本發(fā)明屬于中藥活性成分篩選及作用機(jī)制研究領(lǐng)域，特別涉及一種篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)細(xì)胞膜色譜(cellmembranechromatography，cmc)首先需要制備細(xì)胞膜，再采用硅膠吸附的方法制備固定相，通常將固定相濕法裝柱后以磷酸緩沖液為流動(dòng)相，分析比較中藥成分在色譜柱上的保留特性。細(xì)胞膜色譜力求盡量保持受體的“原位”性，模擬受體生存環(huán)境，使得藥物分子與受體的相互作用更接近真實(shí)狀態(tài)，研究細(xì)胞膜上的受體與配體的結(jié)合特性。細(xì)胞膜色譜同時(shí)也存在明顯的不足，例如細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)在細(xì)胞膜內(nèi)外都存在，有分類方法將受體種類分為離子通道型、g-蛋白偶聯(lián)型、酪氨酸激酶型以及細(xì)胞核內(nèi)受體等，實(shí)際上還有細(xì)胞漿、細(xì)胞器內(nèi)的各種酶等。細(xì)胞膜色譜研究中由于活細(xì)胞的破壞使得細(xì)胞內(nèi)受體不復(fù)存在，因而失去了驗(yàn)證作用于這部分靶點(diǎn)的效應(yīng)成分的機(jī)會(huì)。還有部分受體是由于另一些受體被激活后，通過活細(xì)胞的各種信號(hào)傳導(dǎo)通路而被激活，這部分受體由于偶聯(lián)作用需要活細(xì)胞的功能，其配體也不容易為細(xì)胞膜色譜所發(fā)現(xiàn)。此外該方法對(duì)流動(dòng)相緩沖溶液的組成、ph值、柱溫、柱壓、流速等要求苛刻，難以最大限度保持細(xì)胞受體活性。通過細(xì)胞膜固相色譜(cellmembraneimmobilizedchromatography，cmic)技術(shù)，將細(xì)胞與藥液孵育使藥液中活性成分與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，沖洗未吸附成分，再解離并檢測(cè)吸附成分。省去了將細(xì)胞固定在硅膠這一步，既節(jié)約經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，又有利于保持生物靶點(diǎn)的活性，是對(duì)cmc技術(shù)的一大創(chuàng)新和改進(jìn)。目前已有研究人員利用多種生物材料如原代巨噬細(xì)胞，脾細(xì)胞，肺組織細(xì)胞成功用于三七、脈絡(luò)寧等中藥活性成分的辨識(shí)，顯示出良好的應(yīng)用前景。

癢覺，尤其是慢性瘙癢的具體傳導(dǎo)分子機(jī)制目前還不完全明確，且經(jīng)常在多種疾病中作為并發(fā)癥出現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)特應(yīng)性皮炎患者每年的醫(yī)療花費(fèi)也已超過3億美元。但目前慢性瘙癢的治療不容樂觀，由于各種慢性瘙癢的病理機(jī)制不同，現(xiàn)在市場(chǎng)上并沒有可以有效治療各種慢性瘙癢疾病的特效藥或醫(yī)療措施。對(duì)于占比超過80％的慢性頑固性瘙癢，目前常見的止癢藥往往療效欠佳或有較嚴(yán)重副作用，例如臨床上治療瘙癢常用的抗過敏藥、抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致的精神萎靡、免疫紊亂等癥狀。因此闡明癢覺的產(chǎn)生與傳導(dǎo)機(jī)制、篩選有抗瘙癢活性的物質(zhì)對(duì)瘙癢的防治、抗瘙癢藥物的開發(fā)極其重要。

實(shí)驗(yàn)研究中可將癢覺分為組胺依賴型瘙癢(由致癢劑直接或者間接引起組胺釋放而引起的瘙癢)與組胺非依賴型瘙癢(由不會(huì)引起組胺釋放的致癢劑引起的瘙癢)，組胺依賴型瘙癢多為急性瘙癢例如蕁麻疹、過敏引起的風(fēng)團(tuán)濕疹等可以通過服用組胺拮抗劑治療；而組胺非依賴型瘙癢則多數(shù)為慢性頑固性的瘙癢，組胺拮抗劑通常療效欠佳，例如特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、銀屑病等瘙癢。由于目前對(duì)組胺非依賴型瘙癢并無有效的療法或藥物，因此對(duì)組胺非依賴型瘙癢的機(jī)制研究是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的研究課題，而對(duì)其藥物的開發(fā)也是目前皮膚病藥物研究的一大熱點(diǎn)。

