本發(fā)明屬于激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量方法及裝置。

背景技術(shù)：

在科研領(lǐng)域中，樣品的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量是研究各種分子或材料的物質(zhì)結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)等的重要手段之一；尤其是在生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域，對(duì)所研究樣品進(jìn)行熒光壽命測(cè)量是該領(lǐng)域科學(xué)研究中最常規(guī)的檢測(cè)方法。目前，測(cè)量樣品激發(fā)態(tài)壽命(包括熒光或磷光壽命)的方法主要有以下幾種：1)采用時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)技術(shù)(tcspc)，結(jié)合專門的tcspc卡和高靈敏光電檢測(cè)器即可測(cè)量熒光壽命；2)采用門控光子計(jì)數(shù)技術(shù)，反復(fù)測(cè)量每個(gè)激發(fā)脈沖后不同延遲時(shí)間、相同時(shí)間寬度(門寬)內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，則可獲得其熒光衰減曲線；3)采用高速光電探測(cè)器并結(jié)合示波器可直接采集熒光信號(hào)的衰減曲線。

在上述3種方法中，第一種方法(即單光子計(jì)數(shù)技術(shù))具有很高的熒光檢測(cè)靈敏度，且其時(shí)間分辨也比較高(可至100皮秒)，因此很適合于測(cè)量時(shí)間尺度較短(如百皮秒到百納秒級(jí))的熒光壽命。然而，目前市場(chǎng)上基于這種方法的熒光壽命測(cè)量裝置都需要購(gòu)買非常昂貴的設(shè)備，如專用的tcspc卡及其配套軟件；而且這些專用的tcspc卡由于對(duì)激光觸發(fā)頻率有所限制(一般要求重復(fù)頻率必須大于數(shù)百khz)，故都只能用于測(cè)量時(shí)間尺度較短(如最長(zhǎng)至數(shù)百納秒)的熒光壽命。至于后面兩種測(cè)量方法，由于測(cè)量原理上的原因?qū)е缕錂z測(cè)靈敏度和時(shí)間分辨都比較低，故只能用于測(cè)量時(shí)間尺度較長(zhǎng)(如微秒級(jí)以上)的熒光/磷光壽命，但都不適合于測(cè)量光致發(fā)光強(qiáng)度很低和壽命較短(如納秒級(jí))的熒光樣品。

經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐發(fā)現(xiàn)：光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔作為光子時(shí)間差可以作為測(cè)量寬范圍的光致發(fā)光強(qiáng)度和壽命的熒光樣品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量的局限性問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量的數(shù)據(jù)采集裝置，所述裝置包括脈沖激發(fā)光源、樣品池、熒光收集系統(tǒng)，所述激發(fā)光源的發(fā)光口及熒光收集系統(tǒng)朝向樣品池，該采集裝置：還包括數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，所述數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)包括頻率計(jì)數(shù)卡，其連接于脈沖激發(fā)光源的信號(hào)同步輸出引腳，并與光線收集器的光電檢測(cè)器的信號(hào)輸出引腳連接。

進(jìn)一步的，所述裝置還包括光線收集器，所述激發(fā)光源的發(fā)光口與樣品池中心和光線收集器呈一直線。

所述熒光收集系統(tǒng)包括依次縱向排列放置的下述各組件：收光透鏡、陷波濾光片、窄帶熒光濾光片、會(huì)聚透鏡和光電檢測(cè)器，且各組件的中心與樣品池中心的連線呈一直線，該連線的方向與激發(fā)光傳播方向垂直。

進(jìn)一步的，所述各組件全部封閉在一個(gè)內(nèi)部涂黑的密封罩中。

進(jìn)一步的，所述數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)還包括計(jì)算機(jī)，脈沖激發(fā)光源的同步輸出信號(hào)和光電檢測(cè)器的輸出信號(hào)分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)bnc線被傳輸?shù)筋l率計(jì)數(shù)卡，頻率計(jì)數(shù)卡與計(jì)算機(jī)之間采用usb數(shù)據(jù)線相連。

