本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測(cè)試方法及裝置，可用于快速檢測(cè)各類樣品的微區(qū)反斯托克斯散射(cars)光譜，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨成像與探測(cè)。

技術(shù)背景

光學(xué)顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和材料科學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而隨著現(xiàn)代科學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)顯微成像的要求也從結(jié)構(gòu)成像轉(zhuǎn)向功能成像。1990年，共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的成功應(yīng)用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，具備共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又兼有無(wú)傷檢測(cè)和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結(jié)構(gòu)測(cè)量與分析的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、石油化工、食品、藥物、刑偵等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的自發(fā)拉曼散射成像技術(shù)由于拉曼散射本身特性導(dǎo)致其發(fā)射信號(hào)極弱，即便用高強(qiáng)度的激光激發(fā)，要得到一副對(duì)比度好的光譜圖像，依然需要很長(zhǎng)的作用時(shí)間。這種長(zhǎng)時(shí)間作用限制了拉曼顯微技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。基于相干拉曼效應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)過(guò)程能夠很大程度上增強(qiáng)拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。相干拉曼效應(yīng)是通過(guò)受激激發(fā)的光將分子鎖定在振動(dòng)能級(jí)上，這種方法產(chǎn)生的振動(dòng)信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成非線性關(guān)系，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)換效率，曝光時(shí)間短，對(duì)樣品的損害也比較小，同時(shí)它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的產(chǎn)生是一個(gè)三階非線性光學(xué)過(guò)程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測(cè)光。一般而言，為了減少光源的數(shù)量，簡(jiǎn)化過(guò)程，常用泵浦光代替探測(cè)光，它們之間的關(guān)系如圖2所示，當(dāng)泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的頻率之差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，將激發(fā)出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的產(chǎn)生過(guò)程包含特定的拉曼活性分子的振動(dòng)模式和導(dǎo)致分子從基態(tài)至激發(fā)態(tài)振動(dòng)躍遷的入射光場(chǎng)的相互作用過(guò)程，它的能級(jí)示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強(qiáng)對(duì)cars過(guò)程的貢獻(xiàn)，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強(qiáng)對(duì)cars過(guò)程的貢獻(xiàn)；當(dāng)ep和es之間的頻差與拉曼活性分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，激發(fā)出的信號(hào)得到共振增強(qiáng)；

傳統(tǒng)cars顯微術(shù)大多采用兩個(gè)單波長(zhǎng)激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，而且傳統(tǒng)cars顯微術(shù)沒(méi)有強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)的定焦能力，導(dǎo)致實(shí)際光譜探測(cè)位置往往處于離焦位置。即便離焦位置也能激發(fā)出樣品的拉曼光譜并被針孔后的光譜儀探測(cè)，但是強(qiáng)度并不能合理表征該點(diǎn)正確的光譜信號(hào)強(qiáng)度。在cars顯微系統(tǒng)中，只有當(dāng)系統(tǒng)精確定焦，才能獲得最佳空間分辨力和最好的光譜探測(cè)能力。

上述原因限制了cars顯微系統(tǒng)探測(cè)微區(qū)光譜的能力，制約了其在更精細(xì)微區(qū)光譜測(cè)試與分析場(chǎng)合中的應(yīng)用?；谏鲜銮闆r，本發(fā)明提出將系統(tǒng)收集到的樣品表面散射的強(qiáng)于樣品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光進(jìn)行高精度探測(cè)，使其與光譜探測(cè)系統(tǒng)有機(jī)融合，進(jìn)行空間位置信息和光譜信息的同步探測(cè)，以實(shí)現(xiàn)高空間分辨的、高光譜分辨的差動(dòng)共焦cars圖譜成像和探測(cè)。

本發(fā)明專利的核心思想是選用超連續(xù)譜脈沖激光器和單波長(zhǎng)脈沖激光器作為激發(fā)光源，擴(kuò)大激發(fā)光譜范圍，提高光譜激發(fā)強(qiáng)度；將共焦探測(cè)光路分成兩個(gè)部分，兩個(gè)探測(cè)光路的光電點(diǎn)探測(cè)器分別置于焦前焦后等距位置來(lái)實(shí)現(xiàn)差動(dòng)探測(cè)，根據(jù)差動(dòng)的原理，實(shí)現(xiàn)雙極性絕對(duì)零點(diǎn)跟蹤測(cè)量，精確定焦，實(shí)現(xiàn)高空間分辨；精確定焦后，進(jìn)行光譜探測(cè)，獲得最佳光譜分辨能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種高空間分辨的反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測(cè)試方法及其裝置。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測(cè)試方法，包括以下步驟：

