本發(fā)明屬于流式細(xì)胞術(shù)的樣品前處理技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種基于流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，特別涉及人外周血樣本的前處理方法。
背景技術(shù)：
流式細(xì)胞術(shù)是一種采用激光束激發(fā)單行流動(dòng)的細(xì)胞，對(duì)它的散射光和攜帶的熒光進(jìn)行探測(cè)，從而完成對(duì)快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)、制藥學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域。作為最普遍使用的單細(xì)胞技術(shù)之一，流式技術(shù)一直在生物學(xué)各研究領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。一直以來(lái)，流式技術(shù)是分析復(fù)雜細(xì)胞群體的重要手段，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，從而區(qū)分不同種類(lèi)的細(xì)胞；其所能檢測(cè)參數(shù)的多少，也決定了我們對(duì)于所研究群體異質(zhì)性的了解程度。
目前流式細(xì)胞術(shù)的樣品前處理方法基本都是進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，具體前處理方法為：1)收集2×10^6個(gè)細(xì)胞，用1ml冷的pbs重懸，1500rpm離心5min，棄上清；
2)拍打混勻細(xì)胞團(tuán)塊，隨后加入1ul熒光直標(biāo)的cd45抗體，混勻，冰上避光孵育15min；
3)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
4)加入1ml1％中性多聚甲醛(注：用pbs將4％的多聚甲醛稀釋為1％濃度使用即可)重懸細(xì)胞，避光固定15min，隨后1500rpm離心5min，棄上清；
5)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
6)用1ml含0.09％皂素的pbs重懸細(xì)胞，冰上避光放置10min，1500rpm離心5min，棄上清；
7)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
8)以200ulpbs重懸細(xì)胞，加入hsp70抗體，冰上避光放置30min，再用1ml冷的pbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清，洗去未結(jié)合的一抗；
9)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
10)以200ulpbs重懸細(xì)胞，加入fitc標(biāo)記的二抗，冰上避光放置40min后，再用1ml冷的pbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清，洗去未結(jié)合的二抗；
11)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；
12)以200ulpbs重懸細(xì)胞，避光備用；上機(jī)檢測(cè)，每樣品計(jì)數(shù)5000-50000個(gè)細(xì)胞。
熒光染料的標(biāo)記與金屬標(biāo)簽標(biāo)記細(xì)胞的原理不同，處理方法也迥異。故現(xiàn)有標(biāo)記方法進(jìn)行前處理的樣本無(wú)法很好的應(yīng)用于基于流式結(jié)合icp-ms進(jìn)行人外周血樣本單細(xì)胞蛋白檢測(cè)。樣本前處理的方法研究阻滯，將嚴(yán)重影響新型檢測(cè)方法檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
1.要解決的問(wèn)題
針對(duì)現(xiàn)有的流式細(xì)胞術(shù)樣品前處理方法無(wú)法適用于金屬標(biāo)簽標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，將金屬元素標(biāo)簽標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，將標(biāo)記好的細(xì)胞與作為內(nèi)參用于標(biāo)準(zhǔn)化的beads混合，前處理過(guò)程中區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞，以免出現(xiàn)死細(xì)胞數(shù)量過(guò)多影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與闡述，區(qū)分單細(xì)胞與細(xì)胞二聚體、三聚體甚至多聚體，能很好的滿(mǎn)足流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)需求。
