對(duì)這種抗半抗原抗體的第二種抗體上。用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記的底物的例子有鄰苯二胺二鹽酸化物;AmerliteSignalreagent(可得自AmershamInternationalPLC);對(duì)硝基苯酚磷酸酯;和熒光素酶。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,可以使用外檢測(cè)裝置例如分光光度計(jì)、發(fā)光計(jì)或熒光計(jì)。用這種方法,不僅可以檢測(cè)標(biāo)記化合物的存在,還能確定存在的量,從而給出產(chǎn)品摻假程度的指標(biāo)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案的特征是一種借助半抗原標(biāo)記的依賴于濃度的物理特性定性或定量檢測(cè)半抗原標(biāo)記的測(cè)試盒。該測(cè)試盒包括一種從產(chǎn)品樣品中濃縮半抗原標(biāo)記的工具。可以提供濃縮工具作為帶有專門針對(duì)半抗原標(biāo)記的表面結(jié)合抗體的載體。從樣品中結(jié)合半抗原起到濃縮半抗原的作用,因而有助于檢測(cè)半抗原標(biāo)記的物理特性(例如顏色)。例如,載體可以是微量滴定板孔、試管或免疫親和柱??蛇x擇的是,測(cè)試盒可以包括一種容器,容器含有一種半抗原特異性抗體和一種濃縮(例如免疫沉淀)抗體—半抗原復(fù)合物的工具,復(fù)合物是通過(guò)產(chǎn)品樣品與抗半抗原抗體的接觸而形成的。上述測(cè)試盒還可包括一種將檢測(cè)分析結(jié)果與真貨的所希望的結(jié)果作比較的工具,還包括對(duì)真貨所希望的結(jié)果加以描述的說(shuō)明書(例如,包括比色表、校正表或校正曲線),或者可以包括與標(biāo)記的真貨相同的標(biāo)記材料樣品(將與未知樣品一同分析)。優(yōu)選地,為測(cè)試盒提供一份真貨材料具有的可見(jiàn)獨(dú)特外觀的說(shuō)明。例如,為測(cè)試盒提供一份對(duì)真貨材料帶有的商標(biāo)的說(shuō)明。提供測(cè)試盒形式的測(cè)定工具的能力保證了現(xiàn)場(chǎng)人員(例如,遠(yuǎn)離產(chǎn)品產(chǎn)地條件下的產(chǎn)品銷售者)可以快速檢驗(yàn)產(chǎn)品的真?zhèn)味鵁o(wú)需求助實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。很顯然,由于標(biāo)記化合物以那樣低的濃度存在于標(biāo)記化學(xué)品或組合物中,因此對(duì)沒(méi)注意到加入標(biāo)記的人而言,標(biāo)記的存在不是顯而易見(jiàn)的。另外,對(duì)第三方而言,用常規(guī)技術(shù)鑒定標(biāo)記并在假冒組合物中加入該標(biāo)記都是不容易的。那是因?yàn)闃?biāo)記的分離和濃縮依賴于采用專門針對(duì)標(biāo)記的特異性結(jié)合體,而且不知道標(biāo)記特性的任何人都得不到這種特異性結(jié)合體?,F(xiàn)在將參照下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1制備用作標(biāo)記化合物的PBA(間苯氧基苯甲酸)的蛋白質(zhì)結(jié)合物制備一系列間苯氧基苯甲酸(一種半抗原,下文中稱作‘PBA’)的蛋白質(zhì)結(jié)合物,方法是先用化學(xué)合成法由PBA制備合適的活性衍生物,再用蛋白質(zhì)結(jié)合該衍生物。制備帶14C放射標(biāo)記的衍生物以能夠監(jiān)視后繼的蛋白質(zhì)結(jié)合物從而檢驗(yàn)試劑的去除并計(jì)算蛋白質(zhì)與半抗原的負(fù)荷。i)PBA衍生物的制備間苯氧基苯甲酸在苯中與亞硫酰氯反應(yīng),得到相應(yīng)的苯甲酰氯,其再于氫氧化鈉存在下與4-氨基丁酸反應(yīng),再經(jīng)酸解后得到下式衍生物a)其中R為-(CH2)3COOH。進(jìn)一步制備兩種衍生物,方法是在氫氧化鈉存在下將中間體苯甲酰氯與b)甘氨酸和c)雙甘氨肽反應(yīng),再經(jīng)酸解得到b)其中R為-CH2COOH的式I衍生物和c)其中R為-CH2CONHCO2COOH的式I衍生物。還可以這樣制備式I衍生物,即在含水四氫呋喃中使4-氨基丁酸芐酯與3-(3’-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳化二亞胺反應(yīng)得到式I化合物,其中R為-(CH2)3COOCH2Ph,然后在四氫呋喃中用鈀/炭催化劑氫解,得到衍生物a)。將衍生物轉(zhuǎn)化成它們的鈉鹽(鈉鹽易溶于水),方法是在所加入水和四氫呋喃中加入化學(xué)計(jì)算量的碳酸氫鈉或碳酸鈉直至得到均相溶液,然后蒸發(fā)進(jìn)行干燥。ii)蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備將如上述i)中所制備的鈉鹽形式的每種衍生物溶于水,調(diào)至pH8并冷卻至0℃。將同樣冷卻至0℃的3-(3’-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳化二亞胺溶液加入衍生物鈉鹽中,使其靜置2分鐘以完成異脲羧酸鹽的形成。然后使每種衍生物與溶于蒸餾過(guò)的去離子水中的下列蛋白質(zhì)之一結(jié)合,再進(jìn)行過(guò)濾牛血清蛋白(分子量約68,000)雞γ球蛋白(分子量125,000—750,000)鑰孔血藍(lán)素(分子量3,000,000—7,000,000)攪拌下用1分鐘以上的時(shí)間將溶液加入蛋白質(zhì)中來(lái)進(jìn)行加樣,混合物于5℃保持?jǐn)?shù)小時(shí)以完成結(jié)合過(guò)程。按需要將pH調(diào)至pH8。用pH7.3的磷酸鹽緩沖液將加入的蛋白質(zhì)透析5—7天,每天更換透析液,用14C放射性檢測(cè)確定負(fù)荷量。實(shí)施例2單克隆抗體的制備PBA和牛血清蛋白的結(jié)合物(15摩爾PBA每摩爾蛋白質(zhì))用于制備抗體。以實(shí)施例1(ii)的方法用實(shí)施例1(i)的衍生物a)制備PBA—牛血清蛋白。采用完全弗氏佐劑和PBA結(jié)合物(0.1ml,50μg)的1∶1乳液用皮下法對(duì)六只小鼠(Balb/c,雌性)進(jìn)行免疫。每只動(dòng)物以三周的間隔接受另外三次注射,不過(guò)采用不完全佐劑。在相同規(guī)程下,另外六只動(dòng)物接受更高劑量的結(jié)合物(200μg)。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定12只動(dòng)物的血清樣品與PBA的特異性結(jié)合。從產(chǎn)生最高的抗體血清濃度的動(dòng)物體中取出脾,脾細(xì)胞用于與PX3—63—AG8—653骨髓瘤細(xì)胞(可得自theAmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA,序號(hào)為ATCCCRL1580)融合。雜交瘤細(xì)胞分布于10個(gè)96孔微量滴定板中。細(xì)胞生長(zhǎng)后,用ELISA測(cè)定上清液組織培養(yǎng)物流體中抗體的產(chǎn)生。通過(guò)向測(cè)定體系中加入游離PBA來(lái)評(píng)價(jià)特異性,從而確定其在ELISA法中對(duì)抗體結(jié)合固相PBA靶的抑制作用。使得自幾個(gè)陽(yáng)性孔的細(xì)胞生長(zhǎng)以產(chǎn)生細(xì)胞儲(chǔ)存物,然后用有限稀釋技術(shù)進(jìn)行克隆。