本發(fā)明涉及一種對船舶壓載水中的微藻進行活性判別的技術，特別是一種船舶壓載水中微藻的活性檢測裝置和檢測方法。

背景技術：

船舶壓載水是用于為船舶提供穩(wěn)定性及調(diào)整船舶的吃水，以滿足船舶良好的操縱性能要求。船舶壓載水中含有大量的水生生物，并且由船舶壓載水造成的外來海洋生物入侵，已被全球環(huán)境基金組織(gef)確認為危害海洋的四大威脅之一。為了有效應對壓載水造成的生物入侵問題，2007年《國務院關于印發(fā)國家環(huán)境保護“十一五”規(guī)劃的通知》(國發(fā)[2007]37號)提出，“以近岸海域為重點，開展重點海域生物多樣性普查，查清外來物種入侵現(xiàn)狀，對引進外來海洋生物物種實行管理”的要求。而微藻是船舶壓載水中最普遍存在的一種生物，準確鑒別船舶壓載水中的微藻活性，篩選后進行相關研究，這對于目前船舶壓載水處理具有重大科學意義。對于我國而言,通過立法的形式來實現(xiàn)防治壓載水造成的海洋生物入侵也已成為必然。目前海事執(zhí)法部口只能通過查看船舶壓載水排放日志或經(jīng)驗法(如檢查壓載水給排管道是否有壓載水殘留等)判斷船舶是否按照規(guī)定進行壓載水置換進而判斷船舶所載圧載水是否滿足排放d-1標準,故難做出及時、準確的判斷。有害微藻是船舶圧載水中最普遍存在的一種生物,也是船舶壓載水處理和檢測的主要目標,《壓載水公約》規(guī)定,港口國授權官員有權對到港船舶進行壓載水取樣并分析,以確認處理后的壓載水是否滿足公約規(guī)定的排放標準,但現(xiàn)有的樣品的提取和分析手段不得造成船舶的不當延誤,這就要求對船舶壓載水生物監(jiān)測鑒別提出了快速和便攜性的要求。對于生物的檢測技術,傳統(tǒng)的方法是培養(yǎng)計數(shù)法,該方法廣泛應用在水生生物數(shù)量、種群研究方面,但是檢測的過程較為復雜,雖然檢測手段容易操作,但是耗時較長,同時要求專業(yè)技術人員熟知了解此領域。觀測過程需要通過肉眼判斷海洋生物的存活狀態(tài)。對于海水中的一些動態(tài)藻類,它們具有運動能力,在顯微鏡中可以觀察到游動,這種情況極容易造成漏記或者重復計數(shù)。隨著各種生物技術不斷地發(fā)展,一些簡單、快速、準確、新型的檢測方法隨之出現(xiàn)。

目前對于船舶壓載水微藻活性檢測的方法主要有：流式細胞術法、光學分析及成像方法、光學色素分析法等。

流式細胞儀計數(shù)法起源于上個世紀70年代初并得到充分發(fā)展,成為當今最先進的生物定量分析技術,是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。流式細胞儀可以高速定量分析數(shù)以萬計的細胞,研究分析單一細胞顆粒,并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù),能夠對細胞的大小、數(shù)量、細胞核、細胞器及內(nèi)部物質(zhì)等細胞參數(shù)進行精確分析。與傳統(tǒng)的細胞分析方法相比,流式細胞術法克服人工操作帶來的計數(shù)誤差,工作效率高,具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點,是目前生物數(shù)定量測定分析的標準方法之一,成為當代最先進的細胞檢測技術利用流式細胞術可對生物細胞的存活情況進行判定,基于此特點比較適合檢測壓載水中海洋生物體的數(shù)量。但并沒有被廣泛采用流式細胞儀探測個體較大的或特別微小的稀有微藻物種,壓載水樣品中的微藻尺寸范圍很廣、商用原位水下流式細胞儀的操作時間過長以及儀器體積過大價格昂貴,這些都是制約流式細胞儀應用于壓載水檢測的關鍵因素。

基于光學的微藻形態(tài)區(qū)分主要有光散射分析法和光學成像法。光散射分析法可以用于估量微藻的體積,測量結果可以初略的判斷微藻的大小并對其鑒別,但不同的光散射方向可w表征微藻顆粒體態(tài)的不同性質(zhì),前向散射與微藻體積、營養(yǎng)物、鹽度變化等因素有關,側向散射表征衡量它的形狀,后向散射受單個微藻的葉綠素含量影響較大,光散射分析法不適用于形狀不規(guī)則及非球形微藻顆粒,沒有統(tǒng)一的衡量標準,因此鑒別結果較為模糊。光學成像法是目前比較通用的方法之一,是利用ccd對微藻進行成像,而后與數(shù)據(jù)庫中已有的形狀信息進行對比,匹配來確定類型,但它存在的問題是:高性能處理器硬件和實時圖像處理算法(包括:數(shù)據(jù)庫建立,與數(shù)據(jù)庫中圖像匹配算法)是制約該方法應用的重要因素,主要用于靜態(tài)分類的方法,如果動態(tài)分類的話,就需要高速相機進行數(shù)據(jù)采集。