2.技術(shù)方案
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
基于流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法，包括以下步驟：
(1)全血樣本的采集和運(yùn)輸：采集全血樣本，樣本中添加抗凝劑，常溫保存運(yùn)輸；
(2)pbmc細(xì)胞分離：采用ficoll淋巴細(xì)胞分離液對(duì)全血樣本中的細(xì)胞進(jìn)行分離；
(3)細(xì)胞活性染色：采用順鉑對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行染色，染色時(shí)間控制在5-10min，染色結(jié)束后離心去上清液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸；
(4)細(xì)胞刺激：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30min，使細(xì)胞恢復(fù)“靜息”狀態(tài)，并根據(jù)適當(dāng)?shù)拇碳の锛按碳し椒▽?duì)細(xì)胞進(jìn)行分組刺激；
(5)細(xì)胞固定：對(duì)步驟(3)中重懸的細(xì)胞進(jìn)行pfa固定、凍存；
(6)表面抗體染色：將pfa固定、凍存的細(xì)胞融化后，重懸，加入細(xì)胞染色緩沖液，離心去除上清后，加入blockingmix重懸，常溫靜置后加入cocktail混勻；
(7)胞內(nèi)磷酸化蛋白染色：將表面抗體染色后的細(xì)胞用pbs和甲醇處理后，用cellstainingbuffer重懸，加入磷酸化抗體cocktail混勻，常溫孵育之后用cellstainingbuffer清洗去上清；
(8)單細(xì)胞標(biāo)記：步驟(7)中染色后的細(xì)胞用pbs緩沖液重懸，滴加入含有金屬元素標(biāo)記物的cellintercalation溶液進(jìn)行標(biāo)記，隨后分別用cellstainingbuffer和水進(jìn)行清洗，最后將細(xì)胞重懸于含有eqbeads的水中保存。
更進(jìn)一步地，所述步驟(1)中全血樣本常溫保存的溫度范圍為15-35℃。
更進(jìn)一步地，步驟(2)中pbmc細(xì)胞分離的具體步驟為：用生理鹽水/pbs/hanks液將全血樣本1：1稀釋后，轉(zhuǎn)移至含1倍體積ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，離心，吸出中層白色的pbmc細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以無(wú)血清dmem/1640離心清洗后，再用無(wú)血清的dmem/1640重懸細(xì)胞沉淀。
更進(jìn)一步地，步驟(4)中所述的刺激物為任何可以引起細(xì)胞蛋白和基因調(diào)控變化的藥物和激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干擾素、生長(zhǎng)激素，刺激的方式為在細(xì)胞懸液中直接加入，目的是要刺激細(xì)胞發(fā)生變化，并進(jìn)行后續(xù)的刺激物與被刺激細(xì)胞蛋白與基因變化的作用關(guān)系。
更進(jìn)一步地，步驟(5)中細(xì)胞固定的具體步驟為：將步驟(3)中重懸的細(xì)胞加入等體積的2×固定液混勻，孵育后加入冰冷的cellstainingbuffer，然后離心分離，用凍存液重懸細(xì)胞。
更進(jìn)一步地，步驟(6)的blockingmix溶液中包括fcreceptorblockingsolution和cellstaningbuffer，兩者的體積比為1:10；cocktail溶液中含有抗體。
更進(jìn)一步地，步驟(7)中的胞內(nèi)磷酸化蛋白染色的具體步驟為：將表面抗體染色后的細(xì)胞用pbs混勻后放置冰上，然后加上預(yù)冷的甲醇混勻，放置冰上15min以上，離心棄上清，用cellstainingbuffer重懸，加入等體積的磷酸化抗體cocktail混勻。
更進(jìn)一步地，步驟(8)中的金屬元素標(biāo)記物為ir或者rh。
3.有益效果
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本發(fā)明將金屬元素標(biāo)簽標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，將標(biāo)記好的細(xì)胞與作為內(nèi)參用于標(biāo)準(zhǔn)化的beads混合，以順鉑染色區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞，以免出現(xiàn)死細(xì)胞數(shù)量過(guò)多影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與闡述；
