本發(fā)明屬于熒光檢測和生物分析領(lǐng)域，具體涉及一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞色素c，英文名稱:cytochrome?c，是一種單鏈血紅素蛋白，廣泛存在于真核生物和一些細(xì)菌中。細(xì)胞色素c是細(xì)胞呼吸鏈的電子傳遞過程中不可缺少的元件，與線粒體內(nèi)膜輕微連接，在氧化磷酸化過程中，在第三復(fù)合物和第四復(fù)合物之間攜帶電子進(jìn)行傳遞，幫助生成atp。細(xì)胞色素c是一種高度可溶性蛋白，結(jié)構(gòu)松散微小，約由100個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為12000da，在水中溶解度可達(dá)到100g/l。它含有一個(gè)血紅素c輔基，通過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的兩個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)，其氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守，確保了其電子傳遞功能的穩(wěn)定性。細(xì)菌生物膜是指微生物群體黏附在供養(yǎng)者表面，依靠自身分泌的多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂類物質(zhì)等，形成無恒定結(jié)構(gòu)的膜樣微生物聚集體。生物膜中的細(xì)胞色素c在細(xì)菌呼吸鏈中可以幫助細(xì)菌的電子傳遞和能量代謝，也可以幫助細(xì)菌調(diào)整代謝，以適應(yīng)生物膜中的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。在生物膜中存在大量活性氧(ros)時(shí)，細(xì)胞色素c可以幫助細(xì)菌中和ros，起到抗氧化防御的作用。同時(shí)細(xì)胞色素c對(duì)于生物膜的形成和維持起到了重要作用。因此，探究生物膜中細(xì)胞色素c的狀態(tài)對(duì)于研究生物膜的功能和生物膜內(nèi)細(xì)菌的凋亡、代謝活動(dòng)具有重要意義。

2、生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c的檢測一般需要特定的樣品制備技術(shù)和檢測技術(shù)，常見方法有共聚焦共振拉曼顯微鏡結(jié)合電化學(xué)技術(shù)、冷凍電鏡，以及質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，但這些技術(shù)存在樣品制備復(fù)雜、掃描速度慢、儀器昂貴、操作復(fù)雜、靈敏度低等問題。近年來興起的微針技術(shù)是一種較新的藥物傳遞和診斷工具，由于其檢測速度快，方便取樣等優(yōu)點(diǎn)逐漸進(jìn)入大家視野。微針常見材料有金屬、硅、聚合物、水凝膠等，其中水凝膠微針由于生物相容性好，溶脹率高，便于制造，可降解等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于藥物傳遞和生物傳感方面。將微針技術(shù)與適配體以及熒光檢測技術(shù)結(jié)合為解決前述問題提供了一種具有前景的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針及其制備方法，meha凝膠做基底，dna/meha凝膠填充針尖，照紫外燈交聯(lián)，低溫干燥完全后得到熒光檢測微針。本發(fā)明制備的熒光檢測微針可以刺入生物膜內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)原位快速檢測細(xì)胞色素c濃度。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，所述制備方法的步驟為：

4、1)將甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸、光引發(fā)劑溶解于tris-hcl緩沖液制成meha凝膠；

5、2)在所述meha凝膠添加dna熒光探針，制成dna/meha凝膠；

6、3)將所述dna/meha凝膠注入pdms材質(zhì)的微針模具中，抽真空；接著注入所述meha凝膠，黑暗環(huán)境中靜置以去除氣泡，用紫外光照射以固化，在干燥箱中黑暗環(huán)境下干燥，待干燥完全后脫模，即得到所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針。

7、其中，所述甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸為透明質(zhì)酸，是甲基丙烯酸酐按重量比1：2混合在水和dmf體系中，室溫條件下連續(xù)攪拌15-20小時(shí)反應(yīng)生成。

8、優(yōu)選的，所述光引發(fā)劑是光引發(fā)劑ingacure?2959。

9、優(yōu)選的，所述meha凝膠為甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸和光引發(fā)劑ingacure?2959按重量比60：1混合在水中，振蕩30-60min溶解，3500-4500rpm離心10-20min得到。

