本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌鞭毛染色方法。
背景技術(shù)：
鞭毛(flagellum)是細(xì)菌菌體表面的一種細(xì)長(zhǎng)、并呈波浪狀彎曲的特殊結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。它是細(xì)菌在進(jìn)化過程中長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果，使細(xì)菌更好地適應(yīng)環(huán)境，有利于細(xì)菌的生存。鞭毛的數(shù)量、形態(tài)及其在菌體的分布位置是鑒定細(xì)菌的重要指標(biāo)，但由于鞭毛的直徑非常纖細(xì)，只有12～30nm，遠(yuǎn)低于普通光學(xué)顯微鏡的分辨率，需用電子顯微鏡觀察，或采用特殊的染色方法使鞭毛增粗后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。
鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染劑(如單寧酸或明礬鉀)處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色，比如堿性復(fù)紅、硝酸銀、結(jié)晶紫染色等。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。目前，細(xì)菌鞭毛染色方法根據(jù)染色劑的不同，可分為堿性復(fù)紅法、副品紅法、結(jié)晶紫法、維多利亞藍(lán)b法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸。
盡管目前細(xì)菌鞭毛染色方法報(bào)告較多，但基本染色方法可概括為：leifson染色法、西薩-基爾染色法、銀鹽染色法、柯達(dá)卡溶液染色法及負(fù)染法(參考：李任峰，細(xì)菌鞭毛研究概況及進(jìn)展[j].微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(6)124-127)?，F(xiàn)在教學(xué)中普遍采用的銀染法，雖染色清晰、鞭毛染出率高，但是硝酸銀溶液配制過程相對(duì)復(fù)雜，且加入氨水的量以及硝酸銀回滴的程度不容易把握。而且存在試劑不穩(wěn)定，易造成重金屬環(huán)境污染等不足。
徐娜娜等人公開了一種改良的細(xì)菌鞭毛染色方法：細(xì)菌在雙蒸水中舒展腫脹5min后，復(fù)紅染色5min，再用堿性美蘭復(fù)染5min，鏡下菌體染成藍(lán)色，鞭毛染成紅色，鞭毛染色效果好(參考：《細(xì)菌鞭毛染色方法的改良》，實(shí)用醫(yī)技雜志[j]，2017，24(2))。但是該方法鞭毛染色效果容易受細(xì)菌在雙蒸水中舒展膨脹時(shí)間的影響，膨脹時(shí)間太長(zhǎng)(比如超過10min)，菌體鞭毛膨脹太過，菌體洗脫太多，染色后融合成一片，不夠清晰。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種細(xì)菌鞭毛染色方法。本發(fā)明提供的細(xì)菌鞭毛染色方法的染色效果不易受細(xì)菌膨脹時(shí)間影響，染色效果好，鞭毛染色成功率高，重復(fù)性好。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：
本發(fā)明提供一種細(xì)菌鞭毛染色方法，包括如下步驟：
1)菌種活化；
2)菌懸液制備，雙蒸水舒展膨脹10～15min；
3)涂片，固定；
4)染色，包括堿性復(fù)紅染色，堿性美蘭復(fù)染。
步驟3)所述固定為30～60℃熱固定或餓酸固定。
在一種實(shí)施方式中，步驟3)所述固定為40～50℃熱固定，固定時(shí)間為5～10min。
在一種實(shí)施方式中，步驟3)所述固定為1～2％餓酸固定，固定時(shí)間為1～3min。
步驟4)所述堿性復(fù)紅染色的染色時(shí)間為40～60sec，染色溫度為40～50℃。
所述堿性復(fù)紅染色的染料配方為：5％鉀明礬水溶液，2％鞣酸水溶液，1％堿性復(fù)紅乙醇溶液等量按順序混合，所述乙醇為95％乙醇。
步驟4)所述堿性美蘭復(fù)染的染色時(shí)間為1～5min，常溫染色。
所述堿性美蘭復(fù)染的染料配方為：美蘭2g加95％乙醇100ml，蒸餾水100ml，10％naoh0.1ml混勻。
優(yōu)選地，步驟1)所述菌種活化的的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間為12～18小時(shí)。
優(yōu)選地，步驟1)所述菌懸液用麥?zhǔn)媳葷岱z測(cè)，細(xì)菌濃度為1.5×1012/l。
本發(fā)明提供一種細(xì)菌鞭毛染色方法，包括如下步驟：1)菌種活化；2)菌懸液制備，雙蒸水舒展膨脹10～15min；3)涂片，固定；4)染色，包括堿性復(fù)紅染色，堿性美蘭復(fù)染。
任選地，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明提供的細(xì)菌鞭毛染色方法的染色效果不易受細(xì)菌膨脹時(shí)間影響，染色效果好。
2、本發(fā)明提供的細(xì)菌鞭毛染色方法鞭毛染色成功率高，重復(fù)性好。
3、本發(fā)明提供的細(xì)菌鞭毛染色方法鞭毛染色時(shí)間有效縮短。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以相互組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
為保證細(xì)菌鞭毛染色效果，試驗(yàn)用載玻片要處理干凈，不能有污漬，尤其是油污，否則細(xì)菌游不開堆積在一起，無法染色觀察。較好的玻片標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)?shù)渭右坏握麴s水在玻片上，水滴能快速均勻的擴(kuò)散開來，且迎著光觀察，玻片表面無去污劑殘留。載玻片的處理方法可以是：將載玻片提前一天置于重鉻酸鉀硫酸清潔液(重鉻酸鉀100g，濃硫酸800ml，水200ml)中浸泡一晚，取出后以清水洗干凈，斜插于架上，自然晾干備用。載玻片的處理方法也可以是：將載玻片逐片放入1％清潔液中浸泡30min，熱水沖洗數(shù)次，徹底清洗干凈，斜插于架上，自然晾干備用。
