本發(fā)明涉及腫瘤標記物檢測，尤其涉及一種同時測定糖類抗原125和人附睪分泌蛋白4的方法。

背景技術(shù)：

1、糖類抗原125(carbohydrate?antigen?125，ca125)是一種由muc16基因編碼的糖蛋白，最早在卵巢癌組織中經(jīng)卵巢癌125單克隆抗體被檢測出。ca125在正常人體組織中含量較低，在卵巢癌中含量較高，因此，ca125是診斷卵巢癌重要的生物標記物。人附睪分泌蛋白4(human?epididymis?protein?4，he4)是wfdc2基因的分泌性糖蛋白產(chǎn)物。he4在多種腫瘤細胞系包括卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等均有高水平表達，并在卵巢癌患者的血清中檢測到高水平的分泌型he4。研究表明，聯(lián)合檢測血清中he4和ca125可以提高卵巢癌的臨床診斷率，是卵巢良惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷的良好指標。因此，同時檢測人血清中ca125和he4的含量對卵巢癌的早期診斷具有重要意義。目前已報道用于檢測血清中ca125和he4的方法有計算機斷層成像、化學發(fā)光免疫分析法、電化學免疫分析、電化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫吸附試驗和激光誘導擊穿光譜等。上述方法需要專業(yè)人員操作，而且成本昂貴。因此，探索一種簡單、低成本的檢測方法已成為生物標志物研究的重要方向。

2、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively?coupled?plasma?mass?spectrometry，icp-ms)，因其具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬和具有多重分析能力等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于元素標記結(jié)合icp-ms測定rna、dna、蛋白質(zhì)、細胞和病毒等。量子點(quantum?dot，qd)由于其生物相容性良好、在icp-ms中靈敏度高和在生物樣品中背景低等特性，使其在icp-ms免疫分析中得到廣泛關(guān)注。目前研究較多的是以cdse為代表的cde(e＝s、se、te)系列量子點，然而含cd系列量子點的強毒性和對環(huán)境污染問題限制了其在生物學方面的應(yīng)用。

3、氧化鋅量子點(zno?qd)以其低成本、無毒、良好的生物相容性及長期環(huán)境穩(wěn)定性等特性獲得廣泛的關(guān)注。二氧化錫量子點(sno2?qd)由于其卓越的物理和化學穩(wěn)定性、高光敏性和優(yōu)異的電學性能，廣泛應(yīng)用于傳感器、細胞毒性和抗菌活性等方面。zno?qd和sno2qd克服了常用cd系列量子點高毒性缺陷。四氧化三鐵磁納米粒子(magneticnanoparticles，mnps)由于具有超順磁性，使其能將目標分析物從復雜樣品中快速分離。申請人發(fā)現(xiàn)，將氨基功能化四氧化三鐵磁納米粒子用于磁分離，將合成的zno?qd和sno2?qd作為標記探針用于檢測血清中he4和ca125可提高檢測靈敏度。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對以上不足，本發(fā)明提供一種同時測定糖類抗原125和人附睪分泌蛋白4的方法，該方法具有靈敏度高、選擇性好、試劑消耗少的優(yōu)點。具體技術(shù)方案如下：

2、一種同時測定糖類抗原125和人附睪分泌蛋白4的方法，所述測定方法是將雙抗夾心免疫復合物引入icp-ms進行測試，測定金屬元素信號，并根據(jù)金屬元素在單顆粒icp-ms中的信號頻數(shù)與ca125和he4濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線，通過所述工作曲線計算得到ca125和he4的含量；所述雙抗夾心免疫復合物中含有zno?qd和sno2?qd。

3、進一步地，所述雙抗夾心免疫復合物的制備方法包括以下步驟：

4、(1)制備amnps：取四氧化三鐵磁納米粒子分散在乙醇和超純水中，于200w功率下超聲30min，轉(zhuǎn)入三頸燒瓶中，邊攪拌邊加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于50-65℃下加熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，通過外部磁場分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌3-5次，即得所述amnps(氨基修飾的四氧化三鐵磁納米粒子)，干燥，備用；

5、(2)制備zno?qd：先向1mol/l氫氧化鉀的甲醇溶液中逐滴加入0.1mol/l醋酸鋅甲醇溶液，磁力攪拌0.5-2h以控制顆粒的生長，接著再逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，最后加入超純水，發(fā)生溶膠凝膠反應(yīng)，即得所述zno?qd；