由于瘙癢是一種復(fù)雜的神經(jīng)生理行為，因此抗瘙癢藥物多數(shù)都是直接運(yùn)用動(dòng)物行為學(xué)來篩選，耗費(fèi)大量時(shí)間與金錢，如何更為高效篩選抗瘙癢藥物成為目前亟待解決的問題。隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，對(duì)癢覺的研究逐漸深入，并發(fā)現(xiàn)了初級(jí)傳入神經(jīng)元上大量癢覺相關(guān)受體和免疫與癢覺的聯(lián)系。本發(fā)明以此為基礎(chǔ)用細(xì)胞篩選傳統(tǒng)抗瘙癢中藥苦參中的活性成分，并驗(yàn)證其活性成分的抗瘙癢效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法。

本發(fā)明的又一目的在于提供的所述細(xì)胞膜固相色譜法在中藥神經(jīng)活性成分篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明將生物學(xué)部分與化學(xué)部分分開進(jìn)行，有利于保持靶點(diǎn)的活性，能發(fā)揮特異性結(jié)合和色譜分析各自的長(zhǎng)處。本發(fā)明所建立的小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜固相色譜法與液相質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)于多組分、多靶點(diǎn)的中藥活性物質(zhì)的篩選有很高的適用性；并通過后續(xù)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證活性成分藥效。

本發(fā)明采用小鼠的背根神經(jīng)節(jié)(drg)細(xì)胞建立固相色譜法模型，對(duì)傳統(tǒng)抗瘙癢中藥苦參的水提部位進(jìn)行活性成分篩選及成分鑒定，通過對(duì)篩選出神經(jīng)活性的成分進(jìn)行藥理學(xué)驗(yàn)證，確定了該方法的可行性，可用于其他抗瘙癢藥物的活性成分篩選。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法，通過小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜固相化篩選中藥提取液中的中藥神經(jīng)活性成分。

所述的篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法，包括如下步驟：

(1)通過高效液相色譜(hplc)聯(lián)用質(zhì)譜建立待篩選中藥提取液指紋圖譜；

(2)分離與培養(yǎng)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；

(3)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜固相化篩選中藥提取液中的效應(yīng)成分；

(4)洗脫未結(jié)合成分，棄去洗脫液；

(5)解離得到活性成分解離液；

(6)將步驟(5)得到的活性成分解離液進(jìn)行hplc分析，通過比較活性成分解離液和步驟(1)得到的中藥提取液指紋圖譜中各吸收峰，確定與小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異結(jié)合成分的特征峰，得到活性成分的特征峰，從而篩選得到中藥神經(jīng)活性成分。

所述的中藥優(yōu)選為止癢中藥和/或鎮(zhèn)痛中藥；進(jìn)一步優(yōu)選為苦參。

所述的中藥神經(jīng)活性成分優(yōu)選為抗頑固性瘙癢活性成分。

所述的篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法，包括如下步驟：

(1)通過高效液相色譜(hplc)聯(lián)用質(zhì)譜建立待篩選中藥苦參甲醇提取液指紋圖譜；

(2)分離與培養(yǎng)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；

(3)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜固相化篩選苦參水提取液中的效應(yīng)成分；

(4)洗脫未結(jié)合成分，棄去洗脫液；

(5)解離得到活性成分解離液；

(6)將步驟(5)得到的活性成分解離液進(jìn)行hplc分析，通過比較活性成分解離液和步驟(1)得到的苦參甲醇提取液指紋圖譜中各吸收峰，確定與小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異結(jié)合成分的特征峰，得到活性成分的特征峰，從而篩選得到中藥神經(jīng)活性成分。

步驟(6)中所述的與小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異結(jié)合成分的特征峰為1號(hào)峰、7號(hào)峰、8號(hào)峰、17號(hào)峰、19號(hào)峰五個(gè)特征峰，所述五個(gè)特征峰是與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜靶點(diǎn)結(jié)合的效應(yīng)成分群。

確定待篩選中藥指紋圖譜中各特征峰物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述1號(hào)峰物質(zhì)為毛蕊異黃酮(calycosin)、7號(hào)峰為氧化苦參堿(oxymatrine)、8號(hào)峰為氧化槐果堿(oxysophocarpine)、17號(hào)峰為高麗槐素(maackiain)、19號(hào)峰為槐果堿(sophocarpine)。

所述的中藥神經(jīng)活性成分優(yōu)選為抗頑固性瘙癢藥物活性成分；進(jìn)一步優(yōu)選為毛蕊異黃酮(calycosin)、氧化苦參堿(oxymatrine)、氧化槐果堿(oxysophocarpine)、高麗槐素(maackiain)、槐果堿(sophocarpine)。

步驟(1)所述的通過高效液相色譜(hplc)聯(lián)用質(zhì)譜建立待篩選中藥苦參甲醇提取液指紋圖譜的具體步驟包括：將苦參藥材粉碎，過篩，將苦參粉末加入甲醇室溫浸泡，離心取上清過0.22μm微孔濾膜，制得苦參甲醇提取液；通過液質(zhì)聯(lián)用確定苦參甲醇提取液中指紋峰與進(jìn)行峰的指認(rèn)。