菌懸液用麥?zhǔn)媳葷岱z測(cè)，細(xì)菌濃度約為1.5×1012/l時(shí)，染色效果佳。
菌種活化的的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間為12～18小時(shí)。參考：萬滋衡等，leifson細(xì)菌鞭毛染色法的改良[j].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，04：792，930。
本發(fā)明所述的熱固定，包括但不限于，任選地，可以在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，也可以在點(diǎn)燃的酒精燈旁進(jìn)行，也可以在溫度可控的烘箱中進(jìn)行。熱固定可以使鞭毛蛋白高熱變性凝固，不至于過于膨大。
本發(fā)明所述餓酸固定，優(yōu)選1～2％餓酸固定。餓酸可以快速固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1～2％餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1～2min后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。
本發(fā)明所述的堿性復(fù)紅染色，包括但不限于，任選地，可以在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，也可以在點(diǎn)燃的酒精燈旁進(jìn)行，也可以在溫度可控的烘箱中進(jìn)行。
細(xì)菌鞭毛堿性復(fù)紅法和副品紅法染色：1926年由gray首創(chuàng)，其媒染液成分包括20％丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3％堿性復(fù)紅乙醇(95％)溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾后方可使用。染片時(shí)，媒染劑染色約6min，具體時(shí)間尚需在試驗(yàn)中摸索確定，染色液是抗酸染色ziehl-neelsen石碳酸復(fù)紅染液，染片時(shí)需要1小片吸水紙蓋在涂片上，染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。leifson于1930年建立了副品紅法，并于1938年和1951年兩次對(duì)該方法進(jìn)行了改良，稱為leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：a為1.5％nacl水溶液，b為3％單寧酸水溶液，c為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解于100ml95％乙醇溶液中。使用時(shí)把等體積a和b混合，然后再加2體積c與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個(gè)月。
本發(fā)明所述的堿性復(fù)紅染色的染液配方任選地，可以為，5％鉀明礬水溶液，2％鞣酸水溶液，1％堿性復(fù)紅乙醇溶液等量按順序混合，所述乙醇為95％乙醇。
美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變成為無色的還原型。因此，具有還原能力的活細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對(duì)細(xì)菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。
本發(fā)明利用堿性美蘭進(jìn)一步復(fù)染細(xì)菌菌體，使菌體和鞭毛呈現(xiàn)不同的顏色，細(xì)菌標(biāo)本呈現(xiàn)一定顏色梯度，利于顯微鏡觀察。
本發(fā)明所述的堿性美蘭復(fù)染染液配方，任選地，可以為，美蘭2g加95％乙醇100ml，蒸餾水100ml，10％naoh0.1ml混勻。
下面通過下述實(shí)施例再對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，除非特殊說明，所用試劑均為市售試驗(yàn)用分析純，所用試驗(yàn)細(xì)菌為變形桿菌，由徐州醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供，所用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購買自杭州天和微生物公司。
實(shí)施例1
鞭毛染色液(堿性復(fù)紅染色染液)配方：
5％鉀明礬水溶液
2％鞣酸水溶液
1％堿性復(fù)紅乙醇(95％)溶液
上述三種溶液等量按順序混合即得鞭毛染色液。
實(shí)施例2
鞭毛復(fù)染液(堿性美蘭復(fù)染染料)配方：
美蘭2g加95％乙醇100ml，
蒸餾水100ml
10％naoh0.1ml
上述三種溶液混勻即得鞭毛復(fù)染液。
實(shí)施例3
載玻片處理方法：
重鉻酸鉀硫酸清潔液：重鉻酸鉀100g，濃硫酸800ml，水200ml。
將載玻片提前一天置于重鉻酸鉀硫酸清潔液中浸泡一晚，取出后以清水洗干凈，斜插于架上，自然晾干備用。
實(shí)施例4～實(shí)施例8、對(duì)比試驗(yàn)鞭毛染色液配方同實(shí)施例1、鞭毛復(fù)染液配方同實(shí)施例2，載玻片處理方法同實(shí)施例3。
實(shí)施例4
鞭毛染色方法：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，然后接種環(huán)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)12h；
2)菌懸液制備：將3～4ml無菌雙蒸水加入接種好的固體培養(yǎng)皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)平皿，稍微傾斜平皿靜置備用；
3)涂片、固定：于菌懸液靜置第10min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，斜立載玻片，30℃烘箱熱固定10min；