一種基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量方法，步驟在于：

1)用重復(fù)頻率的脈沖激光激發(fā)待測(cè)樣品以產(chǎn)生光致發(fā)光；

2)檢測(cè)所述待測(cè)樣品的光致發(fā)光信號(hào)，使用頻率計(jì)數(shù)卡測(cè)量所檢測(cè)到的光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔作為光子時(shí)間差；

3)把所測(cè)量到的光子時(shí)間差劃分成各個(gè)時(shí)間區(qū)間，將具有不同時(shí)間差數(shù)據(jù)的光子分配入相對(duì)應(yīng)的時(shí)間區(qū)間內(nèi)；

4)對(duì)每個(gè)時(shí)間區(qū)間內(nèi)的光子分別計(jì)數(shù)，得到光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述；

5)對(duì)所測(cè)量得到的光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述作出指數(shù)衰減擬合，得到待測(cè)樣品的激發(fā)態(tài)壽命。

進(jìn)一步的，所述光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述為發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線，對(duì)所測(cè)量得到的發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線作出指數(shù)衰減擬合，得到待測(cè)樣品的激發(fā)態(tài)壽命。

進(jìn)一步的，所述脈沖激發(fā)光源的重復(fù)頻率可調(diào)；所述待測(cè)樣品產(chǎn)生光致發(fā)光是該待測(cè)樣品在躍遷到激發(fā)態(tài)后發(fā)出的熒光或磷光。

進(jìn)一步的，所述重復(fù)頻率的脈沖激光的重復(fù)頻率范圍為1khz～20mhz。

有益效果：在發(fā)現(xiàn)光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔作為光子時(shí)間差可以作為測(cè)量光致發(fā)光強(qiáng)度很低和壽命較短的熒光樣品，為了能夠測(cè)量時(shí)間差，在數(shù)據(jù)采集裝置中，使用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，即用頻率計(jì)數(shù)卡連接于脈沖激發(fā)光源的信號(hào)同步輸出引腳，并與光線收集器的光電檢測(cè)器的信號(hào)輸出引腳連接，以此，將兩個(gè)信號(hào)采集以獲得所述時(shí)間差，以用于激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量。而使用本發(fā)明中的測(cè)量方法，將該時(shí)間差信號(hào)獲取，并對(duì)時(shí)間差變化的描述作出指數(shù)衰減擬合，能夠測(cè)量激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為利用該測(cè)量裝置測(cè)到的短壽命樣品的激發(fā)態(tài)熒光衰減曲線。

圖3為利用該測(cè)量裝置測(cè)到的長(zhǎng)壽命樣品的激發(fā)態(tài)熒光衰減曲線。

其中：1、脈沖激發(fā)光源，2、樣品池，3、光線收集器，4、熒光收集系統(tǒng)，5、收光透鏡，6、陷波濾光片，7、窄帶熒光濾光片，8、會(huì)聚透鏡，9、光電檢測(cè)器，10、頻率計(jì)數(shù)卡，11、計(jì)算機(jī)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：一種基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量的數(shù)據(jù)采集裝置，所述裝置包括脈沖激發(fā)光源1、樣品池2、熒光收集系統(tǒng)4，所述激發(fā)光源1的發(fā)光口及熒光收集系統(tǒng)朝向樣品池，為了能夠得到光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔，該裝置還包括數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，所述數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)包括頻率計(jì)數(shù)卡，其連接于脈沖激發(fā)光源1的信號(hào)同步輸出引腳，并與光線收集器3的光電檢測(cè)器的信號(hào)輸出引腳連接。

所述裝置還包括光線收集器，所述激發(fā)光源1的發(fā)光口與樣品池2中心和光線收集器3呈一直線。其目的是使用光線收集器對(duì)剩余激光收集，且該種位置，使得樣品池接收激光更為充分，也避免了剩余激發(fā)光對(duì)樣品熒光的檢測(cè)造成干擾。