細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)后,如上所述檢測(cè)所得上清液,幾個(gè)陽(yáng)性孔中內(nèi)含物生長(zhǎng)并且再進(jìn)行克隆。第二次克隆后,使孔中鑒定為陽(yáng)性的細(xì)胞生長(zhǎng)以產(chǎn)生上清液,上清液中含有的單克隆抗體足以用于初步測(cè)定。為了按介質(zhì)要求產(chǎn)生足夠的單克隆抗體,選擇5個(gè)克隆細(xì)胞雜交瘤以產(chǎn)生富含抗體的腹水液體。10只致敏的雌性Balb/c小鼠每個(gè)雜交瘤,每只小鼠與高達(dá)107的雜交瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)接種。收集腹水液體,混合并深冷貯存。也可以使雜交瘤細(xì)胞在攪拌的組織培養(yǎng)器中體外生長(zhǎng)來(lái)制備抗體??寺〖?xì)胞雜交瘤之一的樣品已保藏于theEuropeanCollectionofAnimalCellCultures(ECACC),PHLSCentreforAppliedMicrobiologyandResearch,ProtonDown,SalisburySP4OJG,UnitedKingdom,witheffectfrom10thJanuary,1989underac-cessionnumber89011001.實(shí)施例3標(biāo)記潤(rùn)滑油的測(cè)定制備一種含有10ppm間苯氧基苯甲酸的標(biāo)記潤(rùn)滑油。制備一系列2ml樣品,樣品中含有不同百分?jǐn)?shù)的標(biāo)記油和未摻假的油。為進(jìn)行測(cè)定,用下述方法從每種油樣中萃取PBA。i)從油中萃取PBA1.要進(jìn)行真?zhèn)螜z測(cè)的油樣置于一個(gè)可密封的容器中。然后將5體積的己烷和0.05MTris/HClpH7.5中的1體積20%乙腈加入油中,密封容器。再將混合物振蕩1分鐘,使所得懸浮液分離。這大約需要30秒。2.用可任意使用的塑料吸移管從已分離的混合物的下相中取出一份等分試樣,加到3mlNH2BondElut柱(一種得自JonesChromatography的離子交換樹脂柱)上。在加壓下使萃取物樣品通過(guò)柱子,再用4×1ml蒸餾水等分試樣洗滌柱子。3.接著用鹽水中的2ml0.05%(v/v)Tween20溶液洗脫柱子。這種溶液除去任何結(jié)合的PBA。然后用下述方法對(duì)每種回收的PBA溶液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)ii)免疫測(cè)定法(同時(shí)用比色方法)1.用實(shí)施例1所述方法制備的固定量的PBA—雞γ球蛋白涂覆塑料孔/管。為完成這種涂覆,將濃度為10μg/ml的測(cè)定過(guò)的100μl結(jié)合物等分試樣置于孔/管中。然后將其在精心控制的溫度下保溫一段固定的時(shí)間,通過(guò)吸附達(dá)到可重復(fù)的涂覆量。涂覆期過(guò)后,洗滌孔并可于4℃下保存。2.在有限量的如實(shí)施例2所述方法制備的特異性單克隆抗體存在下,將待測(cè)的含PBA的溶液置于預(yù)先涂覆過(guò)的孔中。在1∶1000的稀釋率下使用抗體樣品。測(cè)定的基礎(chǔ)是溶液中的PBA和作為結(jié)合物固定于孔表面的PBA與這種抗體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性。在一段固定時(shí)間之后,除去孔中溶液,洗滌孔。洗滌后殘留于孔中的抗體是與固定化PBA結(jié)合的抗體,所以殘留抗體量與先前存在于游離溶液中的PBA量成反比。3.向孔中加入第二種抗體—酶結(jié)合物的溶液。所用的第二種抗體酶結(jié)合物是IgG(連接到兔抗小鼠免疫球蛋白G的堿性磷酸酶,得自ICNBiologicals),稀釋率為1∶1000,用量為每孔100μl。這種結(jié)合物結(jié)合殘留的、結(jié)合到孔中固定化結(jié)合物上的任何初級(jí)抗體。加入過(guò)量的第二種抗體—酶結(jié)合物,再次用洗滌法除去未結(jié)合的材料。洗滌后,孔中第二種抗體—酶結(jié)合物的殘留量與上述步驟2中結(jié)合的初級(jí)抗體量成正比。4.向孔中加入一種含有第二種抗體—酶結(jié)合物的酶底物的溶液,通過(guò)檢測(cè)有色產(chǎn)物的形成測(cè)定存在的酶量。底物為對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(可得自SigmaChemicalCo.,作為Sigma104磷酸酶底物),在10%二乙醇胺緩沖液pH9.8中的濃度為1mg/ml。用垂直束可見(jiàn)光吸收分光光度計(jì)(MR610Microplatereader—Dynatech)在405nm下測(cè)定黃色產(chǎn)物的形成。下表2中給出了兩組含不同百分?jǐn)?shù)標(biāo)記油的油樣的比色測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表示為樣品中標(biāo)記油的百分?jǐn)?shù)。表2樣品號(hào)#12345678910計(jì)算75251000500331001050觀測(cè)4714100050029100042A組觀測(cè)7633930550221183155B組實(shí)施例4測(cè)定盒的裝配及其在標(biāo)記潤(rùn)滑油測(cè)定中的應(yīng)用裝配一種適于對(duì)多達(dá)三種可能的假冒潤(rùn)滑油樣品進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)定盒。該測(cè)定盒包括(1)5個(gè)涂覆有PBA—雞γ球蛋白結(jié)合物的塑料管(按下述方法制備);(2)5個(gè)離子交換樹脂柱(3mlNH2BondElut柱,得自JonesChromatography)(3)體積為5—10ml的萃取劑,由8ml乙烷和0.05MTris/HCl(pH7.5)中的2ml40%乙腈組成;(4)1份含有10ppm間苯氧基苯甲酸的潤(rùn)滑油樣品(代表標(biāo)記的真貨樣品);(5)1份不含間苯氧基苯甲酸的潤(rùn)滑油樣品;(6)在含0.05%(w/v)Tween20(聚氧化乙烯-山梨糖醇酐甘油一桂酸酯,可得自SigmaChemicalCompany.CatalogueNumberP1379)的磷酸鹽緩沖液(PBS,可從Oxoid以片狀形式得到)稀釋了10倍的體積為5—2ml的PBA特異性單克隆抗體;(7)1體積抗體—酶結(jié)合物(含有辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的、針對(duì)小鼠免疫球蛋白的兔免疫球蛋白,可得自DAKOLimited,CatalogueNumberP161);(8)化學(xué)發(fā)光底物(AmerliteSignalReagent,可得自AmershamInternationalPLC,CatalogueNumberLAN4400);(9)洗液,由鹽水中的0.05%Tween20(ST)組成;(10)柱洗液,由蒸餾水組成;以及(11)一份說(shuō)明書。i)涂覆有PBA—雞γ球蛋白結(jié)合物的塑料管的制備用按實(shí)施例1中所述方法制備的固定量的PBA—雞γ球蛋白結(jié)合物涂覆塑料管。為完成這種涂覆,將濃度為20μg/ml的測(cè)定過(guò)的500μl結(jié)合物等分試樣置于管中。然后將其于室溫下溫育3小時(shí),通過(guò)吸附達(dá)到可重復(fù)的涂覆量。如實(shí)施例3中所述,涂覆后,用鹽水/Tween溶液(ST)洗滌管子。干燥并在優(yōu)選的4℃下干燥法保存,直到需用時(shí)為止。ii)用測(cè)定盒測(cè)定標(biāo)記潤(rùn)滑油1.為進(jìn)行測(cè)定,第一步是按生產(chǎn)廠商的說(shuō)明制備化學(xué)發(fā)光底物。