光合色素在植物光合作用中起著至關重要的作用,是微藻檢測鑒別的良好探針?；谏仡伾珔^(qū)分主要有分光光度法(光譜吸收法)、巧光測定術。分光光度法(光譜吸收法)是利用一定帶寬的光照福射壓載水樣品,然后觀測它吸收的光線波長的函數(shù)。由于不同微藻種類含有的輔助色素含量不同,得到的吸收光譜結果也隨著微藻種類不同而有一定差異,但這種差異很小,函數(shù)曲線變化微小,而且不管是遠程光譜測量儀器還是原位測量儀器造價都十分昂貴。巧光測定術提供更少的關于色素中相對和絕對量的詳細信息,然而,它是一種無需樣品制備的快速實時現(xiàn)場鑒別技術。熒光測定術通過測量微藻葉綠素、輔助色素的激發(fā)熒光強度并且提供輔助色素的光譜吸收信息來對微藻進斤鑒別,一些熒光測定儀器鑒別區(qū)分出多種微藻,但熒光測定儀器的組成過于精密,造價十分昂貴。

綜上分析，現(xiàn)有船舶壓載水中微藻活性檢測方法存在不同程度的缺點，如所需設備昂貴、笨重,基本采用收集樣品后拿回實驗室進行培養(yǎng)鑒定,耗時費力,效率不高,并且進行檢測的種類也相對有限,而簡單便捷的微藻活性檢測方法是船舶壓載水微藻活性檢測領域中急需解決的關鍵問題。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于已有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是要提供一種光流控無透鏡全息成像可以實現(xiàn)現(xiàn)場快速活性檢測、操作過程簡單、成本低廉且鑒定指標穩(wěn)定的船舶壓載水中微藻的活性檢測裝置和檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術方案如下：

一種光流控無透鏡全息成像微藻活性檢測裝置，其特征在于：所述裝置包括依次連接的光源組件、通光孔組件、光傳播組件、微流控芯片、圖像采集組件、圖像處理組件；

所述光源組件包括穩(wěn)壓電路、光源固定結構以及與所述通光孔組件緊密貼合的led光源，所述led光源發(fā)出的光束經(jīng)所述光傳播組件照射微流控芯片檢測區(qū)域并投射于圖像采集組件；

所述圖像采集組件承接并采集微流控芯片檢測區(qū)域在光束作用下生成的全息圖樣，此全息圖樣被送至與所述圖像采集組件相連接的圖像處理組件進行分析。

進一步的，所述通光孔組件除通光孔外，其他部分為光密閉結構，且無光的透射。

進一步的，所述led光源發(fā)射的光束經(jīng)通光孔組件與光傳播組件作用后，其光斑投射區(qū)域完全覆蓋圖像采集組件的探測區(qū)域。

進一步的，所述微流控芯片包括聚二甲基硅氧烷片和載玻片，所述聚二甲基硅氧烷片依次凹刻有檢測區(qū)域，所述檢測區(qū)域兩端對稱連接第一聚焦通道和第二聚焦通道，所述第一聚焦通道的另一端寬度漸增直至等寬連接于第一通道，所述第一通道另一端設有進液孔，所述第二聚焦通道以相同方式連接第二通道且第二通道末端設有廢液孔。

進一步的，所述led光源為裝置唯一照明光源，其未開啟時圖像采集組件不能記錄任何有用信息。

本發(fā)明的另一目的要提供一種基于上述裝置的微藻活性檢測方法，其特征在于：其包括如下步驟：

s1、樣品滴加，將船舶壓載水樣品加入到微流控芯片的進液孔中；

s2、開啟裝置，依次開啟led光源、圖像采集組件和圖像處理組件，液體樣本在自身張力的作用下沿著第一通道經(jīng)過第一聚焦通道流向檢測通道，多余液體樣品流入廢液孔中；