所述的浸泡的時(shí)間優(yōu)選為8～16小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為12h。

所述的苦參甲醇提取液的濃度優(yōu)選為2～10g/l，進(jìn)一步優(yōu)選為5g/l。

步驟(2)所述的分離小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的具體步驟包括：取孕齡15～16d母鼠，從頸部至尾部采集所有背根神經(jīng)節(jié)，將其置于含有0.1％bsa的無鈣pbs(4℃)中，之后放入含有0.05％胰蛋白酶溶液內(nèi)；37℃消化30min，0.2％大豆胰蛋白酶抑制劑加0.02％dna酶終止消化；用吸槍頭輕輕吹打細(xì)胞直至組織完全變成單細(xì)胞懸液。

步驟(2)中所述的培養(yǎng)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選為：90％hyclonedmem高糖培養(yǎng)基、10％gibco胎牛血清及1％～1.5％cellbio雙抗。

步驟(2)中所述的培養(yǎng)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為：培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。

步驟(2)所述的小鼠優(yōu)選為c57bl/6小鼠。

步驟(3)所述的小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜固相化篩選苦參水提取液中的效應(yīng)成分的具體步驟包括：棄去培養(yǎng)基，加入苦參水提取液，37℃孵育，使苦參水提取液中活性成分充分與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜受體結(jié)合。

所述的苦參水提取液與小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的配比優(yōu)選為：苦參水提取液濃度(g/l)：小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)(萬個(gè))＝1∶0.05～0.25。

所述的孵育的時(shí)間優(yōu)選為40min～90min。

步驟(4)所述的洗脫未結(jié)合成分的具體步驟包括：用pbs沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿至少5次；沖洗的次數(shù)優(yōu)選為5次。根據(jù)清洗液中所含成分，確定清洗5次可以將未吸附成分全部洗脫，排除非特異性成分的干擾。

所述的pbs優(yōu)選為ph值為7.2的pbs，所述的沖洗的pbs用量?jī)?yōu)選為1ml/次。

步驟(5)中所述的解離的具體步驟包括：向步驟(4)中得到的經(jīng)洗脫后的小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中加入甲醇，37℃孵育，得到活性成分解離液。

所述的孵育的時(shí)間優(yōu)選為30min～60min；進(jìn)一步優(yōu)選為30min。

所述的甲醇的加入量?jī)?yōu)選為1～5ml；進(jìn)一步優(yōu)選為2ml。

所述步驟(1)與步驟(6)中的hplc的分析條件優(yōu)選為：有機(jī)相為乙腈；水相為0.1％氨水；梯度洗脫0～30min(有機(jī)相：10～46％)，30～40(有機(jī)相：46～90％)，40～41min(有機(jī)相：90～10％)，40～50min(有機(jī)相：10％)(以上均為體積百分比)；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：25～35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：1ml/min。

所述的柱溫優(yōu)選為30℃。

所述的hplc所用的色譜柱優(yōu)選為可耐堿性條件的色譜柱，進(jìn)一步優(yōu)選為可耐堿性條件的反相色譜柱；更優(yōu)選為可耐堿性條件的c18色譜柱；最優(yōu)選為cnwathenac18-wp液相色譜柱。

所述步驟(1)與步驟(6)中的質(zhì)譜的分析條件優(yōu)選為：采用esi源，對(duì)藥材進(jìn)行正離子模式與負(fù)離子模式的測(cè)定，霧化壓力30psi，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣體流速11l/min，干燥溫度325℃，碎片電壓175v，質(zhì)量掃描范圍100～1000。

由所述的篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法得到的中藥神經(jīng)活性成分。

所述的中藥神經(jīng)活性成分優(yōu)選為抗頑固性瘙癢藥物活性成分；進(jìn)一步優(yōu)選為毛蕊異黃酮(calycosin)、氧化苦參堿(oxymatrine)、氧化槐果堿(oxysophocarpine)、高麗槐素(maackiain)、槐果堿(sophocarpine)。

所述篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法在中藥神經(jīng)活性成分篩選中的應(yīng)用。

所述的中藥神經(jīng)活性成分優(yōu)選為抗頑固性瘙癢藥物活性成分。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明建立的小鼠drg細(xì)胞膜固相色譜法，具有細(xì)胞膜固相色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，解決了傳統(tǒng)細(xì)胞膜色譜技術(shù)中存在的“非特異性結(jié)合”和“細(xì)胞膜固定處的生物活性狀態(tài)和色譜分析系統(tǒng)無法共存于同一體系內(nèi)”等問題，而且采用小鼠drg細(xì)胞進(jìn)行篩選，可以對(duì)有潛在神經(jīng)活性的物質(zhì)進(jìn)行初步篩選，是外周鎮(zhèn)痛藥止癢藥篩選的一個(gè)突破口，具有良好的運(yùn)用前景。

