本發(fā)明屬于免疫學(xué)與生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域，具體涉及cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記及其在成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、佐劑與細(xì)胞的相互作用以及免疫細(xì)胞的活化激活全身免疫，是疫苗發(fā)揮作用的重要前提。在免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞具有吞噬和清除病原體以及調(diào)節(jié)和維持免疫平衡的能力。此外，它們還負(fù)責(zé)處理和呈現(xiàn)抗原，以引起其他免疫細(xì)胞的激活。

2、巨噬細(xì)胞的吞噬和抗原呈遞能力確保了快速有效的免疫反應(yīng)，提高了疫苗的有效性，并提供了長期保護(hù)。因此，探索疫苗佐劑在巨噬細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過程、分布和信號傳遞，有助于了解和研究巨噬細(xì)胞的吞噬功能，對優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)和提高疫苗接種效果具有重要意義。

3、佐劑是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，與抗原混合或先于抗原注入人體，可以增強(qiáng)人體對抗原的免疫反應(yīng)，或改變免疫反應(yīng)的類型。cpg基序的寡脫氧核苷酸(cpg)，可通過改善抗原呈遞細(xì)胞的抗原攝取，激活抗原呈遞細(xì)胞的功能性成熟，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，從而增加抗原的免疫原性。cpg寡脫氧核苷酸具有穩(wěn)定、低成本、易合成、高效低毒等優(yōu)點(diǎn)，是疫苗研究中應(yīng)用廣泛的佐劑。但是cpg寡脫氧核苷酸易被核酸酶降解，且在近紅外波段的吸收效率和光聲轉(zhuǎn)換效率低，導(dǎo)致產(chǎn)生的光聲信號強(qiáng)度不足，無法實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。

4、光聲成像在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中越來越普遍，可提供解剖、功能和分子信息。該成像方法的原理是當(dāng)脈沖激光照射到生物組織時(shí)，組織內(nèi)部的會(huì)吸收脈沖光的能量，產(chǎn)生瞬時(shí)升溫和膨脹，從而產(chǎn)生超聲波，位于組織表面的超聲換能器接收這些超聲波，并根據(jù)檢測到的光聲信號重建組織內(nèi)部的光能吸收分布的圖像。

5、透射式光聲顯微成像聚焦光學(xué)激發(fā)和聲學(xué)檢測，類似于共聚焦顯微鏡，共聚焦配置最大限度地提高了檢測靈敏度，具有較高的橫向分辨率和豐富的光學(xué)對比度，無損成像特性使其適用于活細(xì)胞和體內(nèi)研究，可以詳細(xì)觀察和記錄細(xì)胞吞噬藥物的全過程，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢細(xì)胞在不同條件下的反應(yīng)，同時(shí)其分辨率能夠在細(xì)胞內(nèi)部研究材料的分布和作用，為深入理解細(xì)胞吞噬機(jī)制、優(yōu)化佐劑設(shè)計(jì)以及推動(dòng)相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的工具。

6、已有很多關(guān)于用熒光染料標(biāo)記并使用激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)實(shí)現(xiàn)長期觀察cpg寡脫氧核苷酸在細(xì)胞的動(dòng)態(tài)成像，然而，長時(shí)間的暴露可能會(huì)引起光漂白和光毒性問題，顯著影響活細(xì)胞成像的治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供一種cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記及其在成像中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供：

4、cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，其制備方法包括如下步驟：

5、1)?將金納米顆粒懸浮于去離子水中，加入硫醇化的cpg寡脫氧核苷酸溶液，振蕩孵育得到混合物s1；

6、2)?向混合物s1中添加磷酸鹽緩沖液，振蕩孵育得到混合物s2；

7、3)?將混合物s2離心得到沉淀物，洗滌去除未結(jié)合的cpg寡脫氧核苷酸，得到cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記。

8、在一些cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記的實(shí)例中，所述cpg寡脫氧核苷酸為b型cpg寡脫氧核苷酸，因其開放的單鏈結(jié)構(gòu)和多個(gè)cpg基序，且易于修飾和功能化，能夠更高效地覆蓋在金納米顆粒表面。

9、在一些cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記的實(shí)例中，金納米顆粒的粒徑為5nm～200nm。金納米顆粒尺寸較小時(shí)，與cpg寡脫氧核苷酸結(jié)合后，容易被細(xì)胞吞噬，且光譜穩(wěn)定在532nm處，容易被激發(fā)。

10、在一些cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記的實(shí)例中，步驟1)中，振蕩孵育的時(shí)間為10～14h；和/或步驟2)中，振蕩孵育的時(shí)間為20～30?h。

11、以上特征在不相沖突的情況下，可以任意組合。

12、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供：

13、本發(fā)明第一個(gè)方面所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記在制備活細(xì)胞光聲顯微成像增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供：