(2)本發(fā)明可用于制備基于流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的人外周血細(xì)胞樣本，用于單細(xì)胞水平多蛋白信號(hào)的檢測(cè)，本發(fā)明的方法處理方便，所用處理方法、試劑皆為常用方法、試劑，操作簡(jiǎn)便；
(3)本發(fā)明采用同位素金屬標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，克服了傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記法存在的熒光信號(hào)易猝滅、易漂白，且非特異性背景高等不足之處；
(4)本發(fā)明提供的方法可以在一個(gè)細(xì)胞上標(biāo)記30-60種金屬，而現(xiàn)有技術(shù)只能在一個(gè)細(xì)胞上標(biāo)記少量的金屬；
(5)本發(fā)明能夠通過(guò)金屬同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白、內(nèi)部蛋白、基因、mrna，而現(xiàn)有技術(shù)只能標(biāo)記表面或者內(nèi)部蛋白。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明中前處理方法的流程示意圖；
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。
實(shí)施例1
如圖1所示，基于流式結(jié)合icp-ms單細(xì)胞蛋白檢測(cè)的樣本前處理方法的步驟包括以下內(nèi)容：
(一)人外周血樣本的處理與凍存(提取單個(gè)核細(xì)胞-細(xì)胞活性染色-細(xì)胞刺激-細(xì)胞固定)
1.試劑準(zhǔn)備。a.試劑平衡至常溫：ficoll淋巴細(xì)胞分離液；ca2+/mg2+freepbs；2×fixationsolution(3.2％pfainpbs)；人紅細(xì)胞裂解液(可選)；cellstainingbuffer(0.5％bsa+0.02％nan3inpbs)。b.需要預(yù)熱的試劑：fbsfreedmem/1640(37℃)。c.將以下試劑冰上放置：含有10％dmso的cellstainingbuffer；cellstainingbuffer；cisplatin5mm；
2.全血樣本的采集和運(yùn)輸。血液標(biāo)本采集是分析前質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。推薦用肝素或者檸檬酸鹽作為抗凝劑，本實(shí)施例中采用肝素作為抗凝劑，按照醫(yī)院里的標(biāo)準(zhǔn)用量來(lái)使用；edta易與金屬標(biāo)簽元素螯合影響抗體標(biāo)記，故而edta抗凝全血中提取出的pbmc樣本可能需要額外的洗滌步驟。一般情況下，在4小時(shí)內(nèi)將全血樣本需要送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，常溫運(yùn)輸；(22攝氏度最佳，不要低于15度或者高于35度)；
3.pbmc細(xì)胞分離。用生理鹽水/pbs/hanks液(三者的混合液，一般按照1:1:1的體積比混合后使用)將全血樣本1：1稀釋后，用一次性吸管緩緩將其加入含1倍體積ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，注意將離心管傾斜，不要晃動(dòng)，以免擾動(dòng)液面影響分層。常溫400g，剎車(chē)速度設(shè)為5，離心20min；吸出中層白色的pbmc細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中。再以預(yù)熱的無(wú)血清dmem/1640，室溫下300g，5min離心清洗細(xì)胞一遍后，用1ml預(yù)熱的無(wú)血清的dmem/1640重懸細(xì)胞沉淀。若紅細(xì)胞太多，可用紅細(xì)胞裂解液處理，但對(duì)細(xì)胞活性影響較大，故若需對(duì)胞內(nèi)蛋白磷酸化檢測(cè)時(shí)謹(jǐn)慎使用。
4.細(xì)胞活性(順鉑)染色。短時(shí)間(5～10min)的處理過(guò)程中，順鉑無(wú)法進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)部，因此胞內(nèi)順鉑信號(hào)很弱。而死細(xì)胞內(nèi)大量蛋白與順鉑共價(jià)結(jié)合，會(huì)呈現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)，可以此來(lái)區(qū)分細(xì)胞活性。細(xì)胞密度調(diào)至1×107/ml以下，與1ul終濃度為5um的順鉑混勻，37度，孵育5min；加入2～5倍體積(本實(shí)施例中采用的是3倍體積)的常溫的cellstainingbuffer，混勻中止標(biāo)記反應(yīng)，常溫300g，離心5min，去上清后用常溫的cellstainingbuffer(固定用)重懸或預(yù)熱的培養(yǎng)基(刺激用)進(jìn)行重懸?；钚匀旧襟E中用到的所有cellstainingbuffer中都含有0.5％bsa+0.02％nan3。