a)超連續(xù)譜激光由超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出，經(jīng)過(guò)帶通濾光片(4)后通過(guò)一個(gè)二向色鏡(5)與單波長(zhǎng)激光器(2)發(fā)出的單波長(zhǎng)激光匯合，通過(guò)調(diào)整光路使兩束光束時(shí)序一致、空間重合(單波長(zhǎng)激光包絡(luò)于連續(xù)譜激光)；混合光束經(jīng)過(guò)半反半透棱鏡(6)由顯微物鏡(8)會(huì)聚在被測(cè)樣品(9)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品(9)光譜特性的cars光；

b)cars光和瑞利光經(jīng)過(guò)二向色鏡(11)后分成兩束，其中包含cars光的光束進(jìn)入光譜探測(cè)單元(12)，另一束包含瑞利光的光束進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)；在光譜探測(cè)單元(12)中，包含cars光的光束先經(jīng)過(guò)帶通濾光片(13)，濾除光束中的非cars干擾光，然后通過(guò)第一聚光鏡(14)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(17)，獲得cars光譜信息i(λ)；另一束載有瑞利光的光束通過(guò)半反半透棱鏡(19)分成兩束，分別進(jìn)行焦前、焦后探測(cè)，其中一束光通過(guò)第三聚光鏡(20)后通過(guò)位于焦前的第二針孔(21)濾除雜散光后被第一光電探測(cè)器(22)探測(cè)，獲得前焦信號(hào)i(u0-um)，另一束光通過(guò)第四聚光鏡(23)后通過(guò)位于焦后的第三針孔(24)濾除雜散光后被第二光電探測(cè)器(25)探測(cè)，獲得后焦信號(hào)i(u0+um)，其中um為第一針孔和第二針孔相對(duì)于物鏡焦點(diǎn)的偏移距離。

c)將前焦信號(hào)i(u0-um)與后焦信號(hào)i(u0+um)歸一化相減后，得到差動(dòng)共焦曲線i(um)，利用差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線的“過(guò)零點(diǎn)”與測(cè)量物鏡焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)特性，通過(guò)“過(guò)零點(diǎn)”觸發(fā)來(lái)精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的幾何探測(cè)和空間定位。

d)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理得到被測(cè)樣品(9)表面位置(激發(fā)光斑焦點(diǎn))，控制z向平移臺(tái)(7)帶動(dòng)顯微物鏡(8)移動(dòng)，使激光聚焦在被測(cè)樣品(9)上，通過(guò)光譜探測(cè)單元(12)獲取該點(diǎn)的cars光譜信息。

e)單獨(dú)處理瑞利光的信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨的三維尺度層析成像；單獨(dú)處理cars光譜信號(hào)，可獲得光譜圖像；同時(shí)處理瑞利信號(hào)和cars光譜信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨的圖譜層析成像，即實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品幾何位置信息和光譜信息的圖譜合一成像與探測(cè)。

特別的，在本發(fā)明方法中，激發(fā)光束由兩束頻率相同，時(shí)間一致的脈沖激光組成，其中一束是單波長(zhǎng)脈沖激光，作為泵浦光和探測(cè)光，另一束是超連續(xù)譜脈沖激光，作為斯托克斯光。

特別的，在本發(fā)明方法中，光譜儀(17)前添加針孔(15)可過(guò)濾雜散光，提高光譜探測(cè)的信噪比。

特別的，在本發(fā)明方法中，激發(fā)光束包括線偏光、圓偏光、徑向偏振光等偏振光束和由光瞳濾波等技術(shù)生成的結(jié)構(gòu)光束，由此提高系統(tǒng)光譜信號(hào)信噪比和系統(tǒng)橫向分辨率。

特別的，在本發(fā)明方法中，通過(guò)匹配不同譜帶的濾光片，選擇不同譜段的斯托克斯光，可以實(shí)現(xiàn)不同譜段的光譜探測(cè)；其中，帶通濾光片(4)與帶通濾光片(13)的濾光譜帶關(guān)于單波長(zhǎng)激光器(2)的中心波長(zhǎng)對(duì)稱。

