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一種基于均勻分布的微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的微流控芯片及其使用方法與流程

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一種基于均勻分布的微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的微流控芯片及其使用方法與流程

本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域,特別涉及一種基于均勻分布的微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的微流控芯片及其使用方法。



背景技術(shù):

2015年5月,英國(guó)《每日郵報(bào)》報(bào)道:“癌癥導(dǎo)致的死亡率呈逐年上升的趨勢(shì),是目前僅次于心血管疾病的第二大殺手。”統(tǒng)計(jì)顯示早期肺癌切除后的5年生存率為60~90%,而對(duì)于我國(guó)肺癌早期診斷率較低患者5年的生存率僅為10%,70~90%的癌癥病人在5年內(nèi)死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移之前,體內(nèi)一些標(biāo)記物的表達(dá)已經(jīng)發(fā)生了改變,如果能夠?qū)@些標(biāo)記物進(jìn)行準(zhǔn)確有效地檢測(cè),實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期篩查,及時(shí)采取治療措施,則能夠有效地提高患者的生存率。

在微流控免疫中,微球由于具有較大的比表面積,能夠?qū)崿F(xiàn)較高的靈敏度,而被廣泛地運(yùn)用在腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)中。和固態(tài)平面相比,免疫微球可以結(jié)合更多的生物分子,進(jìn)而增加信號(hào)分子的量,實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)的作用,提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí),在液相環(huán)境下,微球的流動(dòng)性可以增加生物分子碰撞的幾率,提高反應(yīng)效率。在基于微球的微流控免疫檢測(cè)中,熒光信號(hào)分子結(jié)合夾心法免疫分析原理是其比較常見的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),熒光信號(hào)獲取的質(zhì)量和微球的排列方式是密切相關(guān)的。由于微球在液相環(huán)境下的流動(dòng)性,芯片需要將微球攔截住,以方便后期的觀察與分析。目前,對(duì)微球的攔截可以分為外加場(chǎng)攔截和流體動(dòng)力學(xué)攔截。利用磁場(chǎng)或電場(chǎng)對(duì)特殊性質(zhì)的微球進(jìn)行驅(qū)動(dòng)或捕獲的方法往往需要產(chǎn)生外加場(chǎng)的設(shè)備,使實(shí)驗(yàn)步驟變得復(fù)雜。而流體動(dòng)力學(xué)攔截的方法,若結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)不當(dāng)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致微球在通道內(nèi)某個(gè)位置上聚集,妨礙了液體的流動(dòng)。而且在觀察時(shí),通道內(nèi)聚集的微球會(huì)發(fā)生重疊或者覆蓋,熒光下各自微球的光暈會(huì)對(duì)其熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,不利于準(zhǔn)確地分析。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于均勻分布的微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的微流控芯片及其使用方法,該微流控芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,無(wú)需復(fù)雜的流阻理論計(jì)算,可將微球均勻排布在微柱的間隙中,離散分布的微球避免了相互之間熒光信號(hào)的干擾;微球可以根據(jù)需要結(jié)合不同的抗體,實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)記物的檢測(cè);采用的孵育方法可以減少進(jìn)樣的時(shí)間,集進(jìn)樣和清洗于一體,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,可應(yīng)用于以微球?yàn)檩d體的生化檢測(cè),具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種基于均勻分布的微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的微流控芯片,所述微流控芯片包括進(jìn)樣口、出樣口、若干個(gè)與液體流動(dòng)方向平行的微柱陣列;所述微柱陣列之間的間隙為主流動(dòng)通道,微柱陣列中相鄰微柱的最窄間隙略小于微球的直徑(正好可以只容納一個(gè)微球)。

所述微柱陣列對(duì)微球的攔截是基于流體擴(kuò)散的原理。

本發(fā)明進(jìn)出樣口的設(shè)計(jì)使得各個(gè)主流動(dòng)通道存在流速差異,液體因流速差異而產(chǎn)生的擴(kuò)散使其能夠通過(guò)相鄰微柱的間隙,從流速高的通道流向流速低的通道,進(jìn)而微球可以截留在微柱之間。同時(shí),主通道水流的沖擊也防止了微球在微柱間隙中的堵塞。

所述微流控芯片在使用前進(jìn)行真空處理。

所述微流控芯片的主體材料為聚二甲基硅氧烷(pdms)。pdms是一種介孔材料,具有多孔透氣性,使用前對(duì)微流控芯片抽真空,可消除微流控通道內(nèi)在進(jìn)樣過(guò)程中因流速分布問題而產(chǎn)生的氣泡。

使用前預(yù)先對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行稀釋,優(yōu)選采用0.5%的吐溫-20進(jìn)行稀釋。消除量子點(diǎn)對(duì)pdms和微球的非特異性吸附。量子點(diǎn)能夠通過(guò)疏水相互作用與pdms和微球進(jìn)行非特異性的結(jié)合,非特異信號(hào)會(huì)干擾有效信號(hào)的獲取。吐溫-20是非離子表面活性劑,可以改變界面的親疏水性。采用0.5%的吐溫-20對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行稀釋,有效地解決了非特異吸附的問題。