2.按實(shí)施例3的方法,用5體積萃取劑和5個(gè)離子交換柱萃取兩份附于測(cè)定盒的潤(rùn)滑油樣品和三份潤(rùn)滑油“未知”樣品。然后用2ml柱洗液等分試樣洗滌柱子。3.再用一份2ml的洗液等分試樣將每個(gè)柱子洗脫至含有體積為2ml的PBA特異性單克隆抗體的小玻璃瓶中。4.再將瓶?jī)?nèi)含物混合,把5個(gè)混合物中每一混合物的至少500μl移入用PBA—雞γ球蛋白結(jié)合物涂覆過(guò)的5個(gè)塑料管中。5分鐘后,傾出管中溶液并用洗液洗滌一次管子。5.向每個(gè)管中加入500μl抗體—酶結(jié)合物溶液。溫育5分鐘后將管內(nèi)含物傾出,用洗液洗滌管子5次。6.再將1ml化學(xué)發(fā)光底物加入管中,2分鐘后按照廠商關(guān)于便攜式電池驅(qū)動(dòng)管式反射閾計(jì)(可得自DynatechLabortoriesLtd.)的使用說(shuō)明測(cè)定光輸出。設(shè)備的讀出是0—999范圍內(nèi)的三位數(shù)。7.用一系列35個(gè)測(cè)試評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性,由兩名操作員進(jìn)行測(cè)定,持續(xù)進(jìn)行4周時(shí)間以上。這一系列實(shí)驗(yàn)的內(nèi)測(cè)定偏差系數(shù)(CV)為9.1%。結(jié)果發(fā)現(xiàn),如果正確進(jìn)行測(cè)定,陽(yáng)性對(duì)照(上限讀數(shù))與陰性對(duì)照(下限讀數(shù))的比值為0.612±0.056(即標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為±1)。對(duì)“未知”油,0.725或更高的值表示是一種“可能的假冒”樣品。實(shí)施例5標(biāo)記汽油的測(cè)定用三種濃度的PBA(10,5和2.5ppm)標(biāo)記13ml加鉛汽油樣品和無(wú)鉛汽油樣品。用Tris緩沖液(2ml,0.05M,pH7.5)對(duì)它們進(jìn)行萃取。如實(shí)施例3中所述測(cè)定萃取物,用未標(biāo)記的汽油萃取物中制備的標(biāo)準(zhǔn)物的校正曲線對(duì)PBA進(jìn)行定量。制備含有放射性標(biāo)記PBA的相應(yīng)樣品,以便能夠測(cè)定萃取效率并比較觀測(cè)值和期望值。結(jié)果示于表3中。表33用未標(biāo)記汽油萃取物校正曲線測(cè)定的水提物的觀測(cè)值與期望值的比較稀釋的稀釋的5ppm10ppm10ppm萃取物5ppm萃取物2.5ppm樣品空白萃取物1∶21∶41∶8萃取物1∶21∶4萃取物加鉛汽油期望值046*2311.55.72311.45.711.4(放射化學(xué))觀測(cè)值0.94722.511.06.42913.55.313.5無(wú)鉛汽油期望值03316.28.14.115.57.73.97.5(放射化學(xué))觀測(cè)值0.94118.57.03.814.56.23.47.6*引用的所有數(shù)值都以ppm為單位。這些結(jié)果說(shuō)明了將PBA從13ml汽油萃取入2mlThis緩沖液中所達(dá)到的濃縮效果,同時(shí)令人信服地說(shuō)明,用免疫測(cè)定法可將PBA標(biāo)記的油與未標(biāo)記的汽油相區(qū)分。實(shí)施例6標(biāo)記藥物的測(cè)定制備含20ppm固體PBA的撲熱息痛(醋氨酚—一種溫和的鎮(zhèn)痛藥和退熱劑)和萘普生(一種非甾族消炎藥)的標(biāo)記樣品。在20ml玻璃瓶中,將每種樣品的部分樣品(1g)加入10mlPBA/Tween(實(shí)施例4中所述)中。類似地制備兩種材料的未標(biāo)記測(cè)定空白物。將瓶子旋轉(zhuǎn)過(guò)夜以使PBA萃取到PBS/Tween中。離心法分離未溶材料后,將上清液樣品等分試樣(250μl)加入250μlPBA特異性抗體中并與實(shí)施例4相似地用測(cè)定盒作分析。從表4所列結(jié)果可以看出,可清楚地區(qū)分標(biāo)記藥物與未標(biāo)記藥物。表4藥物未標(biāo)記的標(biāo)記的比值(%)撲熱息痛4002887239427570377283753782787428120673266203763863037839826767517357694803787946937980平均比值=74S.D.=4.2C.V.=5.7%萘普生5173506850333767355260733132267227918566269220812692047624515364平均比值=71S.D.=5.7C.V=8.0%*所示數(shù)值是從實(shí)施例4中所述管式反射閾計(jì)讀出的。萃取劑和洗脫劑的性質(zhì)可能取決于為示蹤各自底物而選擇的化學(xué)品的性質(zhì)。不過(guò),這里所述結(jié)果表明,向藥物中加入低濃度小有機(jī)分子以及用免疫親和層析法鑒定和區(qū)別不同批號(hào)產(chǎn)品都是可能的。實(shí)施例7標(biāo)記香水的測(cè)定制備含有20ppmPBA的‘科隆香水’樣品。將2ml這種標(biāo)記材料和2ml未標(biāo)記材料置于小玻璃試管中,在平緩的氣流中蒸發(fā)以進(jìn)行初步干燥。將2mlPBA/Tween(實(shí)施例4中所述)加入油性殘留物中,用渦動(dòng)攪拌法將試管內(nèi)含物強(qiáng)烈混合。再將不溶性、比水重的油離心分離,如實(shí)施例6中所述對(duì)上清液的樣品等分試樣進(jìn)行分析。表5中所列結(jié)果表明,標(biāo)記的香水和未標(biāo)記的香水可以清楚地加以區(qū)分。表5香水未標(biāo)記的*標(biāo)記的*比值(%)科隆香水866104128512432965510716722133187101261878219625平均比值=20S.D.=6.2C.V.=31.6%*所示數(shù)值是從實(shí)施例4中所述管式反射閾計(jì)讀出的。作為一種可選方法,用PBS/Tween將標(biāo)記的和未標(biāo)記的科隆香水稀釋10倍,用實(shí)施例6中所述方法直接作分析。結(jié)果列于表6。結(jié)果表明,這種可選方法也可清楚地區(qū)分未標(biāo)記的和標(biāo)記的香水。表6香水未標(biāo)記的*標(biāo)記的*比值(%)科隆香水736499687605226949432466382267704012335838525768352210604843076364042667平均比值=65.4S.D.=4.2C.V.=6.4%實(shí)施例8標(biāo)記飲料的測(cè)定制備含有20ppmPBA的勾兌的威士忌酒樣品。用PBS/Tween將標(biāo)記的威士忌酒和相應(yīng)的未標(biāo)記的威士忌酒樣品稀釋4倍,用實(shí)施例6中所述方法分析樣品等分試樣(250μl)。表7所列結(jié)果表明,可清楚地將標(biāo)記的威士忌酒與未標(biāo)記的威士忌酒加以區(qū)別。表7飲料未標(biāo)記的*標(biāo)記的比值(%)威士忌酒375119313961583938118047449110254351042442710926431952242111628387117304408619412122303861223235310730474115244521062344611125平均比值=28.4S.D.=6.9C.V.=24%*所示結(jié)果得自實(shí)施例4中所述的管式反射閾計(jì)。在本實(shí)施例中注意到,產(chǎn)生的信號(hào)要經(jīng)大約20分鐘才能顯示。實(shí)施例9暗藏的表面標(biāo)記在本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用中,希望用擊打式或非擊打式印刷法將半抗原分子施于表面上。