本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臧酋猴血型的鑒定方法。

背景技術(shù)：

血型是人類血液的主要特征之一，abo血型抗原廣泛存在于人類紅細(xì)胞和組織中，是最主要的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)。臧酋猴也有abo血型系統(tǒng)，但和人類不同，臧酋猴的abo血型抗原都表達(dá)在組織器官內(nèi)，其外周血紅細(xì)胞上不表達(dá)ab抗原，或是表達(dá)非常弱。這些血型抗體與移植器官上表達(dá)的ab抗原結(jié)合同樣可以造成類似于人類abo血型不合的同種異體器官移植排斥反應(yīng)。

由于臧酋猴的abo血型抗原并不表達(dá)在外周血紅細(xì)胞上，且血漿中的纖維蛋白和人-猴種屬間非特異性抗體都會對部分檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，容易產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，所以臧酋猴的血型鑒定一直都較難。

目前，臧酋猴的血型鑒定方法有：(1)通過傳統(tǒng)試管法抗球蛋白試驗和毛果蕓香堿用藥后唾液的ab抗原鑒定，但這兩種方法不易標(biāo)準(zhǔn)化，認(rèn)為因素較多，容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性，造成血型判斷不能明確或者判斷錯誤。(2)組織切片免疫組織化學(xué)染色法，此方法對動物的損傷較大，一般只用于回顧驗證性研究，不能滿足繁育種群進(jìn)行血型鑒定的要求。(3)卡式凝膠法，該方法成本高，離心需要專用離心機，且專用離心機不能用于其他試管離心，具有一定的局限性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種臧酋猴血型的鑒定方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中成本高，具有局限性，鑒定不準(zhǔn)確，易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種臧酋猴血型的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)采集臧酋猴后肢淺靜脈血置于含多孔棉的容器中，以120-130r/min的轉(zhuǎn)速震蕩10-15min；

(2)吸取步驟(1)處理后的血液置于紅頭采血管中，室溫靜置40-60min，然后置于4℃過夜，再室溫放置30-40min，于3500-6000r/min離心10-15min，吸取上清液；

(3)吸取新鮮的正常人o型血于離心管中，加入9-10倍體積，濃度為0.9％的生理鹽水，輕微搖勻，于1500-2000r/min離心15-20min，棄去上清液，然后用0.9％的生理鹽水清洗沉淀物3-4次；

(4)將步驟(2)所得上清液與步驟(3)所得物按體積比為1:1混合，并于37℃孵育30-40min，再于1300-1500r/min離心8-10min，取上清液；

(5)步驟(4)所得上清液與保護(hù)液按體積比為3-4:1-2混合；其中，保護(hù)液包括5％牛血清蛋白、5％蔗糖、5％pvp和含5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液濃度為5mm，ph值為7.4；

(6)將步驟(5)所得物分別與正常人的a型血紅細(xì)胞和b型血紅細(xì)胞按體積比為1:1混合，輕微搖勻后于1000r/min離心1min，觀察凝集現(xiàn)象。

若只與a型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為b型血；若只與b型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為a型血；若兩種混合條件下均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為o型血；若兩種混合條件下均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為ab型血。

進(jìn)一步地，步驟(1)中離心轉(zhuǎn)速為120r/min，離心時間為15min。

進(jìn)一步地，步驟(2)中室溫靜置60min，然后置于4℃過夜，再室溫放置30min，于3800r/min離心10min。

進(jìn)一步地，步驟(3)中向正常人o型血紅細(xì)胞中加入9倍體積，濃度為0.9％的生理鹽水，輕微搖勻，于1500r/min離心15min。

進(jìn)一步地，步驟(4)中孵育時間為30min，離心速度為1372r/min，離心時間為10min。

進(jìn)一步地，步驟(4)所得上清液與保護(hù)液按體積比為3:1混合。

本發(fā)明提供的臧酋猴血型的鑒定方法，具有以下有益效果：

(1)將采集的血液置于含多孔棉的容器中，可在搖床中不斷震蕩，血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性纖維蛋白時，生成的不溶性纖維蛋白接觸到多孔棉后可被多孔棉吸附，可有效去除纖維蛋白原，避免其對測試結(jié)果的干擾。

(2)將經(jīng)過多孔棉處理后的血液在室溫下靜置，然后再于4℃靜置過夜過夜，最后再放置室溫靜置，接著離心，可有效去除血清中的雜質(zhì)，得到清亮的血清。

(3)清亮血清與o型紅細(xì)胞混合，吸附處理后可消除人-猴種屬間非特異性抗體，同時進(jìn)一步去除纖維蛋白原。

(4)將去除人-猴種屬間非特異性抗體和纖維蛋白原后的上清液經(jīng)保護(hù)液保護(hù)，可增強抗體的活力，再與a型血紅細(xì)胞或b型血紅細(xì)胞混合，可準(zhǔn)確有效的鑒定出血型類型，不會出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題，此外，該方法成本低，對離心不具有局限性。

附圖說明

圖1為顯微鏡下單個紅細(xì)胞圖。

圖2為顯微鏡下紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象圖。

具體實施方式

實施例1

一種臧酋猴血型的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)選取20只臧酋猴，分別采集臧酋猴后肢淺靜脈血置于含多孔棉的容器中，以120r/min的轉(zhuǎn)速震蕩15min；