10、其中，所述dna/meha凝膠為所述meha凝膠添加dna熒光探針均勻混合后得到。

11、其中，步驟3)所述紫外光為365nm紫外光。

12、其中，所述dna探針為細(xì)胞色素c適配體兩端添加可互補(bǔ)配對(duì)的dna單鏈，在dna鏈兩端修飾熒光基團(tuán)cy?5和猝滅基團(tuán)bnq-3。

13、其中，所述細(xì)胞色素c適配體為ccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgc。

14、其中，所述互補(bǔ)配對(duì)的dna鏈為aaaaaaaaaaaa和tttttttttttt。

15、其中，所述dna熒光探針序列為5`-aaaaaaaaaaaaccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgctttttttttttt-3`。

16、優(yōu)選的，所述pdms材質(zhì)的微針模具為10x10的針陣列，針尖高度為300μm，針體形狀為圓錐形的pdms模具。

17、本發(fā)明還提供了一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針，以meha凝膠做基底填充物，dna/meha凝膠作為針體填充物，填充微針pdms模具，紫外照燈交聯(lián)，在烘箱中充分干燥后脫模。

18、其中，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針負(fù)載的dna熒光探針序列為5`-aaaaaaaaaaaaccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgctttttttttttt-3`。

19、本發(fā)明還提供一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的應(yīng)用，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針由本發(fā)明提供的制備方法制備而成，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c檢測微針用于生物分析領(lǐng)域。優(yōu)選的，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c檢測微針用于海洋微生物腐蝕中生物膜微環(huán)境檢測。

20、本發(fā)明制備的熒光檢測微針可以刺入生物膜內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)原位快速檢測細(xì)胞色素c濃度。

21、本發(fā)明中采用熒光檢測，適配體和微針技術(shù)相結(jié)合，通過微針精細(xì)的尖端，刺入生物膜內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)生物樣品快速采集和在微針內(nèi)的富集，微針針體內(nèi)負(fù)載的dna探針與生物靶標(biāo)結(jié)合后，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開，通過檢測熒光強(qiáng)度變化，完成信號(hào)檢測，實(shí)現(xiàn)生物膜內(nèi)生物靶標(biāo)的快速原位檢測，且具有良好的生物相容性和特異性，在熒光檢測和生物分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述制備方法的步驟為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸為透明質(zhì)酸，是甲基丙烯酸酐按重量比1：2混合在水和dmf體系中，室溫條件下連續(xù)攪拌15-20小時(shí)反應(yīng)生成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述meha凝膠為甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸和光引發(fā)劑ingacure?2959按重量比60：1混合在水中，振蕩30-60min溶解，3500-4500rpm離心10-20min得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述dna/meha凝膠為所述meha凝膠添加dna熒光探針均勻混合后得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，步驟3)所述紫外光為365nm紫外光。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述dna探針為細(xì)胞色素c適配體兩端添加可互補(bǔ)配對(duì)的dna單鏈，在dna鏈兩端修飾熒光基團(tuán)cy?5和猝滅基團(tuán)bnq-3。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的制備方法，其特征在于，所述dna熒光探針序列為5`-aa?aaaaaaaaaaccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgctttttttttttt-3`。

8.一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針，其特征在于，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針以meha凝膠做基底填充物，dna/meha凝膠作為針體填充物，dna探針負(fù)載于微針針尖內(nèi)，填充微針pdms模具，紫外照燈交聯(lián)，在烘箱中充分干燥后脫模而得。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針，其特征在于，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針負(fù)載的dna熒光探針序列為5`-aaaaaaaaaaaaccgtgtctggggccgaccggcgcatt?gggtacgttgttgctttttttttttt-3`。

10.一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針的應(yīng)用，其特征在于：所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針由權(quán)利要求1～7任一所述的方法制備而成，所述生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c檢測微針用于生物分析領(lǐng)域。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c熒光檢測微針，以MeHA凝膠做基底填充物，DNA/MeHA凝膠作為針體填充物，填充微針PDMS模具，紫外照燈交聯(lián)，在烘箱中充分干燥后脫模。本發(fā)明制備的熒光檢測微針可以刺入生物膜內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)原位快速檢測生物膜內(nèi)細(xì)胞色素c濃度。并且，微針的特異性較好，能夠特異性識(shí)別細(xì)胞色素c并檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：戚鵬,安曉彬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南通中科海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26