然后可用特異性結(jié)合對(duì)的其它部分使印好的半抗原顯現(xiàn)出來(lái)。由于半抗原要么與印墨配方不相容要么不具有對(duì)表面的良好粘附性質(zhì),所以有時(shí)需要把半抗原結(jié)合到聚合物主鏈上。半抗原—聚合物可溶于印墨配方而且使用時(shí)可被特異性結(jié)合對(duì)體識(shí)別。它應(yīng)該具有對(duì)諸如玻璃、塑料或金屬這樣的表面的良好粘附性質(zhì)。在本方法的一種實(shí)施方案中,通過(guò)適宜的共軛化學(xué)法將半抗原連接到聚合物上。將所得的與半抗原反應(yīng)過(guò)的聚合物溶于或懸浮于印墨配方中,可通過(guò)噴墨印刷、陣列噴射印刷、橡皮版印刷、平版印刷、屏幕印刷、手工印刷或其它常規(guī)印刷法使用這種印墨配方。一旦干燥,可以用連接到諸如酶、膠乳珠或熒光標(biāo)記這樣的信號(hào)化合物上的特異性結(jié)合對(duì)將半抗原—聚合物顯現(xiàn)出來(lái)。半抗原聚合物結(jié)合物不僅可以用于標(biāo)記表面,而且還可以摻入產(chǎn)品(液體或固體)中。下面給出半抗原—聚合物結(jié)合物的一個(gè)具體例子。將1-氨基-4-萘磺酸(ANS)(220mg)和聚丙烯酸(1.4g)溶于HPLC級(jí)水(25ml)中。用一個(gè)多小時(shí)時(shí)間將二甲基氨基丙基-乙基碳化二亞胺(300mg)加入50mg的各份中,每次加入后調(diào)節(jié)pH至5.5(用1M鹽酸)。隨后于室溫下將溶液攪拌過(guò)夜。之后,用HPLC級(jí)水(5次,每次5升)透析反應(yīng)混合物5天多時(shí)間。將透析液冷凍干燥用于貯存。實(shí)施例10制備用來(lái)檢測(cè)半抗原標(biāo)記的免疫親和柱使溴化氰瓊脂糖CL-4B樹脂(PharmaciaLtd)與半抗原特異性單克隆抗體(比例為1ml樹脂2.5mg抗體)反應(yīng)來(lái)制備免疫親和樹脂。在75ml/g的1mMHCl中溶脹,使溴化氰瓊脂糖CL-4B樹脂活化。然后用5ml/g偶聯(lián)緩沖液(100mM碳酸氫鈉,500mM氯化鈉,pH8.3)洗滌樹脂。用PBS把抗體稀釋至1.56mg/ml,再用等體積的偶聯(lián)緩沖液稀釋。將此混合物在室溫、攪拌下與溶脹、洗滌過(guò)的樹脂反應(yīng)1小時(shí)。過(guò)濾出樹脂并與乙醇胺(1M,pH8.0)于室溫下混合。洗滌樹脂并在pH7.4下用含0.05%(w/v)疊氮化鈉的PBS保存樹脂。所得樹脂的等分試樣(0.04ml固定床體積)填充于塑料柱的多孔玻璃料間。檢查這些柱子對(duì)含已知量半抗原標(biāo)記的空白樣品的結(jié)合能力。將空白樣品用于50mlPBS中并用乙腈(2ml)洗脫。用HPLC分析完成對(duì)柱子所截留的半抗原標(biāo)記的定量。實(shí)施例11制備〔4-氨基-1.1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-蛋白質(zhì)結(jié)合物制備下列溶液并冷卻至0℃1)溶于PBS(20ml)中的雞γ球蛋白(CGG)(72mg);2)1MHCl(10.0ml)中標(biāo)有顏色的抗原4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸(ButterfieldLaboratories,King’sLynn,Norfolk)(144mg)的濾液;和3)NO2溶液(10%,50ml)。0℃、快速攪拌下將三種溶液混合。10分鐘后,用蒸餾水(5×5l)將溶液透析大約5天。將上清液冷凍干燥,產(chǎn)品于-20℃貯存。實(shí)施例12制備用于篩選的〔4-氨基-1.1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-DMG-BSA制備DMG—BSA結(jié)合物,方法是向磷酸鹽緩沖液(PBS)(50ml)中的快速攪拌的牛血清蛋白(BSA)(1.0g)溶液中加入3,3-二甲基戊二酸酐(DMG)(1.0g)。監(jiān)視溶液的pH,用加入1M氫氧化鈉的方法連續(xù)調(diào)節(jié)pH至7—8。攪拌的前半小時(shí)之后,每30分鐘檢測(cè)pH。pH變化低于0.2。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。如需要,再次檢查pH并作調(diào)節(jié)。用蒸餾水(5×5l)透析樣品大約5天,冷凍干燥并于-20℃貯存。向1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳化二亞胺)(EDC)(81mg)和DMG—BSA(80mg)在PBS(10.0ml)中的混合物加入4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸(75mg)。室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。用蒸餾水(5×5l)將樣品透析大約5天,冷凍干燥,于-20℃貯存。4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸對(duì)DMG—BSA的結(jié)合物的摻合比為40。實(shí)施例13用〔4-氨基-1.1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-CGG結(jié)合物免疫小鼠以及抗體的篩選在磷酸鹽緩沖液pH7.4(PBS)中,將冷凍干燥的〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-CGG結(jié)合物溶解至2mg/ml,然后與等體積的弗氏佐劑混合。將混合物充分混勻形成穩(wěn)定的懸浮液,直接用于免疫或者使用前于2—8℃貯存。用腹腔注射法對(duì)10只小鼠中每一只進(jìn)行免疫,注射量高達(dá)300μl〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-CGG懸浮液,其含有高達(dá)300μg結(jié)合物。第一次免疫后2—3周,對(duì)小鼠進(jìn)行第二次免疫。第二次免疫兩周后,從每只小鼠取出血清樣品。用滴定ELISA法分析血清樣品以測(cè)定小鼠中循環(huán)抗體的量,從而確定對(duì)結(jié)合物的免疫應(yīng)答的大小。用1μg/ml的〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-BSA結(jié)合物溶液涂覆ELISA板,結(jié)合物是溶于PBS溶液中的,濃度為1μg/ml。一份50μl的結(jié)合物用于涂覆96孔板的每個(gè)孔,為每孔提供50ng結(jié)合物。將一系列稀釋過(guò)的血清樣品加到用〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-BSA涂覆過(guò)的板上。通過(guò)結(jié)合過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的血清抗體。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物使過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的結(jié)合可視化。加入20%(v/v)硫酸終止反應(yīng)。記錄血清樣品的最大稀釋率,該稀釋率下在ELISA中450nm波長(zhǎng)下吸收值至少為0.2個(gè)吸收單位。為估計(jì)循環(huán)抗體的親和力,在采用不同濃度4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中分析血清的亞適稀釋率(如滴定ELISA法測(cè)定的那樣)。