(2)從苦參提取液中篩選出的效應(yīng)物質(zhì)氧化苦參堿，有報(bào)道氧化苦參堿能通過抗炎作用有效緩解免疫紊亂引起的瘙癢，同時(shí)還有一定的鎮(zhèn)痛與鎮(zhèn)靜作用，提示氧化苦參堿有望開發(fā)為新的抗頑固性瘙癢藥物。

(3)通過本發(fā)明模型從苦參提取物篩選出的效應(yīng)物質(zhì)——氧化苦參堿對(duì)氯喹(cq)與sligrl誘導(dǎo)的瘙癢模型小鼠有顯著的止癢療效，提示氧化苦參堿有顯著的抗組胺非依賴型瘙癢的療效。

(4)本發(fā)明建立的細(xì)胞膜固相色譜不僅具有細(xì)胞膜固相色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，如直接取用生物靶點(diǎn)富集的細(xì)胞膜蛋白選擇性地結(jié)合(固相化)中藥提取液中的活性成分，通過洗脫非特異性結(jié)合成分后，再行分離鑒定效應(yīng)物質(zhì)，將生物學(xué)部分與化學(xué)分析部分分開進(jìn)行，能發(fā)揮特異性結(jié)合和色譜分析的各自長(zhǎng)處，且省去了分子生物色譜中載體與受體、通道和酶等蛋白質(zhì)連接的過程，節(jié)約經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，應(yīng)用drg細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜固相色譜是篩選中藥中神經(jīng)活性物質(zhì)的新方法。

(5)本發(fā)明應(yīng)用癢覺通路上重要的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作為篩選的固定相“垂釣”出待篩選混合物中的神經(jīng)活性成分。該技術(shù)擁有廣泛的應(yīng)用前景，例如可以用于篩選止癢中藥的神經(jīng)活性成分(潛在的抗瘙癢成分)或者篩選鎮(zhèn)痛中藥的神經(jīng)活性成分(潛在的止痛成分)等。

附圖說明

圖1是苦參甲醇提取液與苦參水提液的成分hplc對(duì)比圖。

圖2是苦參指紋圖譜，其中，(a)為標(biāo)準(zhǔn)品hplc圖譜；(b)為苦參甲醇提取液hplc圖；(c)苦參甲醇提取液正離子模式esi質(zhì)譜圖；(d)為苦參甲醇提取液負(fù)離子模式esi質(zhì)譜圖。

圖3是苦參甲醇提取液、活性成分解離液、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、清洗液和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)解離液的hplc對(duì)比圖譜。

圖4是氧化苦參堿對(duì)不同瘙癢模型小鼠的瘙癢行為的影響結(jié)果分析圖；其中，(a)為氯喹(cq)瘙癢模型；(b)為sligrl瘙癢模型；(c)為組胺(his)瘙癢模型，與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較，^*p＜0.05，^**p＜0.01；(n＝12或14)。

圖5是氧化苦參堿對(duì)氯喹(cq)誘導(dǎo)瘙癢模型小鼠三叉神經(jīng)節(jié)的癢覺相關(guān)受體的調(diào)節(jié)作用結(jié)果分析圖，其中(a)為mrgpra3；(b)為trpv1；(c)為trpa1；與cq組比較：^*p＜0.05，^**p＜0.01；(n＝5或7)。

圖6是氧化苦參堿對(duì)sligrl誘導(dǎo)瘙癢模型小鼠三叉神經(jīng)節(jié)的癢覺相關(guān)受體的調(diào)節(jié)作用結(jié)果分析圖，其中(a)組受體為mrgprc11；(b)組受體為trpv1；(c)組受體為trpa1；與sligrl組比較：^*p＜0.05，^**p＜0.01.(n＝5或7)。

圖7是氧化苦參堿對(duì)組胺(his)誘導(dǎo)瘙癢模型小鼠三叉神經(jīng)節(jié)的癢覺相關(guān)受體的調(diào)節(jié)作用結(jié)果分析圖，其中(a)為h1r；(b)為trpv1；(c)為trpa1；與his組比較：^*p＜0.05，^**p＜0.01；(n＝5或7)。

圖8是氧化苦參堿對(duì)過敏性接觸性皮炎瘙癢模型小鼠的瘙癢行為的影響結(jié)果分析圖；其中與model組相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；(n＝12)。

圖9是氧化苦參堿對(duì)過敏性接觸性皮炎瘙癢模型小鼠激發(fā)部位皮膚的he染色切片顯微鏡照片圖(200倍)；其中(a)為對(duì)照組，(b)為模型組，(c)為dem組，(d)為omt80mg/kg組，(e)為omt40mg/kg組，(f)為omt20mg/kg組。

