本發(fā)明涉及文物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種定量檢測古代羊毛的方法。

背景技術(shù)：

羊毛，人類紡織史上最早利用的一種天然纖維。具有良好的彈性和纖維柔軟性，保暖性能好，穿著舒適度強，手感柔和，在生活和工業(yè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

羊毛優(yōu)異的性能使得其在數(shù)年前就得到了廣大人民的喜愛和使用，但由于羊毛的主要成分是角蛋白，一種極易受到環(huán)境影響的蛋白質(zhì)。隨著時間的延長，羊毛制品便不斷遭到外界的腐蝕而變得糟朽不堪。在漫漫歷史車輪中，一些隨逝者埋入墓葬的羊毛制品早已失去了最初的形貌，使得人類用肉眼難以辨別，這給羊毛類文物的鑒定和研究帶來了極大的困難。

目前，普通的分析測試方法，如x-射線衍射分析，傅里葉紅外光譜，掃描電子顯微鏡，對腐爛的古代羊毛均很難做出分析。國內(nèi)外僅僅對羊毛形貌上的分析更是無法獲得確鑿的證據(jù)來鑒定文物。因此，亟需開發(fā)處一種更為準確，科學(xué)的方法來鑒定古代羊毛。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種定量檢測古代羊毛的方法。本發(fā)明方法能夠準確判斷出待檢文物樣品是否為古代樣品，并且能夠定量分析其受損程度。上述方法準確度高，靈敏度強，檢測方法簡便、合理。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種定量檢測古代羊毛的方法，采用如下步驟：

（a）稱取標準羊毛樣品、待檢文物樣品各一份，分別標記為樣品a和樣品b。

（b）將樣品b在70-80wt%的乙醇水溶液中常溫浸泡25-35min，然后以1800-2200r/min的速度離心處理4-6min，取下層物質(zhì)，用蒸餾水沖洗后常溫干燥，備用。

由于待檢文物樣品中含有大量的有機雜質(zhì)，會影響檢測而得精準性和靈敏性。因此事先將其在特定濃度的乙醇溶液中浸泡，一方面能夠溶解去除部分有機雜質(zhì)，另一方面待檢文物樣品浸泡后其纖維會發(fā)生一定程度的溶脹，便于后續(xù)的提取。

（c）將樣品a和樣品b按1:35-45的浴比添加至處理液中，在200-300r/min攪拌速率、55-65℃水浴、惰性氣體保護條件下加熱攪拌2-3h，得到提取液；所述處理液由亞硫酸氫鈉1.5-2.5wt%、雙氧水0.2-0.4wt%和余量的水配制而成。

經(jīng)過上述方法提取后，可以提取到羊毛中的角蛋白。

（d）將提取液冷卻至室溫，裝入截留分子量為3500-4000的透析袋中，然后完全浸入去離子水中透析2-3天，透析前12h每2h換一次水，透析12h后每4h換一次水，透析24h后每8h換一次水，透析后經(jīng)過冷凍干燥，分別得到從樣品a、樣品b中提取的提取物a和提取物b。

進行上述特定方法透析后，能夠得到特定分子量的角蛋白。

（e）將提取物a、提取物b分別溶解到含有脫氧膽酸鈉的tris-hcl溶液中，再添加二硫蘇糖醇溶液中使其濃度達到0.01mol/l，在35-45℃下反應(yīng)25-35min，待冷卻至室溫后加入碘乙酰胺，在避光條件下反應(yīng)25-35min，然后將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管中以14000-16000r/min的速率離心處理8-12min，加入胰蛋白酶進行酶解，取酶解產(chǎn)物，用c18脫鹽柱進行除鹽處理，冷凍干燥，分別得到檢測樣a、檢測樣b，將檢測樣a、檢測樣b分別溶解于0.08-0.12wt%的甲酸溶液中進行質(zhì)譜檢測。

（f）采用hplc-ms/ms對檢測樣a、檢測樣b進行分析，對分析結(jié)果進行對比；對由檢測樣a、檢測樣b得到的質(zhì)譜檢測結(jié)果進行對比分析，檢測樣a的檢測結(jié)果可獲得羊毛的一系列肽段，若檢測樣b的檢測結(jié)果也獲得了同樣或者同源的肽段，則判定樣品b為古代羊毛；若檢測樣b的檢測結(jié)果中沒有得到同樣或者同源的肽段且與羊毛氨基酸序列庫沒有相符序列，則判定樣品b不是羊毛。

上述檢測方法可采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的檢測方法。

（g）若上述檢測結(jié)果顯示樣品b為古代羊毛，則采用label-free技術(shù)對樣品a、樣品b中的蛋白質(zhì)進行定量分析，根據(jù)樣品a、樣品b的蛋白質(zhì)含量的差異，判斷古代樣品的受損程度。