特別的，在本發(fā)明方法中，激光發(fā)射單元(1)還可以用單波長(zhǎng)激光器(2)加光子晶體光纖(34)進(jìn)行光譜展寬實(shí)現(xiàn)，此外，將光譜探測(cè)單元(12)中的光譜儀(17)替換成光電點(diǎn)探測(cè)器，旋轉(zhuǎn)偏振片(38)可以實(shí)現(xiàn)光譜掃描輸出，進(jìn)而激發(fā)cars光譜并由光電點(diǎn)探測(cè)器探測(cè)得到cars光譜信號(hào)；

本發(fā)明提供了一種反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置包括：光譜激發(fā)單元、位于光譜激發(fā)單元入射方向的激光發(fā)射單元(1)、位于光譜激發(fā)單元出射方向的二向色單元(11)、位于二向色單元(11)透射方向的光譜探測(cè)單元(12)、位于二向色單元(11)反射方向的差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)、控制整個(gè)系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)(39)。激光發(fā)射單元(1)由單波長(zhǎng)脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜脈沖激光器(3)、帶通濾光片(4)和二向色鏡(5)組成；光譜激發(fā)單元由半反半透棱鏡(6)、光瞳濾波器(32)、z向平移臺(tái)(7)、顯微物鏡(8)、待測(cè)樣品(9)和x-y平移臺(tái)(10)組成；二向色單元(11)即二向色鏡(11)；光譜探測(cè)單元(12)由帶通濾光片(13)、第一聚光鏡(14)、第一針孔(15)、第二聚光鏡(16)和光譜儀(17)組成；激光差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)由半反半透棱鏡(19)、第三聚光鏡(20)、第二針孔(21)、第一光電探測(cè)器(22)、第四聚光鏡(23)、第三針孔(24)、第二光電探測(cè)器(25)組成，其中，第二針孔(21)位于第三聚光鏡(20)焦前，距離為s1，第三針孔(24)位于第四聚光鏡(23)焦后，距離為s2，s1＝s2。

在本發(fā)明裝置中，二向色鏡(11)與分光棱鏡(6)反射光束軸線的夾角可變，可選擇適當(dāng)?shù)慕嵌纫詽M足本裝置的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，從而提高系統(tǒng)的靈活性。

在本發(fā)明裝置中，可通過(guò)計(jì)算機(jī)(39)控制切換不同倍數(shù)的顯微物鏡，輔助測(cè)量和觀測(cè)。

在本發(fā)明裝置中，z向平移臺(tái)(7)、x-y平移臺(tái)(10)、光譜探測(cè)單元(12)、差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)均由計(jì)算機(jī)(39)實(shí)現(xiàn)聯(lián)動(dòng)控制與測(cè)量。

有益效果

本發(fā)明方法，對(duì)比已有技術(shù)具有以下創(chuàng)新點(diǎn)：

1、本發(fā)明將激光差動(dòng)共焦顯微技術(shù)與cars光譜探測(cè)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，利用差動(dòng)共焦曲線“零點(diǎn)”位置與顯微物鏡焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)的特性，精確捕捉激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置并探測(cè)光譜信息，從而實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜層析成像與探測(cè)。

2、本發(fā)明中利用二向色鏡將瑞利光和載有樣品信息的cars光進(jìn)行分離，其中瑞利光進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)單元實(shí)現(xiàn)幾何位置探測(cè)，cars光進(jìn)入光譜探測(cè)單元實(shí)現(xiàn)cars光譜探測(cè)，通過(guò)精準(zhǔn)定焦捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)的光譜信息，提高了系統(tǒng)光譜探測(cè)靈敏度。此外，二向色分光裝置可以根據(jù)需要調(diào)整角度，方便結(jié)構(gòu)裝調(diào)。

3、本發(fā)明將差動(dòng)共焦顯微系統(tǒng)和cars光譜成像系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上和功能上結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)幾何參數(shù)的層析成像，又可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)的光譜探測(cè)，還可實(shí)現(xiàn)圖譜層析成像。

本發(fā)明方法，對(duì)比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明采用的差動(dòng)共焦探測(cè)方式，利用差動(dòng)相減噪聲相消的特性，抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)。

2、本發(fā)明利用差動(dòng)共焦技術(shù)對(duì)測(cè)量聚焦光斑進(jìn)行高精度定位，并對(duì)焦點(diǎn)位置進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤測(cè)量，消除溫度和擾動(dòng)等環(huán)境影響，實(shí)現(xiàn)cars譜探測(cè)始終精確對(duì)應(yīng)最小激發(fā)聚焦光斑區(qū)域的樣品光譜，大幅提高現(xiàn)有cars顯微鏡的微區(qū)光譜探測(cè)能力和幾何位置探測(cè)能力。