s3、全息圖樣采集，led光源發(fā)出的相干光經(jīng)過通光孔和光傳播組件照射在微流控芯片檢測區(qū)域的樣品上形成全息圖像并由圖像采集組件采集；

s4、全息圖樣分析，圖像采集組件采集的全息圖樣經(jīng)數(shù)據(jù)線傳輸至圖像處理組件中；

s5、微藻活性的判斷，根據(jù)全息圖樣中的微藻圖樣特征判斷微藻活性。

進一步的，步驟s5中所述微藻圖樣特征包括：

微藻細胞形成的全息圖樣中最中心的亮斑和所述亮斑外圈的暗環(huán)灰度差值；

微藻細胞形成的全息圖樣中不同級條紋之間灰度值的對比度；

微藻細胞形成的全息圖樣中的條紋級數(shù)；

微藻細胞形成的全息圖樣中不同級圓形條紋的缺口大小。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明為檢測微藻活性的小型化平臺，攜帶方便，檢測速度快，而后端的圖像處理部分亦可以采用嵌入式方法縮減設備提及，其相對于現(xiàn)有的檢測設備，具有有體積超小、重量輕、易于攜帶，可用于現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點；

2、本發(fā)明所用的器件均為市面上的通用產(chǎn)品，成本低廉。

3、本發(fā)明基于全息光學并利用不同活性微藻的光投射性質(zhì)差異進行活性檢測，檢測方法快速高效，且不需對微藻樣品進行預處理，取樣后可直接進行檢測。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為船舶壓載水中微藻活性檢測裝置結構示意圖；

圖2為本發(fā)明通光孔組件結構示意圖；

圖3為本發(fā)明微流控芯片結構示意圖；

圖4為本發(fā)明微藻活性檢測方法流程圖；

圖5為實施例扁藻的活性檢測結果；

圖6為實施例金藻的活性檢測結果；

圖7為實施例小球藻的活性檢測結果。

附圖標號說明：

1、光源組件，2、通光孔組件，3、光傳播組件，4、微流控芯片，5、圖像采集組件，6、圖像處理組件，7、聚二甲基硅氧烷片，8、載玻片，9、第一通道，10、第一聚焦通道，11、檢測通道，12、第二聚焦通道，13、第二通道，a、進液孔，b、廢液孔。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

由于活性不同的微藻形成的全息圖像不同，其形成的全息圖樣特征不同，根據(jù)上述原理本發(fā)明涉及了一種光流控無透鏡全息成像的微藻活性檢測裝置，下面結合附圖對本發(fā)明作進一步地說明。如圖1所示為微藻活性檢測裝置結構，裝置包括依次連接的光源組件(1)、通光孔組件(2)、光傳播組件(3)、微流控芯片(4)、圖像采集組件(5)、圖像處理組件(6)。光源組件(1)包括穩(wěn)壓電路、光源固定結構以及與所述通光孔組件(2)緊密貼合的led光源，所述led光源發(fā)出的光束經(jīng)所述光傳播組件照射微流控芯片檢測區(qū)域并投射于圖像采集組件(5)。圖像采集組件(5)承接并采集微流控芯片(4)檢測區(qū)域在光束作用下生成的全息圖樣，此全息圖樣被送至與所述圖像采集組件(5)相連接的圖像處理組件(6)進行分析。通光孔組件(2)除通光孔外，其他部分為光密閉結構，且無光的透射，通光孔組件的結構如圖2所示，led光源發(fā)射的光束經(jīng)通光孔組件(2)與光傳播組件(3)作用后，其光斑投射區(qū)域完全覆蓋圖像采集組件(5)的探測區(qū)域。所述led光源為裝置唯一照明光源，其未開啟時圖像采集組件(5)不能記錄任何有用信息。

如圖3所示，微流控芯片(4)包括聚二甲基硅氧烷片(7)和載玻片(8)，聚二甲基硅氧烷片(7)依次凹刻有檢測區(qū)域(11)，所述檢測區(qū)域兩端對稱連接第一聚焦通道(10)和第二聚焦通道(12)，所述第一聚焦通道(10)的另一端寬度漸增直至等寬連接于第一通道(9)，所述第一通道另一端設有進液孔，所述第二聚焦通道以相同方式連接第二通道(13)且第二通道(13)末端設有廢液孔。

另外，如圖4所示本發(fā)明還提供了一種基于上述裝置的微藻活性檢測方法，其特征在于：其包括如下步驟：

s1、樣品滴加，將船舶壓載水樣品離心后與緩沖液混合作為樣本溶液，將10μl樣本溶液滴加到微流控芯片的任意一個儲液孔中；

s2、開啟裝置，依次開啟led光源、圖像采集組件和圖像處理組件(6)，液體樣本在自身張力的作用下沿著第一通道(9)經(jīng)過第一聚焦通道(10)流向檢測通道(11)，多余液體樣品流入廢液孔中；

s3、全息圖樣采集，led光源發(fā)出的相干光經(jīng)過通光孔(2)和光傳播組件(3)照射在微流控芯片(4)檢測區(qū)域的樣品上形成全息圖像并由圖像采集組件(5)采集；

s4、全息圖樣分析，圖像采集組件(5)采集的全息圖樣經(jīng)數(shù)據(jù)線傳輸至圖像處理組件(6)中；

s5、微藻活性的判斷，根據(jù)全息圖樣中的微藻圖樣特征判斷微藻活性。

微藻細胞形成的全息圖樣中最中心的亮斑和所述亮斑外圈的暗環(huán)灰度值；微藻細胞形成的全息圖樣中不同級條紋之間灰度值的對比度；微藻細胞形成的全息圖樣中的條紋環(huán)數(shù)；微藻細胞形成的全息圖樣中不同級圓形條紋的缺口大小。