加入ELISA板之前,用PBS將4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸溶解至濃度為1mg/ml,再用含1%(w/v)BSA的PBS稀釋至一系列微克濃度。對(duì)每一樣品,確定ELISA中將血清抗體的結(jié)合降低50%所需的4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸濃度(IC50)。再將上述分析結(jié)果用于選擇融合和雜交瘤生產(chǎn)用的小鼠。被認(rèn)為適于融合的小鼠應(yīng)該具有至少為1/10,000的最大滴定度和3μg/ml或更低的IC50。選作融合用的小鼠血清具有1/20,000的最大滴定度和1.3μg/ml的IC50。靜脈接種大約100μl的1mg/ml〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-CGG結(jié)合物,激發(fā)選擇出的小鼠的免疫應(yīng)答。接種前用0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌。靜脈接種三天后進(jìn)行融合。從脾中分離出的細(xì)胞以20∶1的比例與P3X63Ag8.6.5.3.骨髓瘤細(xì)胞系融合。融合產(chǎn)物在含20%(v/v)FCS的HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng),該培養(yǎng)基能使雜交瘤細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。融合混合物分布于20×24孔組織培養(yǎng)板中(480個(gè)2ml培養(yǎng)物)。一份未融合細(xì)胞的樣品用作陰性對(duì)照。培養(yǎng)物在加濕培養(yǎng)箱中于37℃、5%(v/v)CO2中保存,直到可見(jiàn)到雜交瘤細(xì)胞的克隆為止。從每個(gè)2ml培養(yǎng)物(共480個(gè))中取出生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品,在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中檢測(cè)與4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸有親和力的抗體的存在。在BSA中將4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸溶解于至濃度為1mg/ml,用含1%(w/v)卵清蛋白的PBS稀釋至從10μg/ml到1μg/ml的一系列濃度。分析每一融合培養(yǎng)物,方法是,在存在或不存在4-氨基-1,1-偶氮基-3,4-二磺酸溶液的條件下將一份未稀釋的樣品置于用〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-BSA涂覆過(guò)的ELISA板的一個(gè)孔中。所用4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸的濃度為1μg/ml和10μg/ml。本實(shí)施例中,4.3×109個(gè)脾細(xì)胞與2.15×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合,在480個(gè)培養(yǎng)物孔中平均每孔產(chǎn)生6.46個(gè)雜交瘤克隆。在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA篩選中,用4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸選出共35個(gè)融合培養(yǎng)物。為進(jìn)一步發(fā)育而選出的細(xì)胞是那樣一些細(xì)胞,即與不存在4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸的ELISA篩選中吸收值高于1.0的生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品有關(guān)、在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中被0.1mg/ml4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸抑制達(dá)90%以上的細(xì)胞。將得自19個(gè)融合培養(yǎng)物的細(xì)胞重新懸浮,并用有限稀釋法克隆。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液使每ml有6個(gè)活細(xì)胞,使其分布于一個(gè)96孔培養(yǎng)板中,每孔100μl,含有飼養(yǎng)細(xì)胞層。一旦可以見(jiàn)到克隆,用ELISA估計(jì)96個(gè)孔中每個(gè)孔的上清液樣品中能結(jié)合〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-CGG結(jié)合物的抗體的存在。將含有產(chǎn)生一種抗〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕抗體的單一克隆的孔選作單克隆細(xì)胞系。這些細(xì)胞系經(jīng)一系列含脾細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)瓶而在培養(yǎng)物中逐漸擴(kuò)大。克隆擴(kuò)大至10ml培養(yǎng)瓶后,使雜交瘤脫離脾細(xì)胞飼養(yǎng)層。分離出產(chǎn)生抗體的19個(gè)單克隆細(xì)胞系,該抗體在ELISA中與〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-BSA結(jié)合物結(jié)合。將這些細(xì)胞系成功地?cái)U(kuò)大成穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)大過(guò)程中,監(jiān)視培養(yǎng)物的培養(yǎng)基樣品中抗體的產(chǎn)生。如上所述,用滴定ELISA法分析這些樣品。培養(yǎng)基樣品作為一系列5倍稀釋物進(jìn)行分析,確定在ELISA中仍給出顯著顏色的最大稀釋率(最大滴定度)。另外,用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA確定由此細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的親和力。由滴定ELISA選擇出抗體的亞適稀釋率,在不同濃度4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸存在下將其用于ELISA板。確定ELISA中使抗體結(jié)合降低50%的4-氨基-1,l-偶氮苯-3,4-二磺酸濃度(IC50)。根據(jù)培養(yǎng)物中抗體產(chǎn)生量以及抗體對(duì)4-氨基-1,l-偶氮苯-3,4-二磺酸的親和力,選擇出供進(jìn)一步研究的細(xì)胞系4A2E12。4A2E12細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液含有最大滴定度為1/3125、IC50為9ng/ml的抗體。產(chǎn)生一個(gè)主細(xì)胞庫(kù)(MCB),由其產(chǎn)生使用細(xì)胞庫(kù)(WCBs)。使用細(xì)胞庫(kù)作為生產(chǎn)抗體的易得細(xì)胞來(lái)源。制備長(zhǎng)期貯存用的4A2E12細(xì)胞系等分試樣。細(xì)胞在HT+10%(v/v)FCS培養(yǎng)基中擴(kuò)大,用離心法使之沉淀,再懸浮于冷凍培養(yǎng)基中。懸浮液等分于12個(gè)冷凍小瓶中,每瓶至少含有5×108個(gè)活細(xì)胞(由活性染料的排出檢測(cè))。將小瓶密封、絕緣并于約-70℃下貯存7小時(shí)。再將小瓶浸于液氮中長(zhǎng)期貯存。將單獨(dú)一個(gè)瓶中的MCB除去,細(xì)胞于培養(yǎng)物中擴(kuò)大,用與MCB相似的方法將其用于WCB的制備。培養(yǎng)物中殘留的上清液用于建立WCB以便用ELISA分析抗體含量。將單獨(dú)一個(gè)小瓶除去WCB以便進(jìn)行評(píng)價(jià)。從解凍的小瓶中直接取出一份樣品,并于胰蛋白培養(yǎng)基中溫育以便評(píng)價(jià)消毒效果。所剩懸浮液于無(wú)抗生素培養(yǎng)基中擴(kuò)大。除去兩天后,用活性染料的排出評(píng)價(jià)細(xì)胞活性。一份細(xì)胞培養(yǎng)物樣品送至theEuropeancollec-tionofAnimalCellCultures,PortonDown,進(jìn)行支原體污染分析。在此過(guò)程中,監(jiān)視細(xì)胞單克隆化、抗體產(chǎn)率(對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行ELISA分析)和細(xì)胞分裂速率。重復(fù)進(jìn)行上述有限稀釋方法以檢測(cè)4A2E12細(xì)胞系的單克隆化。將細(xì)胞稀釋至每ml6個(gè)活細(xì)胞的濃度,并將細(xì)胞置于5個(gè)含有脾細(xì)胞飼養(yǎng)層的96孔組織培養(yǎng)板中。約2周后,記錄克隆在培養(yǎng)板上的位置。從每個(gè)孔中取出培養(yǎng)基樣品,將樣品加到涂覆有〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-BSA結(jié)合物的ELISA板上。確定克隆的位置與含抗體的孔間的關(guān)系。用ELISA測(cè)定出4A2E12細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液中抗體最大濃度為30μg/ml。從液氮中取出2天后,細(xì)胞94.3%是有活性的。估計(jì)細(xì)胞系的單克隆化為98%,精確度為±9.96%。實(shí)施例144A2E12抗體的批量生產(chǎn)和純化4A2E12細(xì)胞系從含20%(v/v)FCS的HT培養(yǎng)基中隔離至HT培養(yǎng)基+5%(v/v)Nuserum培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)瓶中將培養(yǎng)物在補(bǔ)加有5%(v/v)Nuserum的培養(yǎng)基中擴(kuò)大至大約200ml的體積。培養(yǎng)物在機(jī)械攪拌和回轉(zhuǎn)培養(yǎng)(都運(yùn)用分批加入原理)或者在定軌振蕩器培養(yǎng)(分批培養(yǎng))中生長(zhǎng)。建立這兩種培養(yǎng)體系,方法是從上面制備的三個(gè)200ml瓶培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液。通過(guò)采用蛋白質(zhì)A親和柱的HPLC測(cè)定這些培養(yǎng)物的抗體產(chǎn)率。從不同的培養(yǎng)瓶中收集含抗體培養(yǎng)基,將它們匯集起來(lái),過(guò)濾法(0.2μm)澄清,用截留分子量為20kDa的超濾法濃縮。然后用硫酸銨沉淀法從濃縮物中純化抗體。三個(gè)培養(yǎng)體系中每個(gè)體系的抗體濃度(用蛋白質(zhì)AHPLC測(cè)定)從10μg/ml到1.5mg/ml。認(rèn)為所用培養(yǎng)體系中這樣的抗體產(chǎn)量是令人十分滿意的。實(shí)施例15標(biāo)記聚合物的制備用媒染黃7標(biāo)記的聚烯丙基胺的合成向蒸餾水(100ml)中的聚烯丙基胺(10.0g)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基在碳化二亞胺)(EDC)(5.0g)。強(qiáng)烈攪拌下加入蒸餾水(50ml)中的媒染黃7(20g)懸浮液。室溫下攪拌30分鐘后,加入另一份EDC(5.0g)。將混合物攪拌過(guò)夜。離心(20分鐘,2000轉(zhuǎn)/分鐘)除去殘留固體。用蒸餾水(5×5)透析上清液約5分鐘。然后從透析管中取出樣品,用旋轉(zhuǎn)式汽化器減壓下除去液體。用此法生產(chǎn)共5g半抗原標(biāo)記的聚合物。實(shí)施例16合成以媒染黃7標(biāo)記的酚醛樹脂聚合物制備下列溶液1)75mg/ml三乙胺(1030μl)和四氫呋喃(THF)(8970μl)的溶液;2)100mg/ml異丁基氯甲酸酯(950μl)與THF(9050μl)的溶液;和3)懸浮于THF(100ml)中的媒染黃7(1.3g)溶液。用鹽冰浴冷卻(-5℃)溶液。攪拌下將三乙胺(6250μl)和異丁基氯甲酸酯溶液(6250μl)加入媒染黃7懸浮液中。-5℃下連續(xù)攪拌25分鐘。將溶于33%吡啶/蒸餾水(90ml)中的酚醛樹脂(10.0g)溶液加入混合物中。將反應(yīng)混合物于4—6℃下保持30分鐘,使其升至室溫,攪拌過(guò)夜。樣品用蒸餾水(5×10l)從透析管中透析5天,用旋轉(zhuǎn)式汽化器減壓下干燥。這種方法生產(chǎn)約13g半抗原標(biāo)記聚合物。實(shí)施例17將標(biāo)記聚合物配制成適用于外表面標(biāo)記的印墨如下是用于噴墨印刷機(jī)的典型印墨組成甲基乙基酮或乙醇31%(v/v)丙酮50%(v/v)粘合劑如酚醛樹脂17%(v/v)氯化鈉2%(v/v)將標(biāo)記聚合物以合適的濃度摻入上述組分中,用噴墨印刷機(jī)印刷到表面上。用于噴墨印刷的印墨配方的電導(dǎo)率優(yōu)選為1100微西弗特,粘度優(yōu)選為4厘泊??膳c聚合物混合的其它印墨包括曲面印刷或平版印刷印墨、影印版印墨、凹版印墨以及包括涂料、聚合物膜等在內(nèi)的其它表面涂層。實(shí)施例18將半抗原-聚合物標(biāo)記摻入產(chǎn)品按上面實(shí)施例15或16中所述制備的標(biāo)記化合物與諸如PVC切片或尼龍顆粒這樣的聚合物制品混合。將聚合物熔化,壓擠成門框或窗框形或壓擠成織物。把標(biāo)記物品(或物品的一部分)浸入含特異性結(jié)合體的溶液中,可以檢測(cè)摻入擠壓材料中的半抗原—聚合物標(biāo)記。實(shí)施例19用特異性結(jié)合體的結(jié)合檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中的標(biāo)下列溶液用于檢測(cè)半抗原-聚合物標(biāo)記,這里半抗原是4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸1.0.5%Tween/PBS。2.4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸抗體(純樣品(18.4mg/ml)可用0.5%Tween/PBS稀釋10倍)。3.與過(guò)氧化物酶結(jié)合的兔抗小鼠抗體(用0.5Tween/PBS稀釋10倍)。4.檢測(cè)過(guò)氧化物酶標(biāo)記用的顯色溶液(TMB底物測(cè)試盒(VectorLaboratories;Catno.SK-4400)。進(jìn)行下列步驟,檢測(cè)〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕-聚合物標(biāo)記1.在0.5%Tween/PBS中洗滌樣品;2.樣品在抗〔4-氨基-1,1-偶氮苯-3,4-二磺酸〕抗體溶液中保溫5分鐘。3.在0.5%Tween/PBS中再次洗滌樣品;4.