本發(fā)明涉及植物提取領域(ipc分類號：c12p)，尤其涉及一種白及多糖基于nf-κb信號通路的免疫調(diào)節(jié)應用。

背景技術：

1、自然界中天然多糖分布廣泛，越來越多研究表明多糖具備一定的免疫調(diào)節(jié)活性，且天然多糖所具備的其他藥理作用，例如：抗癌抗腫瘤、降低血糖、抗細胞衰老等，這些藥理作用在一定程度上直接或間接的通過免疫調(diào)節(jié)實現(xiàn)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖可以通過刺激生命體體內(nèi)的巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞單獨或共同增殖，釋放細胞炎癥因子等物質激活有機體細胞免疫，從而直接或間接的促進體液免疫運作及生命體組織、器官等的免疫應答，因此，多糖在增強身體對病原體天然免疫機制的同時，也在一定程度上治療了機體的免疫受損。但是，多糖在免疫機制中所發(fā)揮的實效性作用，目前還未明晰。

2、現(xiàn)有技術對免疫機制進行研究發(fā)現(xiàn)，活化后的巨噬細胞主要是通過增加分泌il-6(白介素6)、il-β(白介素β)、tnf-α(腫瘤壞死因子α)、ifn-γ(干擾素γ)等細胞因子，進而調(diào)節(jié)或促進免疫作用的產(chǎn)生。其中il-β、il-6等細胞因子主要參與調(diào)控機體內(nèi)病變細胞如：腫瘤細胞等周邊巨噬細胞的招募直接誘發(fā)細胞免疫應答，或者通過相關細胞因子的表達增強或誘發(fā)機體其它先天免疫和獲得性免疫的同時發(fā)生，因此是宿主防御反應的重要調(diào)節(jié)者；tnf-α具有腫瘤壞死活性的重要宿主調(diào)節(jié)分子的同時，還能在原基礎上進一步活化機體內(nèi)的多種免疫細胞，從而強化機體的免疫應答；ifn是一類可以誘導腫瘤細胞凋亡的糖蛋白，在機體的細胞免疫和體液免疫中起到重要的調(diào)節(jié)作用，而多糖組分可促進巨噬細胞分泌ifn-γ，增強機體的免疫應答。因此，對目標多糖組分干預后的巨噬細胞所產(chǎn)生的相關細胞因子進行檢測，能夠驗證多糖組分的免疫活性。

3、中國專利cn102641284b公開了一種螺旋藻多糖的應用，中國專利cn105535011a公開了一種香菇菌多糖的應用，但是不同來源的多糖仍存在著免疫調(diào)節(jié)活性的差異，現(xiàn)有技術對不同來源的多糖仍處于挖掘探索階段。白及作為一類具有活血止血、生肌促愈的中藥材，其成分中的多糖含量可高達50％以上，但是目前針對于白及多糖的免疫調(diào)節(jié)活性探究極少。中國專利cn110684812a-一種具有免疫活性的白及多糖及其制備方法與應用，該方法采用酶解法提取白及多糖，并驗證了白及多糖對dpph·，abts+·等有一定的清除作用。該方法還研究了不同濃度白及多糖對raw264.7細胞存活率的影響，以及白及多糖誘導raw264.7細胞活化釋放免疫因子tnf-α的分泌量。但是該技術對于白及多糖的免疫活性驗證還非常有限，驗證數(shù)據(jù)較為薄弱，不能夠全面、客觀地反映出白及多糖的免疫機制，準確衡量白及多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。

4、基于此，探究白及中性多糖基于nf-κb信號通路的免疫調(diào)節(jié)活性，為后續(xù)動物體內(nèi)活性研究實驗等提供前期研究基礎和參考依據(jù)，成為本領域亟需解決的技術問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明選取分離純化后的白及(拉丁學名bletilla?striata)多糖組分，一方面基于巨噬細胞raw264.7研究其免疫調(diào)節(jié)活性。具體采用酶聯(lián)免疫試劑盒的方式對目標多糖組分干預后的巨噬細胞所產(chǎn)生的相關細胞因子進行檢測，從而驗證多糖組分的免疫活性。另一方面采用wb(蛋白免疫印跡法)對白及多糖是否產(chǎn)生基于nf-κb的蛋白通過產(chǎn)生免疫抗炎作用進行驗證，為后續(xù)白及-多糖的免疫抗炎作用研究奠定基礎。

2、本發(fā)明提供了一種白及多糖基于nf-κb信號通路的免疫調(diào)節(jié)應用，所述白及多糖應用于nf-κb信號通路中p65、p-p65、p-iκbα、cox-2、inos蛋白表達的調(diào)節(jié)。

3、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖通過水提醇沉法對白及藥材處理獲得。水提醇沉法結合了水提法和醇沉法兩種技術，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)該方法既可以簡便高效地收集到白及多糖，且獲得的白及多糖具有很好的抗炎效果，能夠基于nf-κb信號通路進行免疫調(diào)節(jié)。