5.細(xì)胞刺激。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min(一般根據(jù)需要來(lái)選擇培養(yǎng)的時(shí)間，15～30min均可)，使細(xì)胞恢復(fù)“靜息”狀態(tài)。并根據(jù)適當(dāng)?shù)拇碳の锛按碳し椒▽?duì)細(xì)胞進(jìn)行分組刺激，本實(shí)施例中采用γ-干擾素作為刺激物，加入細(xì)胞溶液中混合均勻，然后用于細(xì)胞固定實(shí)驗(yàn)，一般建議在細(xì)胞刺激之后2小時(shí)內(nèi)使用。
6.細(xì)胞固定。重懸混勻細(xì)胞懸液；加入等倍體積的2×固定液(含3.2％pfa的pbs)后立即用移液器吹打或渦旋振蕩混勻，以減少細(xì)胞形成二聚體。室溫孵育10min。加入4ml冰冷的cellstainingbuffer以減慢pfa固定反應(yīng)。4℃，600g，離心5min。去上清。加入1ml凍存液(含10％dmso的cellstaningbuffer)重懸細(xì)胞，放置在冰上靜置用于后續(xù)染色或置于冰上靜置數(shù)分鐘后放入-80度冰箱凍存。樣本應(yīng)注意避免反復(fù)凍融。在前處理過(guò)程中，通過(guò)在顯微鏡下，細(xì)胞計(jì)數(shù)的辦法，分析每1000個(gè)細(xì)胞里有多少二聚體、三聚體等。
(二)金屬標(biāo)簽標(biāo)記的抗體與細(xì)胞結(jié)合(細(xì)胞表面抗體染色-細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白染色-單細(xì)胞標(biāo)記)
1.表面抗體染色。對(duì)于用pfa固定、凍存的細(xì)胞，在冰上或者冷水浴中融化后，vortex重懸細(xì)胞，取1ml(106個(gè))細(xì)胞溶液加入2mlcellstaningbuffer，600g5min離心去上清，加入50ulblockingmix(每份人pbmc(外周血單個(gè)核細(xì)胞)樣本：5ulfcreceptorblockingsolution+50ulcsb，取其中的50ul)重懸，常溫放置10min。每管加入50ulcocktail(單個(gè)樣品的各抗體用量均為1.1ul，總體積55ul，取其中的5ul，見(jiàn)下表)混勻，常溫30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清并重復(fù)一次。
表1cocktail的組成成分
2.胞內(nèi)磷酸化蛋白染色。經(jīng)過(guò)前面的步驟之后，加入2mlpbs，500g離心5min，去上清。加入100ulpbs，輕輕votex混勻細(xì)胞，冰上放置3分鐘。加入1ml預(yù)冷的甲醇，立即用槍頭吹勻，冰上放置15min以上，加入2mlpbs，800g離心5分鐘，棄上清。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。每個(gè)樣本用50ulcellstainingbuffer重懸，加入50ul磷酸化抗體cocktail(配制方法同表面抗體)，混勻，常溫孵育30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。
3.cellintercalation單細(xì)胞標(biāo)記。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清。加入100ulpbs重懸細(xì)胞，邊振蕩邊逐滴加入1mlcellintercalation溶液(在fixandpermbuffer里加入終濃度為125nm的ir(銥元素)或者500nm的rh(銠元素)，每個(gè)樣品用量1ml)。分別用2mlcellstaingbuffe及2ml水，800g離心5min，清洗細(xì)胞1次及3次后，加入1ml含有10％eqbeads的水重懸，將樣本置于冰上。至此，樣本前處理已完成，可用于后續(xù)檢測(cè)。
基于金屬同位素標(biāo)記流式結(jié)合icp-ms的單細(xì)胞蛋白檢測(cè)方法，其步驟為：
(1)樣品標(biāo)記：按照前述的方法采用金屬元素標(biāo)記的特異抗體，作為靶標(biāo)表達(dá)水平的報(bào)告因子；其中用于標(biāo)記的金屬元素，其原子質(zhì)量介于88-210da之間，常用于標(biāo)記的金屬元素為鑭系金屬元素，本實(shí)施例中分別采用ir(銥元素)或者rh(銠元素)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
(2)霧化處理：用蠕動(dòng)泵將標(biāo)記后的樣品溶液均勻的送入霧化器進(jìn)行霧化處理，去除其中的水分；霧化溫度為200℃左右，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.15l/min。
(3)plasma離子化：?jiǎn)渭?xì)胞霧化懸滴進(jìn)入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；plasma內(nèi)溫度范圍為5000k。
