本發(fā)明屬于顯微成像，具體為一種流感病毒和細(xì)胞外泌體的識(shí)別方法。

背景技術(shù)：

1、流行性感冒病毒簡稱流感病毒，它分為甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。流感病毒呈球形，新分離的毒株則多呈絲狀，其直徑在80至120納米之間，絲狀流感病毒的長度可達(dá)4000納米。流感病毒結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白以及核心三部分。外泌體是由細(xì)胞分泌到胞外的一類直徑為30-150nm的腔內(nèi)囊泡，由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和mrna等成分構(gòu)成。外泌體是細(xì)胞間交流的重要分子，能夠參與多種生理病理反應(yīng)。

2、由于病毒粒徑與外泌體顆粒相近，通常使用透射電鏡、掃描電鏡等方法觀察和區(qū)分病毒與外泌體。透射電鏡法是把經(jīng)過加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向產(chǎn)生散射作用，樣品中不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)電子散射能力不同，從而形成明暗不同的反差以反映樣品形貌特征。掃描電鏡法是用能量為1-30kv的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。這兩種方法都能直接觀察樣品的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，但是樣品預(yù)處理和制備復(fù)雜，要求較高。

3、原子力納米顯微成像系統(tǒng)具備在不同環(huán)境下對(duì)樣品材料進(jìn)行納米操縱與測量的能力，其獨(dú)特的工作方式?jīng)Q定了它相較于其他納米顯微成像系統(tǒng)具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和卓越的適用性。原子力納米顯微成像的工作原理在于通過光學(xué)放大原理將探針與樣品表面之間的微弱原子力檢測出來，這些信息變化經(jīng)過處理就能獲取樣品表面形貌結(jié)構(gòu)信息和粗糙度信息，分辨率達(dá)到原子級(jí)，在利用原子力探針研究病毒和外泌體樣品的時(shí)候，在獲取病毒以及外泌體高分辨率形貌成像以及結(jié)構(gòu)三維圖像的同時(shí)，還具有無損傷、高靈敏度和實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于流感病毒和細(xì)胞外泌體形貌高度相似，僅用原子力顯微成像進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別率很低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的第一項(xiàng)技術(shù)問題是：目前，采用透射電鏡、掃描電鏡來觀察、區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體的方法涉及復(fù)雜的樣品預(yù)處理和制備過程，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)條件要求較高。

2、本發(fā)明要解決的第二項(xiàng)技術(shù)問題是：由于流感病毒和細(xì)胞外泌體形貌高度相似，僅用原子力顯微成像進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別率很低。

3、為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一種流感病毒和細(xì)胞外泌體的識(shí)別方法，包括以下步驟：

5、s1、制備流感病毒樣品以及細(xì)胞外泌體樣品；

6、s2、將載有云母片的載玻片放在原子力顯微鏡樣品臺(tái)上，基于樣品的物理特性確定納米探針以及測試模式；

7、s3、通過原子力顯微鏡在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)對(duì)流感病毒樣品進(jìn)行測試，得到流感病毒圖像，基于所述流感病毒圖像獲取流感病毒的圖像特性參數(shù)；

8、通過原子力顯微鏡在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞外泌體樣品進(jìn)行掃描，得到細(xì)胞外泌體圖像，基于所述細(xì)胞外泌體圖像獲取細(xì)胞外泌體的圖像特性參數(shù)；

9、s4、將所述流感病毒的圖像特性參數(shù)和所述細(xì)胞外泌體的圖像特性參數(shù)進(jìn)行比對(duì)，再對(duì)圖像進(jìn)行分割和形態(tài)學(xué)調(diào)整，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輔助預(yù)測的圖像分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行識(shí)別，獲得兩種樣品的分析和識(shí)別結(jié)果。

10、作為優(yōu)選，步驟s1中制備流感病毒樣品包括：在云母片背面畫上圓圈，將用50mmnacl溶液修飾的云母片粘在載玻片上，取流感病毒混合物，滴在云母片畫圈位置，靜置1分鐘。

11、作為優(yōu)選，所述流感病毒混合物的體積是1μl。

12、作為優(yōu)選，步驟s1中制備細(xì)胞外泌體樣品包括：在云母片背面畫上圓圈，將用50mmnacl溶液修飾的云母片粘在載玻片上，取細(xì)胞外泌體混合物，滴在云母片畫圈標(biāo)記位置，靜置1分鐘。

