專利名稱:用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超薄切片表面處理方法，具體是一種用于原子力顯微鏡納米 定位的超薄切片表面處理方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
超薄切片術(shù)是供透射電子顯微鏡觀察的樣品制備技術(shù)，但近年超薄切片(厚 度一般在50 70 nm)也常用于原子力顯微鏡(AFM)觀察進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)分析和 形態(tài)研究。如1993年Amako等比較分別利用玻璃刀和鉆石刀切得的包埋有細(xì)菌 樣品的片子，發(fā)現(xiàn)后者表面更平整一些，但也只能大致顯示細(xì)菌的輪廓，AFM圖 像的分辨率不夠高，尚無法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分辨。后來1994年Ushiki等在 這方面作了努力，發(fā)展了去包埋劑的方法，使得成像質(zhì)量有所提高。1998年0sada 等則采用了一種電子蝕刻的方法來"減薄"切片，即用高速電子轟擊以去除一部 分包埋介質(zhì)，暴露細(xì)胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，再用AFM就能夠觀察到更多的超微結(jié)構(gòu)。 上述這些方法都只能用于表面結(jié)構(gòu)的分辨和形態(tài)分析，圖像反差不夠理想，不能 用于核內(nèi)的納米定位。因制備超薄切片最初是用于電鏡觀察的，因此制樣過程中 較多地考慮電鏡觀察過程中的一些要求，而并不適合AFM觀察的要求。尤其是在 利用AFM的操縱功能對(duì)超薄切片表面進(jìn)行納米級(jí)的切割和操縱時(shí)，需要首先對(duì)目 標(biāo)部位進(jìn)行精確的定位，所以超薄切片在供AFM觀察時(shí)必須首先具有適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng) 反差的處理，以便于對(duì)目標(biāo)部位進(jìn)行納米級(jí)的定位。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，M. Melling等在《Neurolmage》(神經(jīng)成像) 上發(fā)表的 "Atomic Force Microscopy Imaging of the Human Trigeminal Ganglion"(人三叉神經(jīng)節(jié)的AFM成像)(2001， 14: 1348-1352)和"Morphological study of the healthy human oculomotor nerve by atomic force microscopy" (健康人動(dòng)眼神經(jīng)的AFM形態(tài)學(xué)研究)(2003, 20: 795-801)顯示，針對(duì)未經(jīng)表 面處理的超薄切片，AFM能夠顯示神經(jīng)元或神經(jīng)纖維的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，在切片表面 可以清晰地分辨有髓鞘和無髓鞘的兩種神經(jīng)纖維，以及軸突和雪旺氏細(xì)胞等。其
不足在于未經(jīng)表面處理，對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)構(gòu)分辨不清，AFM無法在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn) 行納米尺度的定位，因此難以進(jìn)行后續(xù)的操縱實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切 片表面處理方法，使其用于增強(qiáng)切片在原子力顯微鏡觀察時(shí)圖像的反差，便于納 米尺度的定位。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟
第一步，將超薄切片完全浸入無水乙醇處理。
所述浸入無水乙醇處理，其時(shí)間為1 min。
所述超薄切片，其厚度在50nm 70nm。
第二步，將第一步得到的切片轉(zhuǎn)入雙氧水處理。
所述轉(zhuǎn)入雙氧水處理，其時(shí)間為10 min 40 min。
所述轉(zhuǎn)入雙氧水處理，其間將溶液輕輕搖晃幾次。
所述雙氧水，其體積濃度為20%。
第三步，將第二步得到的切片轉(zhuǎn)入乙醇清洗。
所述轉(zhuǎn)入乙醇清洗，其時(shí)間為2 min。
所述乙醇，其體積濃度為50%。
第四步，將第三步得到的切片轉(zhuǎn)入無水乙醇處理，取出晾干即成。 所述轉(zhuǎn)入無水乙醇處理，其時(shí)間為1 min。
本發(fā)明這種利用化學(xué)方法進(jìn)行表面處理的原理是采用一定的溶劑去除環(huán)氧 樹脂，同時(shí)盡量不破壞細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)并使之充分暴露。雙氧水是常用的試劑， 價(jià)廉易得，可用于部分去除環(huán)氧樹脂。其反應(yīng)機(jī)制是雙氧水中的過氧化氫分解產(chǎn) 生的活氧分子帶有強(qiáng)氧化性，遇到網(wǎng)絡(luò)狀的環(huán)氧樹脂分子鏈?zhǔn)怪饾u斷裂分解， 于是環(huán)氧樹脂便被慢慢溶去。需要強(qiáng)調(diào)的是，高濃度長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)產(chǎn)生足夠濃度 的活氧分子，會(huì)將環(huán)氧樹脂連帶其中的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)一并氧化去除，所以必須 控制反應(yīng)的濃度和時(shí)間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法僅用到兩種常見試劑，處理方法簡(jiǎn)便易行，任 何人員均能獨(dú)立操作，經(jīng)原子力顯微鏡觀察處理前后的超薄切片表面對(duì)比，發(fā)現(xiàn) 處理后切片在細(xì)胞核部位反差顯著增加，便于納米尺度的定位以及后續(xù)的納米操 縱實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明適合各種類型的超薄切片。