3、本發(fā)明采用超連續(xù)激光匹配單波長(zhǎng)激光作為激發(fā)光源，可以實(shí)現(xiàn)寬譜帶cars光譜探測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為摘要附圖，即本發(fā)明基本實(shí)施圖；

圖2為相干反斯托克斯(cars)光激發(fā)原理圖；

圖3為cars光與泵浦光、斯托克斯光的關(guān)系圖；

圖4為反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖5為差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線圖；

圖6為改進(jìn)光譜探測(cè)的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖7為加光瞳濾波器的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖8為二向色鏡方向可調(diào)整的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖9為單激光器的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖10為時(shí)域掃描的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖；

圖11為反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試裝置圖，即實(shí)施例用圖；

圖中，1-激光發(fā)射單元、2-單波長(zhǎng)激光光源、3-超連續(xù)譜激光光源、4-帶通濾光片、5-二向色鏡、6-分光棱鏡、7-z向平移臺(tái)、8-顯微物鏡、9-被測(cè)樣品、10-x-y平移臺(tái)、11-二向色鏡、12、光譜探測(cè)單元、13-帶通濾光片、14-第一聚光鏡、15-第一針孔、16-第二聚光鏡、17-光譜儀、18-差動(dòng)共焦探測(cè)單元、19-分光棱鏡、20-第三聚光鏡、21-第二針孔、22-第一光電探測(cè)器、23-第四聚光鏡、24-第三針孔、25-第二光電探測(cè)器、26-減法電路、27-前焦光斑、28-前焦曲線、29-后焦光斑、30-后焦曲線、31-差動(dòng)曲線、32-光瞳濾波器、33-偏振分光棱鏡、34-光子晶體光纖、35-第一反射鏡、36-光學(xué)延時(shí)器、37-第二反射鏡、38-偏振片、39-光電點(diǎn)探測(cè)器、40-計(jì)算機(jī)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖4是反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜探測(cè)方法示意圖。首先，選用一個(gè)單波長(zhǎng)脈沖激光器(2)作為泵浦光源和探測(cè)光源，由它發(fā)出泵浦光(探測(cè)光)，然后選用一個(gè)頻率與之一致的超連續(xù)譜脈沖激光器(3)作為斯托克斯光源，在經(jīng)過(guò)帶通濾光片(4)后得到要求波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)譜激光，通過(guò)調(diào)節(jié)光學(xué)結(jié)構(gòu)，使兩束激光通過(guò)二向色鏡(5)時(shí)間一致，空間重合；混合后的光先經(jīng)過(guò)一個(gè)分光棱鏡(6)，后通過(guò)一個(gè)固定在z向平移臺(tái)(7)上的高倍顯微物鏡(8)聚焦在被測(cè)樣品(9)上；由于在緊聚焦的情況下，相位匹配的條件易滿足，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品光譜特性的cars光；cars光和瑞利光經(jīng)二向色鏡(11)后分別到達(dá)光譜探測(cè)單元(12)和差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)；其中，光譜探測(cè)單元(12)對(duì)cars光進(jìn)行光譜探測(cè)，差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)對(duì)瑞利光進(jìn)行幾何位置探測(cè)。

在差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)中，第二針孔(21)位于第三聚光鏡(20)焦點(diǎn)前距離為s1的位置，由第一光電探測(cè)器(22)獲得前焦信號(hào)(28)；第三針孔(24)位于第四聚光鏡(23)焦點(diǎn)后距離為s2位置(s1＝s2)，由第二光電探測(cè)器(25)獲得后焦信號(hào)(30)；將前焦信號(hào)和后焦信號(hào)做差處理，即得到差動(dòng)共焦曲線(31)，即圖5。

如圖6所示，在光譜探測(cè)單元(12)中，添加第一針孔(15)過(guò)濾雜散光，再由第二聚光鏡(16)將cars光會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(17)，由此提高光譜探測(cè)的信噪比；

在分光棱鏡(6)和顯微物鏡(8)之間添加光瞳濾波器(32)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光束，將獲得更高空間分辨力的光譜探測(cè)效果，即圖7。

在本發(fā)明基本實(shí)施方法中，二向色鏡(11)與分光棱鏡(6)反射光束軸線的夾角可變，相對(duì)應(yīng)的共焦探測(cè)單元(18)的位置可以調(diào)整，即圖8，這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有利于本發(fā)明方法的實(shí)現(xiàn)。

圖9是單激光器的反射式差動(dòng)共焦cars顯微測(cè)試方法示意圖，目的是將激光發(fā)射單元的雙激光器輸入改為單激光器輸入，降低成本；單波長(zhǎng)脈沖激光器(2)發(fā)出單波長(zhǎng)激光，經(jīng)偏振分光棱鏡(33)分光，透射部分進(jìn)入光子晶體光纖(34)進(jìn)行譜帶展寬并用帶通濾波片(4)進(jìn)行特定要求波長(zhǎng)截取，反射部分經(jīng)第一反射鏡(35)、光學(xué)延時(shí)器(36)和第二反射鏡(37)后與展寬后的連續(xù)譜激光在二向色鏡(5)處進(jìn)行耦合，輸出空間一致、時(shí)間一致的混合光束，對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行cars光譜激發(fā)。其中，光學(xué)延時(shí)線(36)的作用是保證兩束激光時(shí)序重合。

將圖9中光譜探測(cè)單元(12)中的光譜儀(17)替換成光電點(diǎn)探測(cè)器(39)，在偏振分光棱鏡(33)和光子晶體光纖(34)之間添加偏振片(38)，即構(gòu)成圖10；通過(guò)旋轉(zhuǎn)偏振片(38)，改變光束的偏振態(tài)，使光子晶體光纖(34)輸出的光束實(shí)現(xiàn)光譜掃描輸出，結(jié)合光學(xué)延時(shí)線(36)可以實(shí)現(xiàn)時(shí)域掃描cars光譜激發(fā)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)寬譜帶的cars光譜測(cè)量。

實(shí)施例

在本實(shí)施例中，采用波長(zhǎng)為532nm的皮秒激光器作為泵浦光源和探測(cè)光源，采用重復(fù)頻率與之一致的超連續(xù)譜皮秒激光器添加550～650nmm帶通濾光片作為斯托克斯光源，在滿足空間重合，時(shí)間一致的條件下混合出射，通過(guò)光瞳濾波器獲得結(jié)構(gòu)光束后通過(guò)高倍顯微物鏡緊聚焦在樣品上，此時(shí)滿足相位匹配條件，激發(fā)出波長(zhǎng)范圍在450～515nm的反斯托克斯光(cars)和波長(zhǎng)為532nm的瑞利光。

如圖11所示,為反射式差動(dòng)共焦cars顯微光譜測(cè)試裝置，其測(cè)試步驟如下：

首先，在激光發(fā)射單元(1)中，超連續(xù)譜激光器(3)發(fā)出的連續(xù)譜激光通過(guò)帶通濾光片(4)濾光后得到550～650的寬帶激光，然后與單波長(zhǎng)(532nm)激光器(2)發(fā)出單色激光在二向色鏡(5)處匯合,形成混合光束，其中，這兩束激光重復(fù)頻率一致，到達(dá)二向色鏡(5)時(shí)間一致，光束匯合后能夠完全重合(泵浦光斑完全包絡(luò)于斯托克斯光斑)；混合光束經(jīng)過(guò)分光棱鏡(6)后，到達(dá)光瞳濾波器(32)，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光束；結(jié)構(gòu)光束通過(guò)位于z向平移臺(tái)(7)上的顯微物鏡(8)緊聚焦在被測(cè)樣品(9)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品(9)光譜特性的cars光。

此時(shí)，對(duì)樣品掃描可通過(guò)以下方式完成：由位于顯微物鏡(8)上的pzt(7)實(shí)現(xiàn)z向掃描，由位于樣品(9)下的載物臺(tái)(10)實(shí)現(xiàn)x-y方向位移掃描，或在激光出射后的光路中添加振鏡掃描結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)x-y方向掃描。

被測(cè)樣品反射回的光束包含斯托克斯光λs、泵浦光λ0、瑞利光λ0、cars光λas；其中，cars光λas和斯托克斯光λs進(jìn)入光譜探測(cè)單元(12)，532nm的泵浦光和瑞利光經(jīng)二向色鏡(11)反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)。在光譜探測(cè)單元(12)中，由斯托克斯光λs和cars光λas混合的光先經(jīng)過(guò)450～515nm的帶通濾光片(13)后只保留cars光，然后通過(guò)第一聚光鏡(14)會(huì)聚通過(guò)第一針孔(15)，過(guò)濾環(huán)境光后再由第二聚光鏡(16)會(huì)聚進(jìn)入光譜儀(17)，從而探測(cè)得到cars光譜i(λ)，其中λ為被測(cè)樣品(9)受激發(fā)光所激發(fā)出cars光的波長(zhǎng)。在差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)中，瑞利光λ0先經(jīng)過(guò)一個(gè)半反半透分光棱鏡(19)分光，一半光通過(guò)第三聚光鏡(20)會(huì)聚通過(guò)位于焦前的針孔(21)，最終被第一光電探測(cè)器(22)所探測(cè)，得到前焦信號(hào)i(u0+um)；另一半光通過(guò)第四聚光鏡(23)會(huì)聚通過(guò)位于焦后的針孔(24)，最終被第二光電探測(cè)器(25)所探測(cè)，得到后焦信號(hào)i(u0-um)。差動(dòng)相減模塊26是一個(gè)減法電路，能夠?qū)⑶敖剐盘?hào)與后焦信號(hào)做差，獲得差動(dòng)信號(hào):

i(um)＝i(uo+um)-i(uo-um)

其中，i(u0+um)為前焦響應(yīng)，i(uo-um)為后焦響應(yīng)，i(um)為差動(dòng)共焦響應(yīng)；uo為軸向偏移，um為針孔軸向偏移量。激光差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線(31)的“零點(diǎn)”與激發(fā)光束的聚焦焦點(diǎn)精確對(duì)應(yīng)，通過(guò)響應(yīng)曲線(31)的“零點(diǎn)”獲得被測(cè)樣品(9)表面的高度信息，結(jié)合連接平移臺(tái)(10)的位移傳感器反饋的位置信息通過(guò)計(jì)算機(jī)(40)重構(gòu)出被測(cè)樣品(9)的表面三維形貌i(x,y,z)。

計(jì)算機(jī)(40)控制z向平移臺(tái)(7)使激光精確聚焦在被測(cè)樣品(9)表面，激發(fā)出能正確表征被測(cè)樣品光譜特性的cars光譜i(λ)，被光譜探測(cè)單元(12)采集，通過(guò)計(jì)算機(jī)(40)將位置信息i(x,y,z)和光譜信息i(λ)融合，完成被測(cè)樣品(9)的三維重構(gòu)及光譜信息融合i(x,y,z,r)。此外，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)還貫穿于整個(gè)系統(tǒng)，計(jì)算機(jī)(40)用于實(shí)現(xiàn)對(duì)z向平移臺(tái)(7)、x-y平移臺(tái)(10)的位移控制、差動(dòng)共焦信號(hào)和cars光譜信號(hào)的采集處理以及數(shù)據(jù)融合處理。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光發(fā)射單元(1)，分光棱鏡(6)，在分光棱鏡(6)透射方向放置光瞳濾波器(32)、z向平移臺(tái)(7)、顯微物鏡(8)、被測(cè)樣品(9)、x-y平移臺(tái)(10)，在分光棱鏡(6)反射方向放置二向色鏡(11)，在二向色鏡(11)透射方向放置光譜探測(cè)單元(12)，在二向色鏡(11)反射方向放置差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)。激光發(fā)射單元(1)包括位于二向色鏡(5)透射方向的超連續(xù)譜激光器(3)、帶通濾光片(4)和二向色鏡(5)反射方向的單波長(zhǎng)脈沖激光器(2)；光譜探測(cè)單元(12)中依次放置帶通濾光片(13)、第一聚光鏡(14)、第一針孔(15)、第二聚光鏡(16)、光譜儀(17)；在差動(dòng)共焦探測(cè)單元(18)中，在分光棱鏡(19)透射方向依次放置第三聚光鏡(20)、第二針孔(21)、第一光電探測(cè)器(22)，在分光棱鏡(19)反射方向依次放置第四聚光鏡(23)、第三針孔(24)、第二光電探測(cè)器(25)；在整個(gè)系統(tǒng)中，單波長(zhǎng)脈沖激光器(2)、超連續(xù)譜激光器(3)、x-y平移臺(tái)(10)、z向平移臺(tái)(7)、光譜儀(17)、第一光電探測(cè)器(22)、第二光電探測(cè)器(25)、減法電路(26)均受計(jì)算機(jī)(40)控制，系統(tǒng)得到的三維位置信息和光譜信息也由計(jì)算機(jī)(40)進(jìn)行融合處理。

以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作了說(shuō)明，但這些說(shuō)明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書(shū)限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上進(jìn)行的改動(dòng)都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。