所述熒光收集系統(tǒng)4包括依次縱向排列放置的下述各組件：收光透鏡5、陷波濾光片6、窄帶熒光濾光片7、會(huì)聚透鏡8和光電檢測(cè)器9，且各組件的中心與樣品池2中心的連線呈一直線，該連線的方向與激發(fā)光傳播方向垂直。提出的該種熒光收集系統(tǒng)，對(duì)于激光接收和處理具有較好的適應(yīng)性，對(duì)于時(shí)間差信號(hào)的得到更為準(zhǔn)確。而垂直設(shè)置更進(jìn)一步避免了剩余激發(fā)光對(duì)樣品熒光的檢測(cè)造成干擾。

為了降低背景噪聲，所述各組件全部封閉在一個(gè)內(nèi)部涂黑的密封罩中，

在一種實(shí)施例中，所述數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)還包括計(jì)算機(jī)11，脈沖激發(fā)光源1的同步輸出信號(hào)和光電檢測(cè)器9的輸出信號(hào)分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)bnc線被傳輸?shù)筋l率計(jì)數(shù)卡10，頻率計(jì)數(shù)卡10與計(jì)算機(jī)11之間采用usb數(shù)據(jù)線相連，此時(shí)，該數(shù)據(jù)采集裝置，已經(jīng)成為了一個(gè)適用于測(cè)量熒光壽命的測(cè)量裝置，即在計(jì)算機(jī)中，對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要涉及統(tǒng)計(jì)與擬合，依次就可以得到熒光壽命。

在一種實(shí)施例中，本公開記載一種基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量方法，包含以下幾個(gè)步驟：

1)用重復(fù)頻率的脈沖激光激發(fā)待測(cè)樣品以產(chǎn)生光致發(fā)光；所述脈沖激發(fā)光源的重復(fù)頻率可調(diào)；所述待測(cè)樣品產(chǎn)生光致發(fā)光是該待測(cè)樣品在躍遷到激發(fā)態(tài)后發(fā)出的熒光或磷光。

2)檢測(cè)所述待測(cè)樣品的光致發(fā)光信號(hào)，使用頻率計(jì)數(shù)卡測(cè)量所檢測(cè)到的光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔作為光子時(shí)間差；

3)把所測(cè)量到的光子時(shí)間差劃分成各個(gè)時(shí)間區(qū)間，將具有不同時(shí)間差數(shù)據(jù)的光子分配入相對(duì)應(yīng)的時(shí)間區(qū)間內(nèi)；

4)對(duì)每個(gè)時(shí)間區(qū)間內(nèi)的光子分別計(jì)數(shù)，得到光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述；

5)對(duì)所測(cè)量得到的光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述作出指數(shù)衰減擬合，得到待測(cè)樣品的激發(fā)態(tài)壽命。在該步驟中，可以具體解釋為：所述光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差變化的描述為發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線，對(duì)所測(cè)量得到的發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線作出指數(shù)衰減擬合，得到待測(cè)樣品的激發(fā)態(tài)壽命。

實(shí)施例2：本實(shí)施例的目的是提供一種可兼容很寬壽命范圍(如百皮秒級(jí)至毫秒級(jí))且價(jià)格較便宜的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量方法及裝置，即可用于測(cè)量短壽命的熒光樣品，也可用于長(zhǎng)壽命的磷光樣品。

基于頻率計(jì)數(shù)卡的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量方法，包含以下幾個(gè)步驟：

1)用高重復(fù)頻率的脈沖光激發(fā)待測(cè)樣品以產(chǎn)生光致發(fā)光；

2)檢測(cè)所述樣品的光致發(fā)光信號(hào)，利用頻率計(jì)數(shù)卡測(cè)量所檢測(cè)到的光子脈沖信號(hào)與激發(fā)光脈沖信號(hào)之間的時(shí)間間隔(時(shí)間差)；

3)把所測(cè)到的光子時(shí)間差劃分成各個(gè)時(shí)間區(qū)間，將具有不同時(shí)間差數(shù)據(jù)的光子分配入相對(duì)應(yīng)的時(shí)間區(qū)間內(nèi)；

