本發(fā)明涉及測試，尤其涉及一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法。

背景技術：

1、恒溫核酸擴增是一種在恒溫條件下進行的核酸擴增技術，它能夠在短時間內完成核酸擴增全過程。恒溫核酸擴增分析儀的光學模塊可以通過定時監(jiān)測待測樣本中光信號的強度變化，實現(xiàn)對反應產(chǎn)物中核酸擴增情況的監(jiān)測，并生成擴增曲線圖，進而可以判斷待測樣本中是否含有對應的核酸片段，并且可以定量待測樣本中初始核酸片段的含量。

2、恒溫核酸擴增分析儀進行一次實驗可實現(xiàn)多樣本多靶標基因的測試，測試通量大，測量通道多。由于不同儀器及不同測量通道間電路參數(shù)、光學參數(shù)及機械裝配存在較大差異，導致不同儀器及不同通道間采集到的熒光信號值會存在較大差異，這是一個無法避免的問題，如果不進行校準，會導致儀器間和儀器通道間即使針對同一管試劑進行測試時，也會得到不同的數(shù)值結果，這對儀器的檢測準確性有著直接的影響。

3、另外，還會出現(xiàn)兩種情況：1.部分通道的檢測值過低，無法測試低濃度樣本，尤其是當核酸還未擴增或者擴增前期，檢測值會被淹沒在背景中，無法檢測出核酸的真實濃度；2.部分通道的檢測值偏高，當核酸在擴增過程中光強值按照指數(shù)倍增大時，檢測結果很快就超過檢測上限，達到飽和，無法測試高濃度樣本的真實濃度。上述情況都會導致儀器無法對擴增過程中指數(shù)增長的光強信號進行完全有效采集，檢測動態(tài)范圍小，儀器的檢測范圍小于實際需要的范圍，導致測量結果失真。

4、因此，針對以上不足，需要提供一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法。

技術實現(xiàn)思路

1、（一）要解決的技術問題

2、本發(fā)明要解決的技術問題是解決不同儀器及不同通道間采集到的熒光信號值不一致的問題。

3、（二）技術方案

4、為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，包括以下步驟：

5、ⅰ.配制若干個梯度的校準溶液，并對校準溶液進行標定；

6、ⅱ.將每個梯度的校準溶液放滿待校準的恒溫核酸擴增分析儀的檢測孔內，通過利用多個濃度溶液的信號值數(shù)據(jù)，在坐標系中使用最小二乘法擬合生成曲線，并獲得擬合關系式：

7、

8、其中，

9、k為光強校準系數(shù)；

10、y為目標光信號數(shù)值；

11、b為常數(shù)；

12、x為采集到的真實光信號數(shù)值；

13、根據(jù)擬合關系式獲得校準參數(shù)并寫入到恒溫核酸擴增分析儀中保存；

14、ⅲ.將每個梯度校準溶液任取一管pcr反應管或該梯度的全部pcr反應管放入恒溫核酸擴增分析儀的檢測孔中進行測試，分析儀根據(jù)各通道檢測的實時光強信號值，按照已保存校準參數(shù)計算出每管實際校準溶液的實際光強值，將每臺儀器內的所有通道的光強值進行重復性、一致性和準確性的性能測試，以使每臺儀器及每個通道間采集到的校準溶液的光強值在允許范圍內，信號檢測范圍達到一致水平，完成校準。

15、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，校準溶液為苯酚紅溶液，校準溶液濃度梯度為2～10個梯度。

16、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，將苯酚紅粉末放入燒杯中，加入少于30ml的純化水，然后使用容量瓶定容到50ml后制成母液，再提取不同量的母液到不同離心管內，每個離心管內加入不同量的純水進行充分溶解混勻獲得不同梯度的校準溶液。

17、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，取不同梯度的不同量的校準溶液加入到若干個pcr反應管中，分別加入40μl的礦物油進行油封以防止溶液揮發(fā)。

18、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，將配制好的各梯度校準溶液分裝至若干個pcr反應管內，并分別放入恒溫核酸擴增分析儀標準機的標準檢測孔中進行重復性、一致性和準確性測試，取每個管多次測量的平均值作為該管的光強值，記錄數(shù)據(jù)以完成標定。

19、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，將配制好的各梯度校準溶液分裝至若干個pcr反應管內，分別在各個梯度校準溶液中任選一管用于校準恒溫核酸擴增分析儀標準機的所有檢測通道，對該管校準溶液進行重復性、一致性和準確性測試，取每個管多次測量的平均值作為該管的光強值，記錄數(shù)據(jù)以完成標定。

20、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，重復性測試包括以下步驟：

21、將不同濃度校準溶液放到恒溫核酸擴增分析儀上采集信號值數(shù)據(jù)，每種濃度選擇同一個測試位，在儀器溫度65℃時每隔30s檢測一次，重復檢測10次，分別獲取各濃度檢測溶液測量結果的平均值和標準差，利用公式計算變異系數(shù)，該計算公式為：