使用前將參與反應(yīng)的生物分子、量子點(diǎn)和微球同時(shí)加入到離心管內(nèi),搖晃孵育,再進(jìn)行進(jìn)樣。孵育完成后直接進(jìn)樣,由于免疫反應(yīng)已全部完成,因此在進(jìn)樣的過(guò)程中,微球的攔截和多余生物分子的清洗可一步完成,使操作更加簡(jiǎn)便。

本發(fā)明是可以使微球均勻分布開,并能防止微球堵塞的微流控結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)對(duì)微球的攔截不需要外加場(chǎng),完全依賴流體動(dòng)力學(xué),操作簡(jiǎn)單。同時(shí),在對(duì)生物靶分子的檢測(cè)中,也達(dá)到了靈敏度高,特異性強(qiáng)的要求。

有益效果

本發(fā)明將微球均勻排布在微柱的間隙中,離散分布的微球避免了相互之間熒光信號(hào)的干擾;微球可以根據(jù)需要結(jié)合不同的抗體,實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)記物的檢測(cè);采用的孵育方法可以減少進(jìn)樣的時(shí)間,集進(jìn)樣和清洗于一體,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖;

圖2是本發(fā)明微流控芯片內(nèi)微球的實(shí)際分布圖;

圖3是微球的熒光強(qiáng)度和標(biāo)記物濃度的變化關(guān)系;其中,a是不同標(biāo)記物濃度(ng/ml)下,微球的熒光圖片,b是熒光強(qiáng)度與標(biāo)記物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

1.微流控芯片的制備

(1)利用cad軟件制作出所需要的掩膜,微柱的長(zhǎng)為130μm,寬為30μm,微柱之間最窄的間距為13μm,微柱陣列之間的距離為100μm,整個(gè)芯片大約有25個(gè)微柱陣列,每個(gè)陣列約有200個(gè)微柱,微柱的長(zhǎng)與主流動(dòng)方向垂直。

(2)將光刻膠旋涂在清洗后的硅片上,厚度為3μm,經(jīng)過(guò)曝光、顯影等一系列光刻工藝,將硅片上的光刻膠按照掩膜版的圖形進(jìn)行圖案化。以光刻后的光刻膠圖形為掩膜,對(duì)硅片進(jìn)行深反應(yīng)離子刻蝕,刻蝕深度為18μm。這一深度方便微球排布在一個(gè)平面上,有利于觀察時(shí)的聚焦??涛g完成后用等離子體干法去除殘膠。硅片模具制作完成。

(3)將制作好的硅片模具進(jìn)行硅烷化(熏氟硅烷,真空過(guò)夜)。以pdms預(yù)聚體:固化劑=10:1的比例配制pdms,攪拌均勻后抽真空直至氣泡消失。將pdms澆筑在硅烷化之后的硅片上,放置在熱板上95℃直至固化。

(4)將固化后的pdms剝離下來(lái),切割打孔,然后用等離子體將結(jié)構(gòu)化的pdms與載玻片鍵合起來(lái),至此微流控芯片制作完成。

2.聚苯乙烯微球的功能化修飾

(1)吸取10μl微球原液,重懸在90μlpbs(磷酸鹽)緩沖液中,吹打震蕩。然后以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘,吸去上清液,重復(fù)操作兩次,最后重懸在80μl的pbs中。

(2)利用pbs緩沖液配制10mg/ml的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)溶液,各吸取10μl加入到步驟(1)中的微球懸液中,室溫下震蕩孵育半小時(shí),孵育后重復(fù)步驟(1)中的離心操作,最后重懸在100μlpbs緩沖液中。

(3)將30μganti-cea捕獲抗體加入到步驟(2)中的微球懸液中,吹打震蕩,然后在37℃的條件下震蕩孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后,重復(fù)步驟(1)中的離心操作,最后重懸在100μlpbs緩沖液中。

(4)用10%的bsa(牛血清蛋白)溶液對(duì)修飾好的微球進(jìn)行封閉,然后放在4℃下備用。

3.基于微球檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的研究

(1)將功能化的微球、待檢測(cè)的標(biāo)記物、結(jié)合有檢測(cè)抗體的量子點(diǎn)和pbs緩沖液同時(shí)加入到離心管內(nèi),37℃搖晃孵育40分鐘。

(2)孵育結(jié)束后,直接進(jìn)樣,最后進(jìn)樣100μl0.05%的pbst緩沖液作為最后的清洗。

(3)進(jìn)樣完成后,在顯微鏡下觀察并拍照,然后用圖像分析軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

由圖2、圖3可知,微球能夠在微流控芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)有序排布,本實(shí)施例的微流控芯片的檢測(cè)下限達(dá)到了0.5ng/ml,而且擬合曲線與實(shí)際數(shù)據(jù)具有高相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.99。

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