本申請涉及免疫檢測，尤其涉及一種磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學發(fā)光檢測試劑盒及其使用方法和應用。

背景技術：

1、阿爾茨海默病（alzheimer?disease，ad）俗稱老年癡呆，是最常見的神經系統(tǒng)退行性疾病。在出現ad的臨床癥狀前15~20年，就存在神經病理改變，如腦組織會出現β淀粉樣蛋白（aβ）斑塊、tau蛋白過度磷酸化等，aβ蛋白和tau蛋白的積聚會使神經元功能出現障礙甚至死亡，導致患者記憶等認知功能顯著下降，但這個過程進展極其緩慢，因此將窗口前移，在疾病早期進行準確識別有助于ad的早期干預。

2、目前臨床上對于ad的診斷手段包括量表評估、核磁共振成像（magneticresonance?imaging，mri）、正電子發(fā)射斷層掃描（positron?emission?tomography，pet）以及腦脊液（cerebro-spinal?fluid，csf）檢測等，由于存在客觀性不足、侵入性強、操作繁瑣，價錢昂貴等缺點極大限制了臨床推廣使用，特別是在基層醫(yī)療保健機構中的使用。ad臨床漏診率高達76.8%，難以對ad進行早期篩查和干預。因此，提供一種成本低、創(chuàng)傷性小、檢測便捷、結果可標準化的ad血液標志物的精準檢測成為臨床的迫切需要。

3、p-tau?217是tau蛋白的一種磷酸化形式，主要在tau蛋白的第217位蘇氨酸上發(fā)生磷酸化，在ad患者的臨床前期已經顯著升高，可以更早提示ad的發(fā)生。研究表明，健康人群的血漿中p-tau?217的平均水平大約在0.3至0.4?pg/ml，ad患者中則達到1至2?pg/ml，陽性判斷值在1pg/ml以下。常規(guī)免疫檢測技術通過光、電等檢測手段對試劑體系反應后的整體信號進行檢測，再通過標準曲線信號強度轉換為檢測濃度，但是其檢測限普遍在1至10ng/ml左右，難以達到如此高的靈敏度要求，無法穩(wěn)定檢出血漿中的p-tau?217。單分子免疫陣列（single?molecule?array，simoa）技術是一種數字化檢測技術，通過在磁珠表面形成捕獲抗體-待測抗原-生物素化檢測抗體-親和素偶聯的酶復合物，在結合熒光底物后將磁珠落入陣列化的微孔中進行反應后檢測，其檢測靈敏度相較于elisa和常規(guī)化學發(fā)光檢測法得到了指數級的提升；但檢測操作流程繁瑣復雜、檢測成本極高，極大限制了其臨床推廣使用。

技術實現思路

1、為解決或部分解決相關技術中存在的問題，本申請?zhí)峁┮环N磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學發(fā)光檢測試劑盒及其使用方法和應用，能夠提高發(fā)光微球接收感光微球產生的活性氧的能力，提高活性氧的利用率，提高檢測信號值，從而提升檢測靈敏度，滿足低值樣本血漿中磷酸化tau蛋白p-tau?217的光激化學發(fā)光檢測需求。

2、本申請第一方面提供一種磷酸化tau蛋白p-tau?217的光激化學發(fā)光檢測試劑盒，包括：

3、r1試劑，其包含發(fā)光微球，所述發(fā)光微球包被有能夠與p-tau?217特異性結合的第一抗體，所述第一抗體帶有第一標簽分子；

4、r2試劑，其包含帶第二標簽分子的第二抗體；

5、r3試劑，其包含能夠特異性識別和結合所述第一標簽分子的第一配對分子；

6、所述第一抗體、第二抗體能夠與p-tau?217的不同表位特異性結合，一個所述第一配對分子能夠結合至少兩個第一標簽分子。

7、在一些實施方式中，所述第一標簽分子通過與所述第一抗體共表達連接于所述第一抗體的非特異性結合區(qū)域。

8、在一些實施方式中，所述第一標簽分子選自spy-tag、his-tag、ha-tag、snoop-tag、flag-tag、myc-tag中的一種或多種。

9、在一些實施方式中，所述第一配對分子為多聚catcher，聚合度不低于2；優(yōu)選為八聚體。

10、在一些實施方式中，所述第一配對分子的摩爾量低于或等于所述第一標簽分子摩爾量。優(yōu)選地，所述第一配對分子與所述第一標簽分子的摩爾比為1:(1~16)。