圖10是氧化苦參堿對(duì)過敏性接觸性皮炎瘙癢模型小鼠激發(fā)部位皮膚炎癥因子的調(diào)節(jié)作用結(jié)果分析圖；其中(a)為il-1β，(b)為tnf-α，與model組比較，^*p＜0.05，^**p＜0.01；(n＝3)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法模型的建立方法

苦參(radixsophoraeflavescentis)采購(gòu)于渭南華宇藥業(yè)有限公司，lot：150602，產(chǎn)地湖南)

1.苦參指紋圖譜建立

樣品準(zhǔn)備：將苦參藥材粉碎，過40目篩，取0.01g苦參粉末加入2.0ml甲醇室溫浸泡12h，之后離心取上清并過0.22μm微孔濾膜得5g/l苦參甲醇提取液。

標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：分別精密稱取氧化槐果堿(oxysophocarpine)、氧化苦參堿(oxymatrine)、苦參堿(matrine)、槐果堿(sophocarpine)、n-甲基野靛葉堿(n-methylcytisine)0.3mg加1ml純水溶解得0.3mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品，混標(biāo)為5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品取等量混合，所有標(biāo)準(zhǔn)品上樣前過0.22μl微孔濾膜。

液相色譜條件：進(jìn)樣量：20μl；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：1ml/min；水相：0.1％氨水；有機(jī)相：乙腈；梯度洗脫：0～30min(有機(jī)相：10～46％)，30～40(有機(jī)相：46～90％)，40～41min(有機(jī)相：90～10％)，40～50min(有機(jī)相：10％)。

液質(zhì)聯(lián)用儀：agilent1260液相色譜-g6200系列飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱：cnwathenac18-wp液相色譜柱，4.6×250mm，5μm。

質(zhì)譜條件：采用esi源，對(duì)藥材進(jìn)行正離子模式與負(fù)離子模式的測(cè)定，霧化壓力30psi，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣體流速11.0l/min，干燥溫度325℃，碎片電壓175v，質(zhì)量掃描范圍100～1000。

苦參指紋圖譜如圖2所示，其中，(a)為標(biāo)準(zhǔn)品hplc圖譜；(b)為苦參甲醇提取液hplc圖；(c)苦參甲醇提取液正離子模式esi質(zhì)譜圖；(d)為苦參甲醇提取液負(fù)離子模式esi質(zhì)譜圖。

2.小鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，drg)細(xì)胞的培養(yǎng)

小鼠背根神經(jīng)節(jié)分離與培養(yǎng)：取孕齡15～16d的c57bl/6母鼠，乙醚麻醉，剖腹取出子宮，用眼科鑷子小心剝離出胚胎。斷頭處死后剪開背部皮膚并分離脊髓。沿脊髓兩側(cè)，從頸部至尾部采集所有背根神經(jīng)節(jié)，將其置于含有0.1％(w/w)bsa的無鈣pbs(4℃)內(nèi)沖洗1min。之后將背根神經(jīng)節(jié)放入含有0.05％(w/w)胰蛋白酶溶液內(nèi)，37℃水浴搖動(dòng)消化30min，加入0.2％(w/w)大豆胰蛋白酶抑制劑(sigma公司，lot：t9003)和0.02％(w/w)dna酶(sigma，lot：d5025)終止消化。用1ml吸槍頭輕輕吹打細(xì)胞直至組織完全變成單細(xì)胞懸液。

背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基為90％hyclonedmem高糖培養(yǎng)基、10％gibco胎牛血清及1％～1.5％(w/w)cellbio雙抗；培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。

3.小鼠drg細(xì)胞膜固相色譜實(shí)驗(yàn)

(1)苦參水提取液的制備：將苦參藥材粉碎，過40目篩，取20g粉末加入至1l純凈水中，室溫浸泡12h，之后離心取上清并過0.22μm微孔濾膜得20g/l苦參水提取液。經(jīng)過hplc色譜分析，苦參甲醇提取液與苦參水提液的成分對(duì)比圖如圖1所示，其中苦參甲醇提取液有更多的峰，并包含了所有苦參水提液的成分，因此確定指紋圖譜時(shí)用醇提液確定成分，而細(xì)胞膜固相色譜實(shí)驗(yàn)時(shí)為了保持細(xì)胞活性則用苦參水提液孵育。

(2)小鼠drg細(xì)胞膜固相色譜篩選中藥苦參水提取液中的親和吸附成分：待細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)皿(約1×10⁶～10×10⁶個(gè)細(xì)胞)后棄去培養(yǎng)基，取2ml20g/l苦參水提取液加入到所述的細(xì)胞培養(yǎng)皿并于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，使苦參水提取液中活性成分充分與drg細(xì)胞膜受體結(jié)合。

(3)非結(jié)合成分的洗脫：棄去苦參水提取液，并用ph值為7.2的pbs沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿5次，每次1ml，棄去前4次的洗脫液，收集第5次的洗脫液備用。