本發(fā)明在使用時，首先將船舶壓載水樣品放在微流控芯片上，將微流控芯片置于載物臺，led光源發(fā)出的相干光經(jīng)過通光孔和光傳播組件照射在放置于載物臺上的樣品上形成的衍射圖像由圖像采集組件采集。該裝置選用led作為光源，光源組件中l(wèi)ed發(fā)出的光為部分相干光，可以有效的抑制相干散斑噪聲和干擾。光源組件中的led光源發(fā)出的部分相干光通過通光孔組件中的通光孔后發(fā)散成一束球面波，發(fā)散形成的球面波經(jīng)過合適傳播距離傳播到樣品面。該裝置利用穿過樣品的支透光作為參考光，無需另外引入?yún)⒖脊?。樣品與圖像采集組件中電荷耦合元件(ccd)的距離非常近，距離在幾毫米左右，部分相干光照射在樣品上形成的的全息圖樣由圖像采集組件采集，最后將采集到的全息圖像由圖像處理組件進行處理。

活性不同的微藻形成的全息圖像不同，通過判斷全息圖的一些特征來辨別微藻細胞的活性情況。

微藻細胞形成的全息圖中最中心的亮斑和亮斑外圈的暗環(huán)灰度值有差異，微藻活細胞的全息圖中心亮斑與中心亮斑外圈暗環(huán)的灰度值差值和微藻死細胞的中心亮斑與中心亮斑外圈暗環(huán)的灰度值差值存在明顯的偏差，通過分析微藻細胞形成的全息圖像中心亮斑與中心亮斑外圈灰度差值對微藻的活性進行辨別。不同的微藻細胞的活性不同時，灰度差值的閾值對應微藻活性的具體關系也不同，如扁藻活細胞的灰度值差值大小為10～30，扁藻死細胞的灰度值差值為30～50；金藻活細胞灰度值差值大小為10～20，金藻死細胞灰度值差值大小為20～30；小球藻活細胞灰度值差值大小為10～20，小球藻死細胞灰度值差值大小為20～30。

不同活性微藻細胞形成的全息圖中不同級條紋之間灰度值的對比度有所差別，可以通過分析不同條紋的灰度值的對比度來辨別微藻細胞的活性，不同微藻細胞活性不同時，不同級條紋之間灰度值的對比度對應微藻活性的具體關系不同，如扁藻活細胞一級和二級暗紋之間的對比度在0.1左右，扁藻死細胞的一二級條紋之間的對比度在0.07左右；新月藻活細胞的一二級條紋對比度在0.065左右，新月藻死細胞的一二級條紋對比度在0.06左右。不同活性的微藻細胞形成的全息條紋的環(huán)數(shù)也不同，可以通過判斷全息圖條紋的環(huán)數(shù)來辨別微藻細胞的活性，不同微藻細胞活性不同時，條紋級數(shù)的多少對應微藻活性的具體關系不同，如塔胞藻活細胞有三級暗條紋，塔胞藻死細胞有四級暗紋；扁藻活細胞有二級暗紋，扁藻死細胞有三級暗紋。

此外，不同活性的微藻細胞形成全息圖中不同級圓形條紋的缺口大小不同，可以通過分析缺口的大小辨別微藻細胞的活性。

如圖5-圖7所示分別為將扁藻、金藻和小球藻通過本發(fā)明所述裝置和方法進行試驗后繪制的微藻全息圖像最中心亮斑和亮斑外圈暗環(huán)灰度值的差值散點圖，通過觀察實驗結果，統(tǒng)計微藻細胞形成的全息圖中最中心亮斑和亮斑外圈暗環(huán)灰度值的差值，根據(jù)差值大可得到微藻活性結果。

本發(fā)明還可以利用微藻細胞形成的全息圖樣中不同級條紋之間灰度值的對比度、微藻細胞形成的全息圖樣中的條紋環(huán)數(shù)、微藻細胞形成的全息圖樣中不同級圓形條紋的缺口大小等特征來表征微藻活性。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。