6、(3)制備功能化的sno2?qd：取二水氯化亞錫和硫脲，用超純水于200w功率下超聲分散，磁力攪拌24h，在反應(yīng)釜中于150-250℃下反應(yīng)，10000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心15min，棄去上層液，得sno2?qd，將所述sno2?qd加入對氨基苯甲酸的乙醇溶液中，超聲，再置于60℃的熱水浴中反應(yīng)，離心，得到功能化的sno2?qd；

7、(4)制備amnps-ab1：取amnps分散于pbs緩沖溶液(0.01mol/l、ph＝7.4)中，超聲，加入edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)活化后，分別加入ca125-ab1和he4-ab1，攪拌反應(yīng)，磁分離，pbs緩沖溶液洗滌，得所述amnps-ab1；

8、(5)制備ca125-ab2-zno?qd：取所述zno?qd分散在pbs緩沖溶液中，加入edc和nhs，反應(yīng)，離心，棄去上清液，收集下層液，取ca125-ab2加入下層液中，攪拌反應(yīng)；離心，得到所述ca125-ab2-zno?qd；

9、(6)制備he4-ab2-sno2?qd：取所述功能化的sno2?qd分散在pbs緩沖溶液中，加入edc和nhs，反應(yīng)，離心，棄去上清液，收集下層液，移取he4-ab2加入下層液中，攪拌反應(yīng)，離心，得到he4-ab2-sno2?qd；

10、(7)制備雙抗夾心免疫復合物：將ca125和he4加入amnps-ab1中，孵育反應(yīng)后，磁分離，得到amnps-ab1-ca125/he4復合物；分別取所述ca125-ab2-zno?qd和he4-ab2-sno2?qd加入所述amnps-ab1-ca125/he4復合物中，孵育反應(yīng)，形成雙抗夾心amnps-ab1-ca125/he4-ab2-zno?qd/sno2?qd復合物。

11、進一步地，步驟(4)中，所述ca125-ab1、he4-ab1和amnps的體積比為1:1:1-2。

12、進一步地，步驟(7)中，所述ca125、he4和amnps-ab1的體積比為1:1:55-60。

13、進一步地，步驟(7)中，所述ca125-ab2-zno?qd、he4-ab2-sno2?qd和amnps-ab1-ca125/he4復合物的體積比為1:1:2.5-3.5。

14、進一步地，所述金屬元素的信號頻數(shù)(y)與ca125的濃度(x)的線性方程為y＝3.54x+9.22。具體的，是金屬的64zn信號頻數(shù)(y)與ca125的濃度(x)的線性關(guān)系方程為y＝3.54x+9.22。

15、進一步地，所述金屬元素的信號頻數(shù)(y)與he4的濃度(x)的線性方程為y＝5.59x+13.77。具體的，是金屬120sn的信號頻數(shù)(y)與he4的濃度(x)的線性關(guān)系方程為y＝5.59x+13.77。

16、進一步地，所述雙抗夾心免疫復合物引入icp-ms進行測試前先用pbs緩沖溶液進行稀釋。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

18、1、本發(fā)明建立了一種氨基功能化的氧化鋅量子點(zno?qd)和氧化錫量子點(sno2qd)標記抗體結(jié)合磁免疫單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析人血清中卵巢癌生物標記物ca125和he4的新方法。通過合成氨基功能化的四氧化三鐵磁納米粒子結(jié)合ca125和he4一抗用于捕獲ca125和he4抗原，自主合成的zno?qd和sno2?qd分別標記ca125和he4二抗，通過icp-ms測定鋅和錫的信號頻數(shù)從而實現(xiàn)對ca125和he4的定量分析。本發(fā)明檢測方法為ca125和he4的分析提供了有效的新途徑，且檢測方便、迅速，相對于傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析方法有顯著提高，可用于臨床分析。

19、2、本發(fā)明檢測方法選擇性好、靈敏度高，在最佳實驗條件下，ca125和he4的線性范圍分別為0.02-200u/ml和0.02-100ng/ml，檢出限分別為0.004u/ml和0.006ng/ml(3σ)，rsd分別為2.2％和3.5％(n＝6)，能夠滿足實際檢測需求。