(4)去除未離子化物質(zhì)及光子：利用偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)及加速電場(chǎng)的結(jié)合去除離子云流中存在的未離子化的物質(zhì)及光子；
(5)icp-ms檢測(cè)：用icp-ms觀察單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜(icp-ms檢測(cè)全程在真空狀態(tài)下進(jìn)行)，將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子數(shù)據(jù)，并通過(guò)專(zhuān)業(yè)分析軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表型和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)觀察。
傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀通過(guò)熒光染料標(biāo)記抗體，繼而抗體與抗原結(jié)合，在鞘液包繞下，通過(guò)流動(dòng)室，形成單細(xì)胞懸液，經(jīng)激光器，并將前向散射角、側(cè)向散射角、熒光激發(fā)信號(hào)燈信息經(jīng)由pmt傳遞給計(jì)算機(jī)分析。本實(shí)施應(yīng)用金屬元素標(biāo)簽代替熒光染料標(biāo)簽，經(jīng)過(guò)nebulizer形成單細(xì)胞懸液，由plasmatorch將單細(xì)胞懸液離子化，并有tof進(jìn)行檢測(cè)。由于本發(fā)明技術(shù)的使用，使得單細(xì)胞蛋白水平檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度激增，因而分析數(shù)據(jù)時(shí)，可以應(yīng)用多種降維算法、聚類(lèi)分析算法。
對(duì)于液體樣本的分析，在進(jìn)入plasma離子化之前需要盡可能地除去其中的水分。因此nebulizer的作用即為將樣本霧化，隨后通過(guò)加熱至200-250℃左右的霧化室，進(jìn)入plasma。nebulizer中心有一內(nèi)置毛細(xì)管，為樣本液體流道。毛細(xì)管管流道為氬氣環(huán)境。氬氣流速0.15-0.35l/min。當(dāng)樣本流出nebulizer尖端時(shí)，氬氣流的剪切力使得樣本流形成微小水珠，即霧化。本發(fā)明用流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，即細(xì)胞進(jìn)入單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)霧化，經(jīng)由氬等離子體，共價(jià)鍵斷裂，產(chǎn)生自由原子，并完成充電過(guò)程。icptorch炬管主要有三層結(jié)構(gòu)，外層的叫做外管，其次是內(nèi)管，中間的是中心管。外管中通的是大流量的氬氣，叫做冷卻氣，冷卻氣提供給等離子體氣體源源不斷的ar原子，在等離子體中不斷的電離放熱，產(chǎn)生的ar離子在射頻線(xiàn)圈中振蕩碰撞，從而維持了很高的溫度，伴隨著大量離子留出等離子體，又有很多ar原子流入，從而達(dá)到了一種平衡。冷卻氣的流量大概為18l/min。在內(nèi)管中流動(dòng)的氣體叫做輔助氣，也是氬氣，它的作用是給等離子體火焰向前的推力，實(shí)現(xiàn)不斷的電離，也很好的了中心管，以免過(guò)高的溫度使其熔化。輔助氣的流量為～1l/min。中心管中流出的是從霧室排出的樣品溶液的氣溶膠。
單細(xì)胞霧化水珠流出霧化室后即進(jìn)入icp。icptorch的原理是當(dāng)在感應(yīng)線(xiàn)圈上施加高頻電場(chǎng)時(shí)，由于某種原因(如電火花等)在等離子體工作氣體中部分電離產(chǎn)生的帶電粒子在高頻交變電磁場(chǎng)的作用下做高速運(yùn)動(dòng)，碰撞氣體原子，使之迅速、大量電離，形成雪崩式放電，電離的氣體在垂直于磁場(chǎng)方向的截面上形成閉合環(huán)形的渦流，在感應(yīng)線(xiàn)圈內(nèi)形成相當(dāng)于變壓器的次級(jí)線(xiàn)圈并同相當(dāng)于初級(jí)線(xiàn)圈的感應(yīng)線(xiàn)圈耦合，這種高頻感應(yīng)電流產(chǎn)生的高溫又將氣體加熱、電離，并在管口形成一個(gè)火炬狀的穩(wěn)定的等離子體焰矩。其特點(diǎn)如下：
(1)工作溫度高、同時(shí)工作氣體為惰性氣體(氬氣)，因此原子化條件良好，有利于難熔化合物的分解及元素的激發(fā)，對(duì)大多數(shù)元素有很高的靈敏度；
(2)由于趨膚效應(yīng)的存在，穩(wěn)定性高，自吸現(xiàn)象小，測(cè)定的線(xiàn)性范圍寬；
(3)由于電子密度高，所以堿金屬的電離引起的干擾較?。?/p>