22、

23、其中，

24、為信號測量值的變異系數(shù)；

25、為每種濃度溶液的信號測量值的標準差；

26、為每種濃度溶液的信號測量值的平均值。

27、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，一致性測試包括以下步驟：

28、將不同濃度校準溶液分別放到恒溫核酸擴增分析儀的多個檢測孔內，在儀器溫度達到65℃時每隔30s檢測一次，重復檢測10次，計算每種濃度溶液在每個檢測孔的信號測量值的平均值、計算每種濃度的校準溶液的平均值和計算每種校準溶液的標準差，最終計算每種校準溶液不同管間的變異系數(shù)，具體為：

29、

30、其中，

31、為信號測量值的變異系數(shù)；

32、?為每種濃度溶液的信號測量值的標準差；具體為：

33、

34、?為每種濃度溶液在每個檢測孔的信號測量值的平均值；

35、為每種濃度溶液的信號測量值的平均值；

36、為每種濃度溶液的測試孔數(shù)。

37、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，準確性測試包括以下步驟：

38、將不同濃度校準溶液分別放到恒溫核酸擴增分析儀的多個檢測孔內，在儀器溫度達到65℃時每隔30s檢測一次，重復檢測10次，計算每種濃度溶液在每個檢測孔的信號測量值的平均值，再計算準確度，具體為：

39、

40、其中，

41、為準確度；

42、為每種濃度溶液在每個檢測孔的信號測量值的平均值；

43、為每種濃度溶液對應的目標信號值。

44、作為對本發(fā)明的進一步說明，優(yōu)選地，重復性測試中變異系數(shù)不大于1%，一致性測試中變異系數(shù)不大于2%，準確度測試中偏差百分比不大于3%。

45、（三）有益效果

46、本發(fā)明的上述技術方案具有如下優(yōu)點：

47、本發(fā)明通過設計一種校準方法，可以消除掉由于儀器間或儀器通道間因電路元件（如電阻、電容、led燈、激光燈、光電接收器和放大器等）、光學元件（如導光體、通光孔、透鏡、濾光片等）及機械裝配存在的差異所導致的采集光強數(shù)據(jù)差異，使不同儀器及不同通道間采集到的光強信號值達到一致水平。

技術特征：

1.一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：校準溶液為苯酚紅溶液，校準溶液濃度梯度為2～10個梯度。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：將苯酚紅粉末放入燒杯中，加入少于30ml的純化水，然后使用容量瓶定容到50ml后制成母液，再提取不同量的母液到不同離心管內，每個離心管內加入不同量的純水進行充分溶解混勻獲得不同梯度的校準溶液。

4.根據(jù)權利要求3所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：取不同梯度的不同量的校準溶液加入到若干個pcr反應管中，分別加入40μl的礦物油進行油封以防止溶液揮發(fā)。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：將配制好的各梯度校準溶液分裝至若干個pcr反應管內，并分別放入恒溫核酸擴增分析儀標準機的標準檢測孔中進行重復性、一致性和準確性測試，取每個管多次測量的平均值作為該管的光強值，記錄數(shù)據(jù)以完成標定。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：將配制好的各梯度校準溶液分裝至若干個pcr反應管內，分別在各個梯度校準溶液中任選一管用于校準恒溫核酸擴增分析儀標準機的所有檢測通道，對該管校準溶液進行重復性、一致性和準確性測試，取每個管多次測量的平均值作為該管的光強值，記錄數(shù)據(jù)以完成標定。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：重復性測試包括以下步驟：

8.根據(jù)權利要求7所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：一致性測試包括以下步驟：

9.根據(jù)權利要求8所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：準確性測試包括以下步驟：

10.根據(jù)權利要求9所述的一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，其特征在于：重復性測試中變異系數(shù)不大于1%，一致性測試中變異系數(shù)不大于2%，準確度測試中偏差百分比不大于3%。

技術總結
本發(fā)明涉及一種恒溫核酸擴增分析儀的光強校準方法，涉及測試領域，包括以下步驟：配制若干個梯度的校準溶液，放滿待校準的恒溫核酸擴增分析儀的檢測孔內，利用多個濃度溶液的信號值數(shù)據(jù)，在坐標系中使用最小二乘法獲得擬合關系式：根據(jù)擬合關系式獲得校準參數(shù)；將校準溶液放入恒溫核酸擴增分析儀中進行測試，根據(jù)各通道檢測的實時光強信號值，按照已保存校準參數(shù)計算出每管實際校準溶液的實際光強值，進行重復性、一致性和準確性的性能測試，以使每臺儀器及每個通道間采集到的校準溶液的光強值在允許范圍內，信號檢測范圍達到一致水平完成校準，本發(fā)明具有能夠使不同儀器及不同通道間采集到的光強信號值達到一致水平的優(yōu)點。

技術研發(fā)人員：林霄,王嘉雯,周強,武洪巖,朱程程,宋克清
受保護的技術使用者：北京凡知醫(yī)學科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19