15、一種活細(xì)胞的光聲顯微成像方法，包括如下步驟：

16、將活細(xì)胞固定于共聚焦皿，將單個(gè)細(xì)胞移至視野中央；

17、向共聚焦皿加入本發(fā)明第一個(gè)方面所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，調(diào)整二維振鏡的步距和掃描范圍，光束的掃描范圍覆蓋感興趣的細(xì)胞視野；

18、調(diào)節(jié)納米物鏡位移臺(tái)至校準(zhǔn)后的細(xì)胞層面位置；

19、通過計(jì)算機(jī)給予脈沖光源指令、二維振鏡掃描指令和采集卡采的時(shí)序，處理得到細(xì)胞與cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記的二維分布光聲圖像，重復(fù)得到多張光聲圖像。

20、在一些光聲顯微成像方法的實(shí)例中，脈沖光源的能量為35～45?nj。如若能量過強(qiáng)，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，反之，cpg-au的光聲信號會(huì)顯著降低，成像質(zhì)量變差。

21、在一些光聲顯微成像方法的實(shí)例中，將信號通過小波濾波和svd濾波，再通過最大值投影法將采集的光聲信號重建為光聲圖像。

22、在一些光聲顯微成像方法的實(shí)例中，脈沖光源的輸出波長為532nm。金納米顆粒在532nm附近有較好的吸收峰，經(jīng)過與金納米顆粒的結(jié)合，cpg-au的紫外-可見吸收光譜發(fā)生變化，在532nm處也產(chǎn)生較強(qiáng)的峰值。

23、在一些光聲顯微成像方法的實(shí)例中，所述光聲顯微成像系統(tǒng)包括光源、光路傳輸模塊、激光掃描模塊、信號采集模塊以及數(shù)據(jù)處理模塊，

24、所述光路傳輸模塊用于將激光傳導(dǎo)至激光掃描模塊中；

25、所述激光掃描模塊用于將激光光束以點(diǎn)和線掃描的方式將光束聚焦于目標(biāo)

26、成像區(qū)域；

27、所述信號采集模塊用于采集由激光激發(fā)的光聲信號；

28、所述數(shù)據(jù)處理模塊與信號采集模塊相連接，將采集到的光聲信號進(jìn)行投影重建圖像。

29、本發(fā)明的有益效果是：

30、本發(fā)明一些實(shí)例的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，具體良好的生物相容性，很容易被細(xì)胞內(nèi)吞并產(chǎn)生顯著的免疫刺激作用，其刺激產(chǎn)生地細(xì)胞因子的濃度較裸cpg寡脫氧核苷酸提高了兩個(gè)量級，且顯著高于商品化地載運(yùn)脂質(zhì)體試劑。

31、本發(fā)明一些實(shí)例的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，可以顯著增加光聲信號強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的光聲成像，具有高分辨率、實(shí)時(shí)無損成像、高靈敏度和定量分析的優(yōu)勢，可精確監(jiān)測和研究cpg寡脫氧核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，為免疫學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具，顯著提升了數(shù)據(jù)可靠性和實(shí)驗(yàn)特異性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，其制備方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，其特征在于，所述cpg寡脫氧核苷酸為b型cpg寡脫氧核苷酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，其特征在于，金納米顆粒的粒徑為5nm～200nm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，其特征在于，步驟1)中，振蕩孵育的時(shí)間為10～14?h；和/或步驟2)中，振蕩孵育的時(shí)間為20～30?h。

5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的cpg寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記在制備活細(xì)胞光聲顯微成像增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。

6.一種活細(xì)胞的光聲顯微成像方法，包括如下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的光聲顯微成像方法，其特征在于，脈沖光源的能量為35～45nj。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的光聲顯微成像方法，其特征在于，將信號通過小波濾波和svd濾波，再通過最大值投影法將采集的光聲信號重建為光聲圖像。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的光聲顯微成像方法，其特征在于，脈沖光源的輸出波長為532nm。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的光聲顯微成像方法，其特征在于，所述光聲顯微成像系統(tǒng)包括光源、光路傳輸模塊、激光掃描模塊、信號采集模塊以及數(shù)據(jù)處理模塊，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于免疫學(xué)與生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域，公開了CpG寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記及其在成像中的應(yīng)用。通過將CpG寡脫氧核苷酸偶聯(lián)在金納米顆粒得到CpG寡脫氧核苷酸光聲標(biāo)記，該光聲標(biāo)記具體良好的生物相容性，很容易被細(xì)胞內(nèi)吞并產(chǎn)生顯著的免疫刺激作用，其刺激產(chǎn)生地細(xì)胞因子的濃度較裸CpG寡脫氧核苷酸提高了兩個(gè)量級，且顯著高于商品化地載運(yùn)脂質(zhì)體試劑；可以顯著增加光聲信號強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的光聲成像，具有高分辨率、實(shí)時(shí)無損成像、高靈敏度和定量分析的優(yōu)勢，可精確監(jiān)測和研究CpG寡脫氧核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，為免疫學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具，顯著提升了數(shù)據(jù)可靠性和實(shí)驗(yàn)特異性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：張建,賀鳳冰,劉東,孟凡,張藝晴
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17