11、在一些實施方式中，所述試劑盒還包括：

12、r4試劑，其包含感光微球以及包被于所述感光微球的能夠與所述第二標簽分子特異性結合的第二配對分子。

13、在一些實施方式中，所述第一標簽分子和第一配對分子、第二標簽分子和第二配對分子分別組成的兩組特異性標簽系統(tǒng)相互不發(fā)生反應。

14、本申請第二方面提供一種如第一方面所述的試劑盒的使用方法，其包括將所述r1試劑、r2試劑、r4試劑與待測樣本混合溫育后，再加入所述r3試劑使至少兩個發(fā)光微球聚集成多聚發(fā)光微球。

15、在一些實施方式中，加入r1、r2試劑后反應時間≥45min；加入r3試劑后反應時間為0~15min。

16、本申請第三方面提供一種試劑盒或其使用方法在檢測血液樣本中p-tau?217的應用。

17、值得注意的是，所述在檢測血液樣本中p-tau?217的應用為非疾病診斷目的的應用。

18、本申請?zhí)峁┑募夹g方案可以包括以下有益效果：通過在發(fā)光微球中引入標簽化后的抗體，并通過添加能夠捕獲該標簽的配對分子，利用配對分子與該標簽之間的特異性反應能夠使反應體系中的游離發(fā)光微球聚集在免疫復合物上，提高感光微球產生的活性氧的利用率，從而提升檢測信號值，整體上提升光激化學發(fā)光檢測性能，滿足低值樣本血液樣本中p-tau?217的光激化學發(fā)光檢測對于靈敏度的檢測需求。而且整個檢測過程不改變常規(guī)檢測順序、不干擾試劑特異性，易操作，檢測成本低、適用范圍廣，具有非常重要的臨床應用價值。

19、應當理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本申請。

技術特征：

1.一種磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標簽分子通過與所述第一抗體共表達連接于所述第一抗體的非特異性結合區(qū)域。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標簽分子選自spy-tag、his-tag、ha-tag、snoop-tag、flag-tag、myc-tag中的一種或多種。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一配對分子為多聚catcher，聚合度不低于2。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一配對分子的摩爾量低于或等于所述第一標簽分子摩爾量。

6.根據權利要求1至5任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包括：

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標簽分子和第一配對分子、第二標簽分子和第二配對分子分別組成的兩組特異性標簽系統(tǒng)相互不發(fā)生反應。

8.如權利要求1至7任一所述試劑盒的使用方法，其特征在于，將所述r1試劑、r2試劑、r4試劑與待測樣本混合溫育后，再加入所述r3試劑使至少兩個發(fā)光微球聚集成多聚發(fā)光微球。

9.根據權利要求8所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，加入r1、r2試劑后反應時間≥45min；加入r3試劑后反應時間為0~15min。

10.如權利要求1至7任一項所述的試劑盒在檢測血液樣本中p-tau?217的應用。

技術總結
本申請涉及一種磷酸化Tau蛋白p?tau?217的光激化學發(fā)光檢測試劑盒及其使用方法和應用。該試劑盒包括R1試劑、R2試劑和R3試劑，R1試劑包含發(fā)光微球以及包被于所述發(fā)光微球的帶第一標簽分子的能夠與p?tau?217特異性結合的第一抗體；R2試劑包含帶第二標簽分子的第二抗體；R3試劑包含能夠與所述第一標簽分子特異性結合的第一配對分子；所述第一抗體、第二抗體能夠與p?tau?217的不同表位特異性結合，一個所述第一配對分子能夠結合至少兩個第一標簽分子。本申請技術方案能夠提高發(fā)光微球接收感光微球產生的活性氧的能力，提升檢測靈敏度，滿足血漿中p?tau?217的光激化學發(fā)光檢測需求。

技術研發(fā)人員：李澤鵬,吳晨,劉宇卉,李臨
受保護的技術使用者：科美博陽診斷技術（上海）有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19