樣品在過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠抗體溶液中保溫5分鐘。5.在0.5%Tween/PBS中洗滌樣品。6.用顯色溶液將樣品顯色直至5分鐘。實(shí)施例20制備半抗原標(biāo)記的功能性單體甲基丙烯酸縮水甘油酯與4-氨基-1-萘磺酸反應(yīng)制備半抗原標(biāo)記的功能性單體。進(jìn)行這種合成,方法是將22.3g4-氨基-1-萘磺酸溶于100g二氯甲烷中并在攪拌下緩慢加入14.2g甲基丙烯酸縮水甘油酯。反應(yīng)完成后,真空汽提除去揮發(fā)性溶劑從而回收半抗原標(biāo)記的單體產(chǎn)物。實(shí)施例21借助半抗原標(biāo)記的功能性單體的聚合制備半抗原標(biāo)記的聚合物標(biāo)記前段中的半抗原標(biāo)記的功能性單體與未標(biāo)記的單體共聚,產(chǎn)生半抗原標(biāo)記聚合物。例如,將100g實(shí)施例20中所述單體加合物和100g甲基丙烯酸甲酯溶于800g丙酮中之后,把溶液加熱至回流。接著向共聚用單體溶液中加入1g過(guò)氧化苯甲酰。使共聚反應(yīng)進(jìn)行完全(6—12小時(shí))。冷卻后回收共聚物,方法是加入足量水以沉淀產(chǎn)品,然后進(jìn)行過(guò)濾、洗滌和干燥。實(shí)施例22用預(yù)先形成的聚合物的衍生作用制備半抗原-聚合物先制備一種未標(biāo)記的共聚物,再將其與合適的半抗原反應(yīng)衍化。例如,如上所述,100g甲基丙烯酸甲酯和100g甲基丙烯酸縮水甘油酯在800g丙酮中共聚,制備一種溶液共聚物。再向共聚物溶液中加入4-氨基-1-萘磺酸,形成半抗原標(biāo)記的聚合物。實(shí)施例14通過(guò)檢測(cè)半抗原的物理特性來(lái)檢測(cè)半抗原標(biāo)記先用溶劑和含水緩中液萃取來(lái)測(cè)定汽油樣品中媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在。將一份含已知量媒染黃7-聚合物標(biāo)記的汽油樣品用作對(duì)照。把萃取物加到含有結(jié)合的抗媒染黃7抗體的免疫親和柱上。接著用蒸餾水洗滌柱子4次。用鹽水中的0.05%(v/v)Tween20溶液從柱上洗脫結(jié)合的媒染黃7-聚合物標(biāo)記。然后將樣品蒸發(fā),與對(duì)照樣品比較檢測(cè)媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在。在樣品中含有媒染黃7-聚合物標(biāo)記的情形中,蒸發(fā)過(guò)的樣品顯出顏色。如需要,用分光光度測(cè)定法分析顏色密度以測(cè)定產(chǎn)品中媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在量。實(shí)施例24通過(guò)檢測(cè)半抗原的物理特性來(lái)檢測(cè)半抗原標(biāo)記如上所述,將一份待測(cè)媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在的汽油樣品進(jìn)行萃取并通過(guò)免疫親和柱。然后將結(jié)合到柱上的樣品級(jí)分洗脫下來(lái)。再用免疫測(cè)定法檢測(cè)媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在。將樣品置于含有表面結(jié)合抗媒染黃7抗體的管中,室溫下保溫5分鐘,再用0.5%Tween/PBS洗滌。把試樣的顏色(媒染黃7-聚合物與測(cè)定管結(jié)合的結(jié)果)與對(duì)照樣品的顏色進(jìn)行比較,以測(cè)定媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在。用分光光度分析測(cè)定樣品中媒染黃7-聚合物標(biāo)記的存在量。參考文獻(xiàn)WollerA.,BidwellD.E.,BartlettA.(1979).TheEnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA).AGuideWithAbstractsofMicroplateApplicationsAvailableFromDynatechEurope,BoroughHosue,RueduPre,Guernsey.其它實(shí)施方案在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種標(biāo)記鑒定用產(chǎn)品的方法,該方法包括,把該產(chǎn)品與含有共價(jià)結(jié)合到一種化合物上的可檢測(cè)半抗原的標(biāo)記結(jié)合起來(lái),該標(biāo)記尚未與產(chǎn)品結(jié)合。2.權(quán)利要求1的方法,其中該化合物選自由農(nóng)藥、藥學(xué)上的副活性化合物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品、工業(yè)化學(xué)品、表面活性劑、粘合劑、食品添加劑以及操作助劑組成的一組。3.權(quán)利要求1的方法,其中該化合物是一種聚合物。4.權(quán)利要求3的方法,其中該聚合物是一種合成聚合物。5.權(quán)利要求3的方法,其中該聚合物選自由肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸組成的一組。6.權(quán)利要求3的方法,其中該標(biāo)記是一種功能性單體的聚合產(chǎn)物,這種功能性單體帶有與其共價(jià)結(jié)合的上述半抗原。7.權(quán)利要求6的方法,其中該功能性單體選自由一種取代苯乙烯和一種丙烯酸單體組成的一組。8.一種標(biāo)記鑒定用產(chǎn)品的方法,該方法包括,把半抗原作為一種標(biāo)記與該產(chǎn)品結(jié)合,其中該半抗原尚未與產(chǎn)品結(jié)合而且具有一種能以依賴于濃度的方式檢測(cè)的物理特性。9.權(quán)利要求1的方法,其中該共價(jià)結(jié)合的半抗原或與該半抗原共價(jià)結(jié)合的化合物具有一種能以依賴于濃度的方式檢測(cè)的物理特性。10.一種檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中標(biāo)記的方法,該標(biāo)記含有一種半抗原或一種與化合物結(jié)合的半抗原,該標(biāo)記具有一種物理特性,其中該物理特性的檢測(cè)依賴于濃度,該方法包括從該產(chǎn)品的樣品中濃縮該標(biāo)記以提供一種能用來(lái)檢測(cè)該物理特性的標(biāo)記濃度。11.權(quán)利要求8或9或10的方法,其中該物理特性是顏色或熒光。12.權(quán)利要求10的方法,其中該濃縮方法是使用免疫沉淀法或免疫親和法。13.權(quán)利要求10的方法,其中濃縮前從該產(chǎn)品中溶劑萃取出該標(biāo)記。14.一種用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中標(biāo)記的測(cè)試盒,該標(biāo)記含有一種半抗原或與一種化合物結(jié)合的半抗原,其中所述半抗原或所述化合物具有一種物理特性,標(biāo)記濃縮至高于該標(biāo)記產(chǎn)品中標(biāo)記濃度的濃度時(shí)該特性是可檢測(cè)的,該測(cè)試盒含有帶專門針對(duì)該半抗原的表面結(jié)合特異性結(jié)合體的樣品接受載體。15.一種標(biāo)記產(chǎn)品,它含有(a)一種與標(biāo)記產(chǎn)品有關(guān)的商品;(b)一種含有半抗原或與一種化合物共價(jià)結(jié)合的半抗原的標(biāo)記,該半抗原或該化合物具有一種物理特性,其中該物理特性的檢測(cè)依賴于濃度,該標(biāo)記沒(méi)有與該產(chǎn)品正常地結(jié)合。