(4)icp屬無(wú)極放電，不存在電極污染現(xiàn)象；
(5)icp的載氣流速較低，有利于試樣在中央通道中充分激發(fā)，而且耗樣量也較少；
(6)采用惰性氣體(氬氣)作為工作氣體，因而光譜背景干擾少
單細(xì)胞懸滴進(jìn)入plasma時(shí)，plasma內(nèi)溫度范圍為5000-10000k。因此進(jìn)入plasma的單細(xì)胞懸滴被瞬間氣化、原子化、離子化，由此單細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一團(tuán)離子云。
離子化后的離子云流內(nèi)包含大量未離子化的物質(zhì)及光子等，若不濾除，易黏附于儀器結(jié)構(gòu)，引起檢測(cè)信號(hào)漂移。其中光子若抵達(dá)檢測(cè)器將被誤以為是待檢測(cè)離子，引起檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度下降。因此，在進(jìn)入tof檢測(cè)前，需去除其中的未離子化物質(zhì)及光子。利用偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)及加速電場(chǎng)的結(jié)合即可實(shí)現(xiàn)。采樣錐作用是把來(lái)自等離子體中心通道的載氣流，即離子流大部分吸入錐孔，進(jìn)入第一級(jí)真空室。采樣錐通常由ni、al、cu、pt等金屬制成。
檢測(cè)技術(shù)全程要求真空狀態(tài)。因?yàn)榻Y(jié)合的質(zhì)譜技術(shù)要求離子具有較長(zhǎng)的平均自由程，以便離子在通過(guò)檢測(cè)器時(shí)與另外的離子、分子、原子碰撞的幾率最低，真空度直接影響了離子傳輸效率、質(zhì)譜波形及檢測(cè)器壽命。
本發(fā)明應(yīng)用四極管質(zhì)量分析器的原理篩選原子質(zhì)量。四極管的作用是基于在四根電極之間的空間產(chǎn)生一個(gè)隨時(shí)間變化的特殊的電磁場(chǎng)，只有給定荷質(zhì)比(m/z)的離子才能獲得穩(wěn)定的路徑而通過(guò)極棒，從另一端出射，其它離子將被過(guò)分偏轉(zhuǎn)，與極棒碰撞，并在極棒上被中和而丟失。通過(guò)四極管去除常見(jiàn)生物元素后，限定檢測(cè)的原子量的檢測(cè)范圍(88-210da)，分辨率極高。篩選檢測(cè)原子質(zhì)量較大的原子，濾除原子量小的元素，保留較寬的原子量檢測(cè)范圍的同時(shí)，由于該類(lèi)元素在細(xì)胞內(nèi)的含量極低，所以信號(hào)的背景極低。金屬元素同位素的選擇不局限于鑭系金屬?？梢允窃淤|(zhì)量介于88-210da之間的且螯合物安全無(wú)毒可合成的任意元素。金屬標(biāo)簽元素種類(lèi)豐富，通道數(shù)量激增，信息量亦成倍增長(zhǎng)。金屬標(biāo)簽可以是通過(guò)金屬螯合物與抗體結(jié)合。
基于飛行時(shí)間(timeofflight)原理進(jìn)行檢測(cè)。用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜(icp-ms)觀察單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，原子的質(zhì)量與細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子數(shù)據(jù)呈現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，即檢測(cè)到1個(gè)原子質(zhì)量信號(hào)就代表有一個(gè)細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子數(shù)據(jù)，并通過(guò)專(zhuān)業(yè)分析軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表型和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)觀察。
信號(hào)分子檢測(cè)通道數(shù)量的增加，可實(shí)現(xiàn)從單個(gè)樣本獲取更大的信息量，為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了新的手段。然而數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度的激增使得原有傳統(tǒng)流式的數(shù)據(jù)分析圖無(wú)法很好地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。應(yīng)用多種降維算法、聚類(lèi)分析算法、分群算法等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與可視化。目前已有大量相關(guān)算法文獻(xiàn)報(bào)道。如spade、drevi、accense、xshift、visne以及phenograp。