4、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞的細胞增值率為90％以上。

5、進一步優(yōu)選的，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞的細胞增值率為110％以上。

6、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞中tnf-α細胞因子的分泌量為700pg/ml以上。

7、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞中inf-γ細胞因子的分泌量為220pg/ml以上。

8、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞中il-6細胞因子的分泌量為100pg/ml以上。

9、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖對raw264.7巨噬細胞進行干預后，raw264.7巨噬細胞中il-β細胞因子的分泌量為65pg/ml以上。

10、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號通路后，通過蛋白質印跡法檢測nf-κb途徑中p-p65的蛋白表達為灰度值1.2以上。

11、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號通路后，通過蛋白質印跡法檢測nf-κb途徑中p-iκbα的蛋白表達為灰度值1.5以上。

12、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號通路后，通過蛋白質印跡法檢測nf-κb途徑中inos的蛋白表達為灰度值1.5以上。

13、在一些優(yōu)選的實施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號通路后，通過蛋白質印跡法檢測nf-κb途徑中cox-2的蛋白表達為灰度值1.0以上。

14、nf-κb是免疫相關通路中最了解的成分之一，其作為一種轉錄因子，由兩個nf-κb單體與抑制性iκb蛋白結合組成。巨噬細胞的刺激導致一系列蛋白水解和磷酸化過程，通過這些過程，nf-κb/iκb復合物發(fā)生了分解，nf-κb遷移到細胞核中，激活促炎介質基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，iκb是調(diào)控炎癥反應的關鍵分子，本實驗采用western?blot等方法，觀察bsp及bsp-2對nf-κb通路中p65、p-p65、iκb(比如p-iκb、p-iκbα)、cox-2、inos等蛋白的影響，從分子層面探討白及多糖抗炎效應的作用機制。

15、本發(fā)明的研究意義還在于，為一些后續(xù)實驗研究提供研究基礎，例如可使用更多方法多維度對白及多糖發(fā)揮免疫抗炎作用進行研究，且加入必要的體內(nèi)研究實驗，還可有針對性的對某一炎癥如：氣道炎等進行體內(nèi)實驗研究，以期進一步驗證其免疫抗炎作用。同時白及多糖組分的體外實驗研究中，還可以進一步補充使用人源相關免疫細胞，為后續(xù)有關藥物的研究開發(fā)奠定基礎，人源的細胞的實驗研究結果對于藥物下一步可能的臨床效用具有不可替代的重要意義。

16、有益效果：

17、本發(fā)明提供一種一種白及多糖基于nf-κb信號通路的免疫調(diào)節(jié)應用，具有以下優(yōu)點：

18、(1)白及作為廣泛使用的傳統(tǒng)中藥材，無論是臨床應用還是科研探索前沿都具有較高熱度。本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)白及多糖發(fā)揮免疫抗炎的作用可能是通過幫助機體及時發(fā)揮或者恢復免疫機能而實現(xiàn)，為后續(xù)白及多糖的有關研究奠定了可靠的理論基礎。

19、(2)本發(fā)明開展了關于白及多糖組分bsp-2的體外研究，主要是通過使用如lps(脂多糖)等物質誘導至巨噬細胞raw264.7活化，之后再與使用了一定濃度多糖組分的實驗組進行對比，從而驗證了白及多糖bsp-2在有機體內(nèi)能發(fā)揮抗炎免疫作用，同時推測其發(fā)揮免疫抗炎作用可能是基于nf-κb信號通路，

20、(3)研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，受到lps刺激后的巨噬細胞所分泌的細胞因子顯著增加，其分泌量與空白組比較具有顯著差異(p<0.05)，而使用bsp和bsp-2的梯度濃度藥物(500、62.52、15.525μg·ml-1)的實驗組均能在一定程度減少細胞炎癥因子的分泌量，且藥物濃度實驗組炎癥因子分泌量與lps組相比具有顯著差異(p<0.05)，體現(xiàn)了白及多糖對免疫細胞的作用顯著。

21、(4)本發(fā)明通過蛋白免疫印跡法初步驗證白及多糖組分bsp-2可通過對nf-κb信號通路途徑中inos、cox-2、p65、p-p65、iκbα和p-iκbα通路蛋白的影響，調(diào)節(jié)促炎因子和抑炎因子的平衡，從而發(fā)揮免疫抗炎作用。

22、(5)中藥多糖通過增強機體免疫能力從而具有一定的抗癌活性，其中巨噬細胞是與中藥多糖發(fā)揮抗腫瘤作用聯(lián)系最為緊密的免疫細胞之一，本發(fā)明確定了白及多糖具備增強機體抗炎免疫作用，在此基礎上能夠進一步探究白及多糖組分對某些癌癥腫瘤是否具備一定抑制作用，從而進一步擴大白及多糖的藥理作用研究。(6)本發(fā)明探究了白及藥材中多糖組分的生物活性和在免疫調(diào)節(jié)作用機制，為白及中活性成分的進一步開發(fā)提供了可行性思路。