13、作為優(yōu)選，所述細(xì)胞外泌體混合物的體積是1μl。

14、作為優(yōu)選，所述納米探針針尖高度為17μm，半徑為＜10nm，彈性系數(shù)40n/m。

15、作為優(yōu)選，所述測試模式包括輕敲模式和qi模式；測試環(huán)境是室溫。

16、作為優(yōu)選，選取的流感病毒測試范圍是10μm×10μm。

17、作為優(yōu)選，選取的細(xì)胞外泌體測試范圍是10μm×10μm。

18、在設(shè)備與耗材方面，本方法主要包括原子力顯微鏡、流感病毒樣品、細(xì)胞外泌體樣品、nacl溶液、新鮮裂解的云母片、載玻片、特定型號(hào)的納米探針等。

19、在本發(fā)明中，原子力顯微鏡的測試模式是氣相下輕敲模式和qi模式，選擇適用于該模式的納米探針進(jìn)行掃描。在50mm?nacl溶液修飾的云母片背面畫上圓圈標(biāo)記，將云母片粘在載玻片上，取流感病毒混合物，體積為1μl，滴在云母片畫圈位置，靜置1分鐘后進(jìn)行測試。在云母片背面畫上圓圈，將云母片粘在載玻片上，取細(xì)胞外泌體混合物，體積為1μl，滴在云母片畫圈位置，云母片表面與外泌體之間的靜電吸附作用可以使外泌體牢固附著，靜置1分鐘后進(jìn)行測試。選取特定型號(hào)的納米探針，選取輕敲模式，獲得樣品的形貌和高度特征；選取qi模式，獲得樣品的粘附力特征。在滴入樣品的范圍內(nèi)下針，下針完成后，選取一定的范圍進(jìn)行掃描，觀察兩種樣品的成像特征，并分析兩種樣品的形貌、高度、粘附力，再對(duì)圖像進(jìn)行分割和形態(tài)學(xué)調(diào)整，并運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輔助預(yù)測的圖像分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行智能識(shí)別。

20、本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于原子力顯微鏡成像技術(shù)的區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體的識(shí)別方法，通過形貌、高度、粘附力等參數(shù)，再對(duì)圖像進(jìn)行分割和形態(tài)學(xué)調(diào)整，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輔助預(yù)測的圖像分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行識(shí)別，能夠智能區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體，在操作上具有高度靈活性，降低了靠專業(yè)人士的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分的依賴性。

21、本發(fā)明利用原子力顯微成像結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輔助預(yù)測的圖像分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法來觀察和區(qū)分病毒與外泌體，具有快速、無損傷、實(shí)時(shí)、定量等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，獲得兩種樣品的分析和識(shí)別結(jié)果，實(shí)現(xiàn)智能區(qū)分，能夠快速檢測和識(shí)別，降低了依靠專業(yè)人士的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分的依賴性，克服了傳統(tǒng)的檢測方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中存在的局限性。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)集中體現(xiàn)在以下方面：

23、(1)結(jié)合原子力顯微成像技術(shù)，通過原子力成像，實(shí)現(xiàn)精確測量，定位精度高，具有快速、無損傷、實(shí)時(shí)、定量等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

24、(2)使用原子力顯微成像技術(shù)區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體，克服了傳統(tǒng)檢測方法時(shí)間長、重復(fù)性低等缺點(diǎn)。

25、(3)使用原子力顯微成像方法區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體，可以檢測活病毒和活外泌體，具有靈敏度高、檢測快速方便等優(yōu)點(diǎn)。

26、(4)使用原子力顯微成像方法檢測流感病毒和細(xì)胞外泌體樣品，可以直觀的得到病毒和外泌體的形貌，能夠提取相關(guān)特征參數(shù)，便于區(qū)分。

27、(5)使用原子力顯微成像方法檢測流感病毒和細(xì)胞外泌體樣品，并對(duì)圖像進(jìn)行分割和形態(tài)學(xué)調(diào)整，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輔助預(yù)測的圖像分析與機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行識(shí)別，能夠智能區(qū)分流感病毒和細(xì)胞外泌體，可以達(dá)到快速檢測和準(zhǔn)確識(shí)別，在操作上具有高度靈活性，能夠大大提高流感病毒和細(xì)胞外泌體的識(shí)別率；并且降低了靠專業(yè)人士的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分的依賴性。