(4)小鼠drg細(xì)胞膜固相色譜中苦參水提取液的活性成分的解離：向步驟(2)洗脫了未結(jié)合成分后的drg細(xì)胞加入2ml甲醇，并在37℃培養(yǎng)箱孵育30min，得到活性成分解離液。

(5)活性成分解離液的hplc色譜分析：將活性成分解離液在室溫下?lián)]干至500μl，hplc分析，通過比較活性成分解離液、步驟(3)中的第5次的洗脫液和步驟1得到的苦參甲醇提取液指紋圖譜中各吸收峰，確定與drg細(xì)胞有吸附作用的特征峰，得到活性成分的特征峰。

4.空白對(duì)照試驗(yàn)

取2ml純凈水加入drg細(xì)胞培養(yǎng)皿并于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，其余步驟與“3.小鼠drg細(xì)胞膜固相色譜實(shí)驗(yàn)”相同，作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如圖2所示，由圖2(b)可知，苦參的苦參甲醇提取液得到21個(gè)峰，經(jīng)過質(zhì)譜指認(rèn)了21個(gè)成分(見表1)，所有化合物均在苦參的成分分析中有報(bào)道。為驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，取苦參中較常見的5種生物堿：氧化槐果堿(8號(hào)峰)、氧化苦參堿(7號(hào)峰)、苦參堿(18號(hào)峰)、槐果堿(19號(hào)峰)、n-甲基野靛葉堿(12號(hào)峰)為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(見圖2(a))，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均與質(zhì)譜的鑒定結(jié)果相符，說明質(zhì)譜鑒定結(jié)果可信準(zhǔn)確。

如圖3所示，清洗液圖譜(washingeluate)中并無出峰，說明經(jīng)過5次的pbs沖洗，非吸附成分已經(jīng)被完全清洗干凈。而對(duì)比苦參甲醇提取液與活性成分解離液可以確定5個(gè)特異結(jié)合的特征峰，分別為：1號(hào)峰毛蕊異黃酮(calycosin)、7號(hào)峰氧化苦參堿(oxymatrine)、8號(hào)峰氧化槐果堿(oxysophocarpine)、17號(hào)峰高麗槐素(maackiain)、19號(hào)峰槐果堿(sophocarpine)，所述5個(gè)特征峰是與小鼠drg細(xì)胞膜靶點(diǎn)結(jié)合的效應(yīng)成分群。而空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的解離液(dissociativeeluate(blankcontrol))圖譜中并無出峰，排除了細(xì)胞的內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，進(jìn)一步說明了活性成分解離液中的物質(zhì)確實(shí)是藥材中與drg細(xì)胞膜有親和吸附作用的潛在神經(jīng)活性成分。

效應(yīng)物質(zhì)群的藥理活性研究：根據(jù)相關(guān)研究指出氧化苦參堿和氧化槐果堿、槐果堿均有顯著的抗炎、抗心律失常、鎮(zhèn)靜等作用，這與本發(fā)明得出的結(jié)論相符。

表1苦參甲醇提取液成分鑒定

實(shí)施例2氧化苦參堿對(duì)不同瘙癢模型小鼠的抗瘙癢作用實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例對(duì)氧化苦參堿(oxymatrine，下文簡(jiǎn)稱omt)對(duì)h1r激動(dòng)劑組胺(histamine，下文簡(jiǎn)稱his)、mrgpra3的激動(dòng)劑氯喹(chloroquine，下文簡(jiǎn)稱gq)和mrgprc11激動(dòng)劑sligrl引起的瘙癢模型小鼠的抗瘙癢作用進(jìn)行了考察。

96只spf雄性c57bl/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、cq組、cq+omt組、sligrl組、sligrl+omt組、his組，his+omt組。對(duì)照組12只，其他每組14只。cq、sligrl、his、omt均溶于生理鹽水中分別配制成100mg/ml、2.5mg/ml、200mg/ml與8mg/ml備用。

第1到6天，cq+omt組、sligrl+omt組，his+omt組小鼠每天腹腔注射給予100mg/kg的omt，對(duì)照組、cq組、sligrl組、his組則腹腔注射給予等量生理鹽水，同時(shí)每天進(jìn)行2h的小鼠適應(yīng)性訓(xùn)練(將小鼠每天固定時(shí)間放置于行為學(xué)盒子里面2小時(shí)，使小鼠適應(yīng)錄像條件)。在實(shí)驗(yàn)第5日對(duì)所有小鼠右臉頰剃毛。第6日在最后一次給藥半小時(shí)后，在cq、cq+omt組的右邊臉頰皮內(nèi)注射20μlcq(100mg/ml)復(fù)制cq瘙癢模型，sligrl組與sligrl+omt組皮內(nèi)注射20μlsligrl(2.5mg/ml)復(fù)制sligrl瘙癢模型，his組與his+omt組皮內(nèi)注射20μlhis(200mg/ml)復(fù)制his瘙癢模型，對(duì)照組則在右臉頰注射20μl生理鹽水。將小鼠放入行為學(xué)記錄盒中，錄像機(jī)記錄小鼠2小時(shí)自發(fā)行為。

由于小鼠抓撓動(dòng)作都非常迅速，另外為了排除其他動(dòng)作的干擾，因此我們將錄像視頻通過藍(lán)光影碟機(jī)連接高清電視進(jìn)行反復(fù)慢速播放，由不清楚實(shí)驗(yàn)分組和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡娜藛T對(duì)數(shù)據(jù)盲法分析。對(duì)于搔抓行為，小鼠一般利用后肢對(duì)面頰進(jìn)行搔抓，通常從抬起后肢到后肢放回地面或嘴中記作一次搔抓行為發(fā)作。一次搔抓行為可能包括一次或多次后肢反復(fù)搔抓面頰的動(dòng)作，所以有時(shí)一次搔抓行為可能持續(xù)數(shù)秒。小鼠搔抓面頰后，后爪一般會(huì)殘留少量的皮膚或毛發(fā)碎屑，因此小鼠經(jīng)常會(huì)在搔抓結(jié)束后，將后爪放入嘴中進(jìn)行清理。通過對(duì)每分鐘內(nèi)小鼠搔抓臉頰的次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后計(jì)算出整個(gè)觀察時(shí)間內(nèi)小鼠總的搔抓行為次數(shù)。

結(jié)果如圖4所示，omt可顯著降低由cq與sligrl引起小鼠抓撓行為(^*p＜0.05或^**p＜0.01)但對(duì)于組胺(his)則效果不明顯，說明omt能特異性地效拮抗組胺非依賴型瘙癢。

實(shí)施例3氧化苦參堿對(duì)cq和sligrl引起的瘙癢模型小鼠的三叉神經(jīng)節(jié)trpa1調(diào)節(jié)作用

1小鼠自發(fā)行為記錄結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，分離右側(cè)臉頰的三叉神經(jīng)節(jié)。液氮研碎，加入1mltrizolreagent，得到勻漿液。

2.靜置10min后，6000rpm，4℃離心，10min，沉淀未裂解的組織。

3.取上清，按照氯仿：勻漿液的體積比為1∶5加入氯仿，劇烈搖動(dòng)15s；12000rpm，4℃離心，20min。

4.吸取上清液，加入與上清液等體積的異丙醇，顛倒搖勻后，于-20℃，沉淀過夜。

5.12000rpm，4℃離心，10min，在管底可見微量白色的rna沉淀，將異丙醇倒盡、吸干。

6.加入與步驟4異丙醇等體積的75％的乙醇，用手指輕彈，使rna沉淀浮起、碎散10min，12000rpm，4℃離心。

7.用移液槍吸干上清，開口揮去乙醇，待白色物呈無色凝膠狀后，用15μlte緩沖液溶解，采用微量紫外分光光度法測(cè)定rna濃度與純度，根據(jù)rna樣品在波長(zhǎng)260nm和280nm的紫外吸收值的比值(od260/od280)判斷rna樣品的純度，比值在1.8～2.0視為rna純度優(yōu)良。得到三叉神經(jīng)節(jié)總rna，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8.取步驟7抽提得到的總rna為模板，按以下體系以takara公司primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser試劑盒(貨號(hào)rr047a)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體積為20μl，全程冰上低溫操作。

(1)去除基因組dna反應(yīng)

表2去除基因組dna反應(yīng)體系

加樣完成后室溫靜置20min。

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

表3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

37℃15min，85℃5sec，hold4℃；得到的cdna于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

9.熒光實(shí)時(shí)定量pcr

取步驟8抽提得到的cdna為模板，以takara公司rr820q試劑盒按以下體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，總體積為15μl，全程冰上低溫操作，引物序列見表5。

表4實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

step1：95℃30秒

step2：pcr反應(yīng)

goto：39(40cycles)

95℃5秒

60℃60秒

step3：meltcurve

表5.熒光定量pcr引物序列

10.定量分析

分別擴(kuò)增同一樣本的目的基因和內(nèi)參，利用2^-δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。即用同組中每個(gè)樣本目的基因的ct值減內(nèi)參基因的ct值得δct，再用處理組的δct減去對(duì)照組的δct得δδct，代入公式2^-δδct計(jì)算即得到處理組相對(duì)于對(duì)照組的基因相對(duì)表達(dá)量，再對(duì)每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

分別考察cq組與omt+cq組小鼠三叉神經(jīng)節(jié)的mrgpra3、trpa1、trpv1的基因表達(dá)量；sligrl模型組與omt+sligrl組的mrgprc11、trpa1、trpv1的基因表達(dá)量；his組與omt+his組的h1r、trpa1、trpv1的基因表達(dá)量；對(duì)照組的mrgpra3、mrgprc11、h1r、trpa1、trpv1的基因表達(dá)量。