4)對(duì)每個(gè)時(shí)間區(qū)間內(nèi)的光子分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，可獲得其光致發(fā)光光子數(shù)隨時(shí)間差的變化(即發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線)；

5)對(duì)所測(cè)到的光致發(fā)光強(qiáng)度曲線進(jìn)行指數(shù)衰減擬合，即可得到待測(cè)樣品的激發(fā)態(tài)壽命。

所述脈沖激發(fā)光源的重復(fù)頻率要求可調(diào)；所述待測(cè)樣品要求可產(chǎn)生光致發(fā)光，即該樣品在躍遷到激發(fā)態(tài)后能夠發(fā)出熒光或磷光。

如圖1所示，用于實(shí)施上述測(cè)量方法的熒光壽命測(cè)量裝置，主要包括：脈沖激發(fā)光源1，樣品池2，光線收集器3，熒光收集系統(tǒng)4和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。

其中，所述熒光收集系統(tǒng)由依次設(shè)置的收光透鏡5，陷波濾光片6，窄帶熒光濾光片7，會(huì)聚透鏡8和光電檢測(cè)器9構(gòu)成。激發(fā)光源1的發(fā)光口與樣品池2中心、光線收集器3位置呈一直線；更確切的說(shuō)，激發(fā)光應(yīng)通過(guò)樣品池中心，最后進(jìn)入光線收集器3，以避免剩余激發(fā)光對(duì)樣品熒光的檢測(cè)造成干擾。熒光收集系統(tǒng)內(nèi)各組件中心與樣品池中心呈一直線，方向與激發(fā)光傳播方向垂直；且其各組件全部封閉在一個(gè)內(nèi)部涂黑的密封罩中，以降低背景噪聲。

所述數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)包括一個(gè)頻率計(jì)數(shù)卡10和一臺(tái)計(jì)算機(jī)11。激發(fā)光源的同步輸出信號(hào)和光電檢測(cè)器的輸出信號(hào)分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)bnc線連接到頻率計(jì)數(shù)卡，而頻率計(jì)數(shù)卡與計(jì)算機(jī)之間采用usb數(shù)據(jù)線相連。

以上為本實(shí)施例提供的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量裝置的主要組成結(jié)構(gòu)，為了更清晰地了解所述壽命測(cè)量裝置，下面對(duì)其工作原理作進(jìn)一步介紹。

在實(shí)際激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量過(guò)程中，首先打開脈沖激發(fā)光源，并設(shè)置適當(dāng)?shù)闹貜?fù)頻率，然后待測(cè)樣品在被激發(fā)后所產(chǎn)生的光致發(fā)光信號(hào)通過(guò)熒光收集系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。所有檢測(cè)到的光子脈沖信號(hào)與其相應(yīng)激發(fā)脈沖信號(hào)之間的時(shí)間差將由頻率計(jì)數(shù)卡來(lái)負(fù)責(zé)測(cè)量并采集，之后通過(guò)usb數(shù)據(jù)線將這些所測(cè)到的時(shí)間差數(shù)據(jù)傳送到計(jì)算機(jī)，最后在計(jì)算機(jī)中采用數(shù)據(jù)處理程序進(jìn)行統(tǒng)一處理：即通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析這些大量時(shí)間差的數(shù)據(jù)分布，來(lái)獲得光致發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(即發(fā)光強(qiáng)度衰減曲線)，最終擬合得到激發(fā)態(tài)壽命。

相對(duì)于現(xiàn)有的熒光/磷光壽命測(cè)量技術(shù)，本公開的方案具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1、相對(duì)于傳統(tǒng)的門控光子計(jì)數(shù)技術(shù)和高速光電探測(cè)器+示波器直接采集波形的技術(shù)，本發(fā)明通過(guò)頻率計(jì)數(shù)卡來(lái)測(cè)量時(shí)間差(精度可達(dá)50ps)，具有很高的時(shí)間分辨，故可用于測(cè)量短時(shí)間尺度的激發(fā)態(tài)壽命。