16.一種監(jiān)視或示蹤操作助劑或特種添加劑的方法,該方法包括(a)將該助劑或該添加劑與一種標(biāo)記結(jié)合,該標(biāo)記含有一種半抗原或與一種化合物共價(jià)結(jié)合的半抗原,該標(biāo)記尚未與該助劑或添加劑結(jié)合;(b)在采用該助劑或添加劑的過(guò)程或產(chǎn)品中取出一份樣品;(c)將該樣品經(jīng)過(guò)專門針對(duì)該半抗原的免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)該樣品中的標(biāo)記濃度。17.權(quán)利要求16的方法,其中該操作助劑或添加劑選自由生物殺蟲劑、水處理助劑、食品添加劑、塑料添加劑和石油產(chǎn)品添加劑組成的組。18.權(quán)利要求3的方法,其中該標(biāo)記是一種半抗原與一種預(yù)先形成的聚合物共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物。19.權(quán)利要求1的方法,其中該標(biāo)記加入該產(chǎn)品之中。20.權(quán)利要求19的方法,其中該標(biāo)記與該產(chǎn)品混合。21.權(quán)利要求20的方法,其中該產(chǎn)品是一種液體。22.權(quán)利要求21的方法,其中該產(chǎn)品是一種石油產(chǎn)品。23.權(quán)利要求19的方法,其中該產(chǎn)品是一種固體且該半抗原施于產(chǎn)品的表面上。24.權(quán)利要求23的方法,其中該產(chǎn)品表面選自由全息圖、證券標(biāo)記、壓敏標(biāo)記、收縮包裝和可見(jiàn)的真?zhèn)螛?biāo)記組成的組。25.權(quán)利要求23的方法,其中用印刷法將該標(biāo)記施于該產(chǎn)品的表面上。26.權(quán)利要求1的方法,其中該標(biāo)記加到或附于與該產(chǎn)品有關(guān)的標(biāo)簽或包裝上。27.一種標(biāo)記產(chǎn)品,它包括(a)一種與標(biāo)記產(chǎn)品有關(guān)的商品;(b)一種含有與聚合物共價(jià)結(jié)合的半抗原的標(biāo)記,其中該標(biāo)記沒(méi)有與該產(chǎn)品正常地結(jié)合。28.權(quán)利要求27的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該標(biāo)記加入到該產(chǎn)品之中。29.權(quán)利要求28的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該標(biāo)記與該產(chǎn)品結(jié)合。30.權(quán)利要求29的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該產(chǎn)品是一種液體。31.權(quán)利要求30的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該產(chǎn)品是一種石油產(chǎn)品。32.權(quán)利要求28的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該產(chǎn)品是一種固體且該標(biāo)記附于產(chǎn)品的表面上。33.權(quán)利要求32的方法,其中用印刷法將該標(biāo)記附于該產(chǎn)品的表面上。34.權(quán)利要求32的標(biāo)記產(chǎn)品,其中該產(chǎn)品選自由全息圖、證券標(biāo)記、壓敏標(biāo)記和可見(jiàn)的真?zhèn)螛?biāo)記組成的組。35.一種用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中半抗原標(biāo)記的測(cè)試盒,該測(cè)試盒包括(a)一種帶有表面結(jié)合半抗原的樣品接受載體;(b)一種含有專門針對(duì)半抗原的特異性結(jié)合體的容器;以及(c)檢測(cè)該特異性結(jié)合體與該載體結(jié)合的半抗原形成復(fù)合物的檢測(cè)工具。36.權(quán)利要求35的測(cè)試盒,其中該特異性結(jié)合體是一種抗半抗原抗體或其能夠結(jié)合該半抗原的片斷。37.權(quán)利要求35的測(cè)試盒,其中該檢測(cè)工具含有一種可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體,這種抗體特異性結(jié)合該抗半抗原抗體或特異性結(jié)合該半抗原。38.權(quán)利要求37的測(cè)試盒,其中該可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體帶有一種選自酶、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團(tuán)和發(fā)色團(tuán)的標(biāo)記。39.一種用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中半抗原標(biāo)記的測(cè)試盒,該測(cè)試盒包括(a)一種帶有專門針對(duì)半抗原的表面結(jié)合特異性結(jié)合體的樣品接受載體;(b)一種含有可檢測(cè)地標(biāo)記的半抗原的容器;(c)檢測(cè)該特異性結(jié)合體與該可檢測(cè)地標(biāo)記的半抗原形成復(fù)合物的檢測(cè)工具。40.一種用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)品中標(biāo)記的測(cè)試盒,該標(biāo)記含有至少一種與化合物共價(jià)結(jié)合的半抗原,該測(cè)試盒包括(a)一種樣品接受載體,它帶有專門針對(duì)該化合物或?qū)iT針對(duì)該標(biāo)記的半抗原的、表面結(jié)合的第一種特異性結(jié)合體;(b)一種容器,它含有專門針對(duì)該標(biāo)記的半抗原的、可檢測(cè)地標(biāo)記的第二種特異性結(jié)合體。41.權(quán)利要求40的測(cè)試盒,其中所述這些特異性結(jié)合體中至少一種是一種抗體或其保留了對(duì)該標(biāo)記的半抗原的結(jié)合特異性的片斷。42.權(quán)利要求40的測(cè)試盒,其中該標(biāo)記含有互不相同的第一種和第二種半抗原,其中第一種特異性結(jié)合體專門針對(duì)所述第一種半抗原、第二種特異性結(jié)合體專門針對(duì)所述第二種半抗原。43.權(quán)利要求1的方法,其中該標(biāo)記含有至少兩種不同的可檢測(cè)半抗原。全文摘要總的來(lái)說(shuō),本發(fā)明以一種標(biāo)記鑒定用產(chǎn)品的方法為特征,其中,由與一種化合物共價(jià)結(jié)合的低分子量半抗原構(gòu)成的標(biāo)記與產(chǎn)品結(jié)合。這里的標(biāo)記對(duì)產(chǎn)品無(wú)害。對(duì)產(chǎn)品是惰性的,而且尚未與產(chǎn)品結(jié)合。本發(fā)明還以半抗原標(biāo)記為特征,該類標(biāo)記的產(chǎn)生是將半抗原與功能性單體共價(jià)結(jié)合、再將半抗原標(biāo)記的單體聚合形成半抗原標(biāo)記的聚合物。文檔編號(hào)G01N33/28GK1131463SQ94193478公開日1996年9月18日申請(qǐng)日期1994年8月17日優(yōu)先權(quán)日1993年8月20日發(fā)明者R·C·加納,D·J·菲利浦,T·G·威爾金森,F·G·安格拉,E·R·多蘭德,M·W·斯托申請(qǐng)人:博伊科德有限公司
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