圖1A為本發(fā)明實(shí)施例1中處理得到的切片在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖 像。圖IB為本發(fā)明實(shí)施例1中同一位置在未處理之前的圖像。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中處理得到的切片在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
圖3A為本發(fā)明實(shí)施例3中處理得到的切片在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖 像。圖3B為本發(fā)明實(shí)施例3中同一位置在未處理之前的圖像。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
將云母連帶其上貼附的培養(yǎng)細(xì)胞超薄切片浸入無水乙醇處理1 min，然后轉(zhuǎn) 入20X雙氧水處理40min，再轉(zhuǎn)入50%乙醇清洗2 min，最后再放入無水乙醇處 理l min，取出晾干，用AFM觀察，結(jié)果如圖1A。與處理前(圖1B)相比，可 見圖中細(xì)胞核部位經(jīng)處理后得到突起的核酸樣物質(zhì)(箭頭所示部分)，可用于核 內(nèi)準(zhǔn)確定位，也便于后續(xù)的納米操縱實(shí)驗(yàn)。處理前后相比，高度反差由原來的 30 nm變?yōu)?90咖，增加近二倍。掃描范圍15 umX15 u m。
實(shí)施例2
將云母連帶其上貼附的培養(yǎng)細(xì)胞超薄切片浸入無水乙醇處理1 min，然后轉(zhuǎn) 入20%雙氧水處理10 min，再轉(zhuǎn)入50%乙醇清洗2 min，最后再放入無水乙醇處 理l min，取出晾干，用AFM觀察，結(jié)果如圖2?？梢妶D中細(xì)胞核部位經(jīng)處理后 得到一團(tuán)核酸樣物質(zhì)(箭頭所示部分)，可用于準(zhǔn)確的定位，也便于后續(xù)的納米 操縱實(shí)驗(yàn)。掃描范圍15 umX15 um。
實(shí)施例3
將云母連帶其上貼附的培養(yǎng)細(xì)胞超薄切片浸入無水乙醇處理1 min，然后轉(zhuǎn) 入20X雙氧水處理20min，再轉(zhuǎn)入50%乙醇清洗2 min，最后再放入無水乙醇處 理1 min，取出晾干，用AFM觀察，結(jié)果如圖3A。與處理前(圖3B)相比，可
見圖中細(xì)胞核部位經(jīng)處理后能夠得到突起的核酸樣物質(zhì)(箭頭所示部分)，便于 準(zhǔn)確定位到細(xì)胞核內(nèi)區(qū)域，也便于后續(xù)的納米操縱實(shí)驗(yàn)。處理前后相比，高度反 差由原來的 20 nm變?yōu)?50 nm，增加近1.5倍。掃描范圍30 umX30 u m。
權(quán)利要求
1、一種用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理方法，其特征在于，包括以下步驟
第一步，將切片完全浸入無水乙醇處理；
第二步，將第一步得到的切片轉(zhuǎn)入雙氧水處理；
第三步，將第二步得到的切片轉(zhuǎn)入乙醇清洗；
第四步，將第三步得到的切片轉(zhuǎn)入無水乙醇處理，取出晾干即成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理 方法，其特征是，第一步中，所述浸入無水乙醇處理，其時(shí)間為l min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理 方法，其特征是，第二步中，所述轉(zhuǎn)入雙氧水處理，其時(shí)間為10 min 40 min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
1或3所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面 處理方法，其特征是，第二步中，所述雙氧水，其體積濃度為20%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理 方法，其特征是，第三步中，所述轉(zhuǎn)入乙醇清洗，其時(shí)間為2 min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求
1或5所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面 處理方法，其特征是，第三步中，所述乙醇，其體積濃度為50%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理 方法，其特征是，第四步中，所述轉(zhuǎn)入無水乙醇處理，其時(shí)間為l min。
專利摘要
本發(fā)明公開一種用于原子力顯微鏡納米定位的超薄切片表面處理方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。將超薄切片完全浸入無水乙醇處理，再轉(zhuǎn)入20％雙氧水處理，其間將溶液輕輕搖晃幾次，然后轉(zhuǎn)入50％乙醇清洗，最后將切片轉(zhuǎn)入無水乙醇處理，取出晾干即成。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)便，效果明顯，可廣泛用于各種超薄切片的表面處理，能很好地增強(qiáng)在原子力顯微鏡觀察時(shí)圖像的反差，用于納米尺度的定位。
文檔編號(hào)G01Q30/20GKCN101187605SQ200710172592
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年12月20日
發(fā)明者孫潔林, 彤 季, 波 張, 張曉東, 李鑫輝, 鈞 胡 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan