本發(fā)明涉及一種生物實驗器械和方法，具體地說，涉及一種用于不貼壁細(xì)胞免疫染色的染色管及染色方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞免疫染色是指用標(biāo)記(一般采用熒光、冷光物質(zhì)或者酶標(biāo)記)的抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位或定量檢測。不貼壁細(xì)胞由于漂浮在液體中很難進(jìn)行免疫染色，一般使用細(xì)胞甩片的方法固定于玻片上才能進(jìn)行免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色，而甩片過程會影響細(xì)胞的自然形態(tài)，可能導(dǎo)致染色結(jié)果不準(zhǔn)確。

中國專利文獻(xiàn)cn102288471a，公開日2011.12.21，公開了一種懸浮細(xì)胞的免疫熒光染色方法，所述的染色方法包括以下步驟：先收集細(xì)胞于離心管中，800g離心收集細(xì)胞，然后分別加入多聚甲醛固定、triton-x100通透、1％bsa封閉，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用800g離心的方法進(jìn)行洗滌，最后dapi染色后，滴至載玻片上封片觀察。該發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于免疫熒光染色的過程均在離心管中進(jìn)行，避開了懸浮細(xì)胞難于爬片及試驗過程容易脫落的問題，染色結(jié)果較好。

然而本申請發(fā)明人在長期的實驗過程中，經(jīng)過細(xì)致觀察和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)上述方法仍然存在一些弊端：1)離心過程中，細(xì)胞和處理溶液有較長時間的接觸，處理溶液過長時間接觸可能對染色結(jié)果產(chǎn)生不良影響；2)離心后處理溶液并不能被完全倒除，殘余的處理溶液可能影響下一步的處理效果；3)經(jīng)離心后細(xì)胞全部聚集于錐狀的離心管管底，加入處理溶液后細(xì)胞很難全部與處理溶液充分接觸；4)在移除處理溶液的過程中，難以保證細(xì)胞不被帶出，造成細(xì)胞數(shù)量的損失；5)細(xì)胞由dapi染色后需要轉(zhuǎn)移到載玻片上封片觀察，操作繁瑣。以上弊端將直接影響染色效果和結(jié)果的準(zhǔn)確性，也給實驗人員帶來不便。

綜上所述，亟需一種新的適用于不貼壁細(xì)胞的染色方法，以期獲得更準(zhǔn)確的染色結(jié)果和節(jié)省人力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于不貼壁細(xì)胞免疫染色的染色管。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種用于不貼壁細(xì)胞的免疫染色方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種用于不貼壁細(xì)胞免疫染色的染色管，設(shè)有外管、內(nèi)管和密封蓋；所述的外管設(shè)有外管管體；所述的內(nèi)管設(shè)有內(nèi)管管體、支撐臺和濾膜；所述的內(nèi)管管體底面為開口狀，內(nèi)管管體包括隔離管體和位于隔離管體下方的染色管體，且內(nèi)管管體的側(cè)壁上設(shè)有通氣窗；所述的支撐臺位于內(nèi)管管體的上端端面上，且外徑大于內(nèi)管管體的外徑；所述的濾膜孔徑為0.5-1.5μm且外緣固定在內(nèi)管管體的內(nèi)壁上；所述的密封蓋設(shè)有連接部和蓋體，所述的連接部一端連接外管，另一端連接蓋體；裝配狀態(tài)下，所述的內(nèi)管管體套接在外管管體內(nèi)，所述的支撐臺由外管管體的上端面支撐住，所述的隔離管體使染色管體與外管管體之間留有間隙，所述的通氣窗連通內(nèi)管管體與所述間隙，所述的蓋體卡扣在內(nèi)管管體上。

所述的透氣窗設(shè)于隔離管體上。

所述的隔離管體為由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀。

所述的透氣窗圍繞內(nèi)管的縱向中心軸呈對稱輻射狀排布。

所述的外管管體的上端端面設(shè)有支撐臺面，所述的支撐臺面的外徑大于外管管體的外徑；裝配狀態(tài)下，所述的支撐臺由所述支撐臺面支撐住。

所述的外管管體上段為圓柱狀，下段為圓錐狀。

所述的連接部上設(shè)有彎折部。

所述的蓋體上設(shè)有手柄。

為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種用于不貼壁細(xì)胞的免疫染色方法，所述的免疫染色方法使用了如上任一所述的染色管。

所述的免疫染色方法包括以下步驟：

a)將培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞加入到內(nèi)管管體中，離心去除培養(yǎng)基，移除廢液；

b)向內(nèi)管管體中加入固定液，固定細(xì)胞，完畢后離心去除固定液，移除廢液；

c)向內(nèi)管管體中加入triton溶液，打孔穿透細(xì)胞，完畢后離心去除triton溶液，移除廢液；

4)然后封閉、一抗孵育、一抗洗滌、二抗孵育、二抗洗滌、dapi復(fù)染，每一步處理后均離心去除廢液；

5)免疫染色完成后，拿出內(nèi)管，直接置于細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入適量pbs緩沖液或甘油封片劑，使之覆蓋內(nèi)管底部的濾膜，放置在倒置顯微鏡下觀察染色。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、使用本發(fā)明的染色管和染色方法對不貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，能夠避免常規(guī)染色方法甩片過程影響細(xì)胞自然形態(tài)的弊端，也可以避免cn102288471a所公開的染色方法的種種弊端，離心過程中，細(xì)胞和處理溶液在高速狀態(tài)下接觸時間短，溶液處理后去除徹底，同時避免了去除處理溶液過程中細(xì)胞的損失，特別適用于微量珍貴細(xì)胞的染色，離心后細(xì)胞不會過于聚集，能夠與后續(xù)步驟的處理溶液充分接觸，染色后可以直接觀察，染色效果好，結(jié)果準(zhǔn)確性高，操作簡單，節(jié)省人力；

2、本發(fā)明的染色管結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，便于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的染色管結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

本申請發(fā)明人在長期的實驗過程中，經(jīng)過細(xì)致觀察和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)中國專利文獻(xiàn)cn201110211736.x所公開的染色方法存在著如前所述的種種弊端，基于此設(shè)計了本發(fā)明的新的染色方法及配套的染色管。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

附圖中涉及的附圖標(biāo)記和組成部分如下所示：

1.外管，11.外管管體，12.支撐臺面

2.內(nèi)管，21.內(nèi)管管體，211.隔離管體，212.染色管體，22.支撐臺，23.濾膜

3.密封蓋，31.連接部，311.彎折部，32.蓋體，33.手柄

4.通氣窗

實施例1

請參見圖1，圖1是本發(fā)明的染色管結(jié)構(gòu)示意圖。所述的染色管設(shè)有外管1、內(nèi)管2和密封蓋3。所述的外管1設(shè)有外管管體11和支撐臺面12；所述的外管管體11上段為圓柱狀，下段為圓錐狀；所述的支撐臺面12位于外管管體11的上端端面上，其外徑大于外管管體11的外徑。所述的內(nèi)管2設(shè)有內(nèi)管管體21、支撐臺22和濾膜23；所述的內(nèi)管管體21底面為開口狀，內(nèi)管管體21包括隔離管體211和染色管體212，所述的隔離管體211位于染色管體212的上方，隔離管體211為由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀，且側(cè)壁上設(shè)有通氣窗4，所述的通氣窗4有四個，圍繞內(nèi)管2的縱向中心軸呈對稱輻射狀排布，所述的染色管體212為圓柱狀；所述的支撐臺22位于內(nèi)管管體21的上端端面上，其外徑大于內(nèi)管管體21的外徑；所述的濾膜23與內(nèi)管管體21的底面齊平，且外緣固定在內(nèi)管管體21的內(nèi)壁上，濾膜23的孔徑為0.5-1.5μm。所述的密封蓋3設(shè)有連接部31、蓋體32和手柄33；所述的連接部31的一端連接在外管1的支撐臺面12的側(cè)壁上，連接部31上設(shè)有彎折部311，連接部31的另一端連接蓋體32；所述的手柄33連接在蓋體上，并向外部延伸。

裝配狀態(tài)下，所述的內(nèi)管管體21套接在外管管體11內(nèi)，所述的支撐臺22位于支撐臺面12上方并由支撐臺面12支撐住，進(jìn)而使得內(nèi)管2不會掉入外管1內(nèi)部；所述的隔離管體211使染色管體212的外壁與外管管體11的內(nèi)壁之間留有間隙，所述的通氣窗4使內(nèi)管管體21的內(nèi)部與所述間隙相連通；所述的蓋體32卡扣在內(nèi)管管體21上，密封內(nèi)管管體21的頂面。

需要說明的是：所述的外管管體11的下段為圓錐狀，更便于廢液被收集到底部。所述的支撐臺面12用于支撐內(nèi)管2的支撐臺22，支撐臺面12外徑大于外管管體11的外徑，能夠形成較大的上表面，增加平衡穩(wěn)固的支撐效果。所述的濾膜23孔徑為0.5-1.5μm，細(xì)胞無法透過這層膜，液體在靜止?fàn)顟B(tài)時由于表面張力也無法滲過這層膜，當(dāng)在離心力作用下，液體得以透過這層膜掉入外管1管底，達(dá)到移除液體而不損失細(xì)胞的目的。濾膜23的材質(zhì)可以是pe等。濾膜23與內(nèi)管管體21可以是一體成型，也可以通過熱塑等工藝將其邊緣固定在內(nèi)管管體21的下端并保證邊緣呈密封狀態(tài)。所述的染色管體212用于盛放細(xì)胞和染色用的溶液。所述的隔離管體211設(shè)計成由上至下直徑逐漸縮小的圓臺柱狀，且側(cè)壁上設(shè)通氣窗4，作用是使染色管體212的外壁與外管管體11的內(nèi)壁之間形成間隙，由通氣窗4連通內(nèi)管管體21的內(nèi)部與所述間隙，更便于溶液被快速離心至外管1中，減少溶液在高速旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下與細(xì)胞的接觸時間。所述的通氣窗4不僅限于四個，但優(yōu)選為對稱分布，可防止離心不平衡，透氣窗4不僅限于設(shè)在隔離管體211上，也可以設(shè)在染色管體212上，但優(yōu)選設(shè)在隔離管體211上，能防止加液時液體經(jīng)透氣窗4灑落到內(nèi)管管體21外部。所述的彎折部311可以預(yù)塑成可彎折狀態(tài)，如彎折部311的厚度較薄，可便于密封蓋3的開合，且避免蓋體32在連接部31的拉伸作用下不能平衡地卡扣在內(nèi)管管體21上。所述的手柄33用于拇指和食指把持施力以打開或閉合密封蓋3。

實施例2

一種不貼壁細(xì)胞的免疫染色方法，其應(yīng)用實施例1所述的染色管完成免疫染色操作。更具體地，所述的免疫染色方法包括以下步驟：

1)將培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞加入到內(nèi)管管體21部分，低速離心去除培養(yǎng)基，移除廢液；

2)向內(nèi)管管體21中加入固定液，固定細(xì)胞，完畢后低速離心去除固定液，移除廢液；

3)向內(nèi)管管體21中加入triton溶液，打孔穿透細(xì)胞，完畢后低速離心去除triton溶液，移除廢液；

4)然后封閉、一抗孵育、一抗洗滌、二抗孵育、二抗洗滌、dapi復(fù)染，以此類推，每一步均低速離心去除廢液；

5)免疫染色完成后，去除內(nèi)管2，直接置于細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入適量pbs緩沖液或甘油封片劑，使之覆蓋內(nèi)管2底部的濾膜23，放置在倒置顯微鏡下觀察染色即可。

使用本發(fā)明的染色管和染色方法對不貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，能夠避免常規(guī)染色方法中甩片過程影響細(xì)胞自然形態(tài)的弊端，也可以避免cn102288471a所公開的染色方法的種種弊端，離心過程中，細(xì)胞和處理溶液在高速狀態(tài)下接觸時間短，處理溶液去除徹底，同時避免了去除處理溶液過程中細(xì)胞的損失，特別適用于微量珍貴細(xì)胞的染色，離心后細(xì)胞不會過于聚集，能夠與后續(xù)步驟的處理溶液充分接觸，染色后可以直接觀察，染色效果好，結(jié)果準(zhǔn)確性高，操作簡單，節(jié)省人力，且本發(fā)明的染色管結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，便于推廣應(yīng)用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。