4)染色：確定載玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃烘箱靜置60sec后，流水沖洗；再加鞭毛復(fù)染液染色5min，水洗干燥后，油鏡觀察。
實(shí)施例5
鞭毛染色方法：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，然后接種環(huán)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)16h；
2)菌懸液制備：將3～4ml無菌雙蒸水加入接種好的固體培養(yǎng)皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)平皿，稍微傾斜平皿靜置備用；
3)涂片、固定：于菌懸液靜置第15min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，斜立載玻片，60℃烘箱熱固定5min；
4)染色：確定載玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，45℃恒溫培養(yǎng)箱靜置50sec后，流水沖洗；再加鞭毛復(fù)染液染色1min，水洗干燥后，油鏡觀察。
實(shí)施例6
鞭毛染色方法：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，然后接種環(huán)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)12h；
2)菌懸液制備：將3～4ml無菌雙蒸水加入接種好的固體培養(yǎng)皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)平皿，稍微傾斜平皿靜置備用；
3)涂片、固定：于菌懸液靜置第10min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，1％餓酸固定，固定時(shí)間為3min；
4)染色：確定載玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，50℃烘箱靜置40sec后，流水沖洗；再加鞭毛復(fù)染液染色3min，水洗干燥后，油鏡觀察。
實(shí)施例7
鞭毛染色方法：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，然后接種環(huán)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)18h小時(shí)；
2)菌懸液制備：將3～4ml無菌雙蒸水加入接種好的固體培養(yǎng)皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)平皿，稍微傾斜平皿靜置備用；
3)涂片、固定：于菌懸液靜置第12min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，2％餓酸固定，固定時(shí)間為1min；
4)染色：確定載玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃烘箱靜置50sec后，流水沖洗；再加鞭毛復(fù)染液染色5min，水洗干燥后，油鏡觀察。
實(shí)施例8
鞭毛染色方法：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)22h，連續(xù)轉(zhuǎn)種5次；
2)菌懸液制備：取第3待變形桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)物周邊菌苔，放入1ml雙蒸水中，細(xì)菌濃度約1.5×1012/l(麥?zhǔn)媳葷岱?，輕輕搖勻，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min；
3)涂片、固定：于菌懸液靜置第15min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，斜立載玻片，45℃烘箱熱固定8min；
4)染色：確定載玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃恒溫培養(yǎng)箱靜置50sec后，流水沖洗；再加鞭毛復(fù)染液染色4min，水洗干燥后，油鏡觀察。
對(duì)比試驗(yàn)：
1)菌種活化：將冰箱保存的變形桿菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，然后接種環(huán)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)18h小時(shí)；
2)菌懸液制備：將3～4ml無菌雙蒸水加入接種好的固體培養(yǎng)皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)晃動(dòng)平皿，稍微傾斜平皿靜置備用；
3)涂片、染色：于菌懸液靜置第15min，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液，放在載玻片一端，切勿研磨或振動(dòng)，斜立載玻片，讓其自然干燥，然后在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液5min后，流水沖洗，再加鞭毛復(fù)染液染色5min，水洗干燥后，油鏡觀察。
試驗(yàn)結(jié)果：通過普通光學(xué)顯微鏡直接油鏡觀察，實(shí)施例4～實(shí)施例8變形桿菌鞭毛均染色成功。實(shí)施例4～實(shí)施例8所得標(biāo)本變形桿菌菌體著色藍(lán)色，鞭毛著色紅色，背景淡藍(lán)，標(biāo)本顏色層次分明，輪廓清晰，鞭毛粗細(xì)適合，染色效果好。對(duì)比試驗(yàn)變形桿菌鞭毛染色失敗，菌體洗脫太多且菌體模糊，鞭毛染不清晰。
以上內(nèi)容僅僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，依照本發(fā)明的思路，在具體實(shí)施例方式及其應(yīng)用范圍上均會(huì)有所改變之處，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
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