(2)吸取步驟(1)處理后的血液3ml置于紅頭采血管中，室溫靜置60min，然后置于4℃過夜，再室溫放置30min，于3800r/min離心10min，吸取上清液；

(3)吸取新鮮的正常人o型血于離心管中，加入9倍體積，濃度為0.9％的生理鹽水，輕微搖勻，于1500r/min離心15min，棄去上清液，然后用0.9％的生理鹽水清洗沉淀物3次，在顯微鏡下可觀察到單個紅細(xì)胞，如圖1所示；

(4)將步驟(2)所得上清液與步驟(3)所得物按體積比為1:1混合，并于37℃孵育30min，再于1372r/min離心10min，取上清液；

(5)步驟(4)所得上清液與保護(hù)液按體積比為3:1混合；其中，保護(hù)液包括5％牛血清蛋白、5％蔗糖、5％pvp和含5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液濃度為5mm，ph值為7.4；

(6)將步驟(5)所得物分別與正常人的a型血紅細(xì)胞和b型血紅細(xì)胞按體積比為1:1混合，輕微搖勻后于1000r/min離心1min，觀察凝集現(xiàn)象，可在顯微鏡的低倍鏡下觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，若鏡下出現(xiàn)成塊，顆粒狀或者紅油狀的凝塊，則表明紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集，若鏡下紅細(xì)胞分布均勻，則表明未出現(xiàn)凝集，凝集現(xiàn)象如圖2所示。

若只與a型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為b型血；若只與b型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為a型血；若兩種混合條件下均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為o型血；若兩種混合條件下均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為ab型血。

根據(jù)凝結(jié)現(xiàn)象來判斷臧酋猴最終的血型，由結(jié)果可知，20只臧酋猴中有8只為a型血，由6只為b型血，5只為o型血，1只為ab型血。

實施例2

一種臧酋猴血型的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)選取20只臧酋猴，分別采集臧酋猴后肢淺靜脈血置于含多孔棉的容器中，以120r/min的轉(zhuǎn)速震蕩10min；

(2)吸取步驟(1)處理后的血液3ml置于紅頭采血管中，室溫靜置40min，然后置于4℃過夜，再室溫放置40min，于3500r/min離心15min，吸取上清液；

(3)吸取新鮮的正常人o型血于離心管中，加入10倍體積，濃度為0.9％的生理鹽水，輕微搖勻，于1500r/min離心15min，棄去上清液，然后用0.9％的生理鹽水清洗沉淀物3次；

(4)將步驟(2)所得上清液與步驟(3)所得物按體積比為1:1混合，并于37℃孵育40min，再于1500r/min離心8min，取上清液；

(5)步驟(4)所得上清液與保護(hù)液按體積比為4:1混合；其中，保護(hù)液包括5％牛血清蛋白、5％蔗糖、5％pvp和含5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液濃度為5mm，ph值為7.4；

(6)將步驟(5)所得物分別與正常人的a型血紅細(xì)胞和b型血紅細(xì)胞按體積比為1:1混合，輕微搖勻后于1000r/min離心1min，觀察凝集現(xiàn)象。

若只與a型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為b型血；若只與b型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為a型血；若兩種混合條件下均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為o型血；若兩種混合條件下均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為ab型血。

根據(jù)凝結(jié)現(xiàn)象來判斷臧酋猴最終的血型，由結(jié)果可知，20只臧酋猴中有8只為a型血，由6只為b型血，5只為o型血，1只為ab型血。

實施例3

一種臧酋猴血型的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)選取20只臧酋猴，分別采集臧酋猴后肢淺靜脈血置于含多孔棉的容器中，以120r/min的轉(zhuǎn)速震蕩15min；

(2)吸取步驟(1)處理后的血液3ml置于紅頭采血管中，室溫靜置60min，然后置于4℃過夜，再室溫放置30min，于6000r/min離心10min，吸取上清液；

(3)吸取新鮮的正常人o型血于離心管中，加入10倍體積，濃度為0.9％的生理鹽水，輕微搖勻，于2000r/min離心15min，棄去上清液，然后用0.9％的生理鹽水清洗沉淀物3次；

(4)將步驟(2)所得上清液與步驟(3)所得物按體積比為1:1混合，并于37℃孵育40min，再于1400r/min離心10min，取上清液；

(5)步驟(4)所得上清液與保護(hù)液按體積比為2:1混合；其中，保護(hù)液包括5％牛血清蛋白、5％蔗糖、5％pvp和含5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液濃度為5mm，ph值為7.4；

(6)將步驟(5)所得物分別與正常人的a型血紅細(xì)胞和b型血紅細(xì)胞按體積比為1:1混合，輕微搖勻后于1000r/min離心1min，觀察凝集現(xiàn)象。

若只與a型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為b型血；若只與b型血紅細(xì)胞混合后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為a型血；若兩種混合條件下均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為o型血；若兩種混合條件下均不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則鑒定為ab型血。

根據(jù)凝結(jié)現(xiàn)象來判斷臧酋猴最終的血型，由結(jié)果可知，20只臧酋猴中有8只為a型血，由6只為b型血，5只為o型血，1只為ab型血。

分別在其他不同的5個時間段采集上述20只臧酋猴的血液，根據(jù)實施例1-3的鑒定方法進(jìn)行血型鑒定，其結(jié)果均一致，說明本發(fā)明提供的鑒定方法，重復(fù)性好。