上述定量分析可采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法進行分析。

作為優(yōu)選，步驟（b）中，所述乙醇水溶液濃度為75wt%，浸泡時間為30min，離心速率為2000r/min。

作為優(yōu)選，步驟（c）中，所述浴比為1:40，攪拌速率為250r/min，水浴溫度為60℃，加熱攪拌時間為2.5h。

作為優(yōu)選，步驟（c）中，所述處理液由亞硫酸氫鈉2wt%、雙氧水0.3wt%和余量的水配制而成。

作為優(yōu)選，步驟（e）中，所述tris-hcl溶液的濃度為0.05mol/l，所述脫氧膽酸鈉在tris-hcl溶液中的濃度為5wt%，碘乙酰胺添加后的終濃度為0.04wt%，避光反應(yīng)時間為30min。

作為優(yōu)選，步驟（e）中，胰蛋白酶的添加量為1微克每50微升的tris-hcl溶液，酶解時間為20-28h，酶解溫度為35-59℃。

作為優(yōu)選，步驟（e）中，所述甲酸濃度為0.1wt%。

作為優(yōu)選，所述hplc-ms/ms的檢測條件為：液相采用100分鐘梯度，流速為200nl/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集選擇信號排名前30的多肽進行碎裂，蛋白數(shù)據(jù)庫檢索采用proteomediscoverersoftware。

與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明以羊毛中的角蛋白為對象，對待檢文物樣品進行分析，將通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到的待檢文物樣品的序列和標準羊毛的氨基酸序列進行對比分析，可以判定該待檢文物樣品的質(zhì)地是否為羊毛，對古代羊毛。

進一步地，在確認該文物樣品為羊毛后，通過對樣品中的蛋白質(zhì)進行定量分析，有助于分析文物樣的受損程度，為考古學(xué)研究提供參考價值。

本發(fā)明方法能夠有效鑒別古代羊毛，擺脫了普通檢測分析方法的局限性，能夠?qū)悠愤M行一級結(jié)構(gòu)的準確鑒定；使用溶液內(nèi)酶切的方法使得實驗操作簡單，實驗靈敏度高。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

實施例1

一種定量檢測古代羊毛的方法，采用如下步驟：

（a）稱取標準羊毛樣品、待檢文物樣品各一份，分別標記為樣品a和樣品b。

（b）將樣品b在75wt%的乙醇水溶液中常溫浸泡30min，然后以2000r/min的速度離心處理5min，取下層物質(zhì)，用蒸餾水沖洗后常溫干燥，備用。

（c）將樣品a和樣品b按1:40的浴比添加至處理液中，在200-300r/min攪拌速率、60℃水浴、惰性氣體保護條件下加熱攪拌2.5h，得到提取液；所述處理液由亞硫酸氫鈉2wt%、雙氧水0.3wt%和余量的水配制而成。

（d）將提取液冷卻至室溫，裝入截留分子量為3500的透析袋中，然后完全浸入去離子水中透析2.5天，透析前12h每2h換一次水，透析12h后每4h換一次水，透析24h后每8h換一次水，透析后經(jīng)過冷凍干燥，分別得到從樣品a、樣品b中提取的提取物a和提取物b。

（e）將提取物a、提取物b分別溶解到含有5wt%的脫氧膽酸鈉的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫蘇糖醇溶液中使其濃度達到0.01mol/l，在40℃下反應(yīng)30min，待冷卻至室溫后加入碘乙酰胺使其終濃度為0.04wt%，在避光條件下反應(yīng)30min，然后將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管中以15000r/min的速率離心處理10min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）進行酶解，酶解溫度為37℃，時間為24h，取酶解產(chǎn)物，用c18脫鹽柱進行除鹽處理，冷凍干燥，分別得到檢測樣a、檢測樣b，將檢測樣a、檢測樣b分別溶解于0.1wt%的甲酸溶液中進行質(zhì)譜檢測。

（f）采用hplc-ms/ms對檢測樣a、檢測樣b進行分析，對分析結(jié)果進行對比。

檢測結(jié)果顯示：檢測樣a的檢測結(jié)果獲得了羊毛的一系列肽段，同時檢測樣b的檢測結(jié)果也獲得了同源的肽段，因此判定樣品b為古代羊毛。

其中，所述hplc-ms/ms的檢測條件為：液相采用100分鐘梯度，流速為200nl/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集選擇信號排名前30的多肽進行碎裂，蛋白數(shù)據(jù)庫檢索采用proteomediscoverersoftware。

（g）采用label-free技術(shù)對樣品a、樣品b中的蛋白質(zhì)進行定量分析，根據(jù)樣品a、樣品b的蛋白質(zhì)含量的差異，判斷古代樣品的受損程度。