2、相對(duì)于傳統(tǒng)的熒光/磷光壽命測(cè)量技術(shù)，本發(fā)明使用弱光激發(fā)，不會(huì)損壞樣品，也可在很低樣品濃度情況下測(cè)量，原理上可做到單光子檢測(cè)；且背景噪聲干擾小，信噪比高，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量準(zhǔn)確性高。

3、與市場(chǎng)上基于tcspc卡的熒光壽命測(cè)量?jī)x相比，本發(fā)明具有同樣的熒光檢測(cè)靈敏度和時(shí)間分辨，也可用于測(cè)量短時(shí)間尺度(如百皮秒到百納秒級(jí))的熒光壽命；但本發(fā)明由于不采用專用的tcspc卡，不需要限制激發(fā)光觸發(fā)頻率，故還可用于測(cè)量長(zhǎng)時(shí)間尺度的激發(fā)態(tài)壽命。因此，本發(fā)明可測(cè)量的激發(fā)態(tài)壽命范圍非常寬(如可跨越百皮秒級(jí)至毫秒量級(jí))。

4、與市場(chǎng)上基于tcspc卡的熒光壽命測(cè)量?jī)x相比，本發(fā)明使用普通的頻率計(jì)數(shù)卡，并采用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)采集與處理程序，相對(duì)于專用的tcspc卡及相關(guān)軟件，成本上可大幅下降。

實(shí)施例3：針對(duì)本發(fā)明所述的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量裝置在測(cè)量短壽命樣品時(shí)的考察，采用1號(hào)短壽命樣品(其熒光峰值位置約在610nm)進(jìn)行測(cè)試。首先把含有1號(hào)樣品的比色皿放進(jìn)在樣品池中，采用皮秒脈沖激光(405nm)激發(fā)樣品，并設(shè)置激光重復(fù)頻率為20mhz；采用405nm陷波濾光片，熒光濾光片為610nm窄帶濾光片，收光和會(huì)聚透鏡均采用60mm焦距透鏡，所測(cè)得的該樣品的熒光衰減曲線如圖2所示。采用單指數(shù)衰減函數(shù)i(t)＝i0exp(-t/τ)+c(式中τ為待測(cè)樣品的熒光壽命，c為背景噪聲)對(duì)該衰減曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，可得到該待測(cè)樣品的熒光壽命約為τ＝6.37ns。

實(shí)施例4：針對(duì)本發(fā)明所述的激發(fā)態(tài)壽命測(cè)量裝置在測(cè)量長(zhǎng)壽命熒光樣品時(shí)的考察，采用2號(hào)長(zhǎng)壽命樣品(其熒光峰值位置約在560nm)進(jìn)行測(cè)試。首先把含有2號(hào)樣品的比色皿放進(jìn)在樣品池中，然后采用405nm脈沖激光來(lái)激發(fā)樣品，并設(shè)置激光重復(fù)頻率為1khz；采用405nm陷波濾光片，熒光濾光片為560nm窄帶濾光片，收光和會(huì)聚透鏡均采用60mm焦距透鏡，所測(cè)得的該樣品的熒光衰減曲線如圖3所示。采用單指數(shù)衰減函數(shù)i(t)＝i0exp(-t/τ)+c(式中τ為待測(cè)樣品的熒光壽命，c為背景噪聲)對(duì)該衰減曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，可得到該待測(cè)樣品的熒光壽命約為52.0μs。

在上述各實(shí)施例中，激光重復(fù)頻率可以使用0.05mhz、3mhz等在1khz-20mhz的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)，當(dāng)然，激光重復(fù)頻率并不限于此范圍，根據(jù)實(shí)際需求設(shè)定即可，在本實(shí)施例范圍中的激光重復(fù)頻率對(duì)于熒光壽命的測(cè)定準(zhǔn)確性更好。

以上所述，僅為本發(fā)明創(chuàng)造較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明創(chuàng)造披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。