實施例2

一種定量檢測古代羊毛的方法，采用如下步驟：

（a）稱取標準羊毛樣品、待檢文物樣品各一份，分別標記為樣品a和樣品b。

（b）將樣品b在70wt%的乙醇水溶液中常溫浸泡35min，然后以1800r/min的速度離心處理6min，取下層物質(zhì)，用蒸餾水沖洗后常溫干燥，備用。

（c）將樣品a和樣品b按1:35的浴比添加至處理液中，在300r/min攪拌速率、55℃水浴、惰性氣體保護條件下加熱攪拌3h，得到提取液；所述處理液由亞硫酸氫鈉1.5wt%、雙氧水0.2wt%和余量的水配制而成。

（d）將提取液冷卻至室溫，裝入截留分子量為4000的透析袋中，然后完全浸入去離子水中透析3天，透析前12h每2h換一次水，透析12h后每4h換一次水，透析24h后每8h換一次水，透析后經(jīng)過冷凍干燥，分別得到從樣品a、樣品b中提取的提取物a和提取物b。

（e）將提取物a、提取物b分別溶解到含有5wt%的脫氧膽酸鈉的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫蘇糖醇溶液中使其濃度達到0.01mol/l，在35℃下反應(yīng)35min，待冷卻至室溫后加入碘乙酰胺使其終濃度為0.04wt%，在避光條件下反應(yīng)25min，然后將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管中以14000r/min的速率離心處理12min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）進行酶解，酶解溫度為35℃，時間為28h，取酶解產(chǎn)物，用c18脫鹽柱進行除鹽處理，冷凍干燥，分別得到檢測樣a、檢測樣b，將檢測樣a、檢測樣b分別溶解于0.08wt%的甲酸溶液中進行質(zhì)譜檢測。

（f）采用hplc-ms/ms對檢測樣a、檢測樣b進行分析，對分析結(jié)果進行對比。檢測結(jié)果顯示，檢測樣a的檢測結(jié)果獲得了羊毛的一系列肽段，檢測樣b的檢測結(jié)果中沒有得到同樣或者同源的肽段且與羊毛氨基酸序列庫沒有相符序列，因此判定樣品b不是羊毛。

其中，所述hplc-ms/ms的檢測條件為：液相采用100分鐘梯度，流速為200nl/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集選擇信號排名前30的多肽進行碎裂，蛋白數(shù)據(jù)庫檢索采用proteomediscoverersoftware。

實施例3

一種定量檢測古代羊毛的方法，采用如下步驟：

（a）稱取標準羊毛樣品、待檢文物樣品各一份，分別標記為樣品a和樣品b。

（b）將樣品b在80wt%的乙醇水溶液中常溫浸泡25min，然后以2200r/min的速度離心處理4min，取下層物質(zhì)，用蒸餾水沖洗后常溫干燥，備用。

（c）將樣品a和樣品b按1:45的浴比添加至處理液中，在200r/min攪拌速率、65℃水浴、惰性氣體保護條件下加熱攪拌2h，得到提取液；所述處理液由亞硫酸氫鈉2.5wt%、雙氧水0.4wt%和余量的水配制而成。

（d）將提取液冷卻至室溫，裝入截留分子量為3500的透析袋中，然后完全浸入去離子水中透析3天，透析前12h每2h換一次水，透析12h后每4h換一次水，透析24h后每8h換一次水，透析后經(jīng)過冷凍干燥，分別得到從樣品a、樣品b中提取的提取物a和提取物b。

（e）將提取物a、提取物b分別溶解到含有5wt%的脫氧膽酸鈉的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫蘇糖醇溶液中使其濃度達到0.01mol/l，在45℃下反應(yīng)25min，待冷卻至室溫后加入碘乙酰胺使其終濃度為0.04wt%，在避光條件下反應(yīng)35min，然后將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管中以16000r/min的速率離心處理8min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）進行酶解，酶解溫度為39℃，時間為20h，取酶解產(chǎn)物，用c18脫鹽柱進行除鹽處理，冷凍干燥，分別得到檢測樣a、檢測樣b，將檢測樣a、檢測樣b分別溶解于0.12wt%的甲酸溶液中進行質(zhì)譜檢測。

（f）采用hplc-ms/ms對檢測樣a、檢測樣b進行分析，對分析結(jié)果進行對比。檢測結(jié)果顯示，檢測樣a的檢測結(jié)果獲得了羊毛的一系列肽段，檢測樣b的檢測結(jié)果中沒有得到同樣或者同源的肽段且與羊毛氨基酸序列庫沒有相符序列，則判定樣品b不是羊毛。

其中，所述hplc-ms/ms的檢測條件為：液相采用100分鐘梯度，流速為200nl/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集選擇信號排名前30的多肽進行碎裂，蛋白數(shù)據(jù)庫檢索采用proteomediscoverersoftware。

本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。