結(jié)果如圖5、6、7所示，omt對(duì)于癢覺的上游通道h1r(組胺受所激活的癢覺受體)、mrgpra3(氯喹激活的癢覺受體)、mrgprc11(sligrl所激活的癢覺受體)均無顯著調(diào)節(jié)作用，而對(duì)于下游的離子通道trpv1(組胺依賴型瘙癢的下游離子通道)也沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。但對(duì)于trpa1這個(gè)組胺非依賴型瘙癢的重要的下游鈣離子通道，omt有顯著的下調(diào)作用，因此說明omt可以通過調(diào)節(jié)離子通道來抑制組胺非依賴型瘙癢。

實(shí)施例4氧化苦參堿對(duì)過敏性接觸性皮炎模型小鼠的抗瘙癢作用實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例用方形酸二丁酯(sadbe)致敏與激發(fā)復(fù)制過敏性接觸性皮炎(allergiccontactdermatitis，以下簡(jiǎn)稱acd)的頑固性瘙癢小鼠模型，通過與實(shí)施實(shí)例2相同的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證omt對(duì)過敏性接觸性皮炎模型小鼠的抗頑固性瘙癢作用。

96只雄性c57bl/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、地塞米松(dem)0.08mg/kg陽性組、模型組、氧化苦參堿(omt)80mg/kg劑量組、omt40mg/kg劑量組、omt20mg/kg劑量組(n＝12)。

實(shí)驗(yàn)第0天，小鼠用1％的戊巴比妥鈉進(jìn)行短暫麻醉后，用電推剪將小鼠腹部(面積約2×2cm)的毛發(fā)刮去。實(shí)驗(yàn)第1～3天，連續(xù)3天在對(duì)照組小鼠腹部刮毛部位均勻涂以25μl丙酮溶液，其余組別涂以25μl1％(v/v)的sadbe丙酮溶液。實(shí)驗(yàn)第4～7天將小鼠放到特制的用于觀察行為學(xué)的鼠盒中進(jìn)行習(xí)慣性訓(xùn)練，每天1次，每次兩小時(shí)。于實(shí)驗(yàn)第7天，將小鼠用質(zhì)量百分比為1％的戊巴比妥鈉進(jìn)行短暫麻醉，并將小鼠右側(cè)臉頰(面積約1×1cm)的毛發(fā)刮去。實(shí)驗(yàn)第8～9天，在對(duì)照組小鼠右側(cè)臉頰刮毛部位均勻涂以25μl丙酮溶液，其余組別則涂以25μl1％的sadbe丙酮溶液。實(shí)驗(yàn)第10天，將omt或地塞米松溶于生理鹽水，3個(gè)omt劑量組小鼠腹腔注射相對(duì)應(yīng)劑量的omt，地塞米松組則注射0.08mg/kg地塞米松，模型組與對(duì)照組注射等體積生理鹽水。小鼠在給藥0.5小時(shí)適應(yīng)環(huán)境后開始錄像。錄像時(shí)間為1.5小時(shí)。錄像條件與瘙癢行為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)施實(shí)例2相同。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組(control)相比，模型組(model)在行為學(xué)錄像的1.5小時(shí)內(nèi)，搔抓面頰次數(shù)呈現(xiàn)出顯著性增加(p＜0.01)；地塞米松(dem)0.08mg/kg陽性組及omt80mg/kg、omt40mg/kg、omt20mg/kg劑量組較模型組相比，搔抓面頰次數(shù)呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)(p＜0.01)。由此可見，omt對(duì)于acd有顯著的抗瘙癢作用。

實(shí)施例5氧化苦參堿對(duì)過敏性接觸性皮炎模型小鼠的抗炎藥效考察

在實(shí)施例4小鼠行為學(xué)錄像結(jié)束24h后，小鼠安樂死后，在小鼠右側(cè)臉頰激發(fā)處皮膚的下部用小剪刀開一個(gè)小口，分離面頰皮膚后，使用眼科剪剪下皮膚(面積約1×1cm)。放于生理鹽水中洗凈，用濾紙吸干后，放于4％的甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，于皮膚中部沿水平方向連續(xù)切取數(shù)張5μm厚的切片，作he染色，在顯微鏡下(200倍)觀察皮膚病理結(jié)構(gòu)并拍照。其余激發(fā)部位皮膚則按照實(shí)施實(shí)例3中操作提取總rna。并用takara公司rr047a逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與rr820q熒光定量pcr試劑盒測(cè)定激發(fā)皮膚中常見炎癥因子il-1β、tnf-α的基因表達(dá)量。逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量pcr反應(yīng)如下，定量分析與統(tǒng)計(jì)方法同實(shí)施例3。

1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取上述抽提的總rna為模板，按以下體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體積為20μl，全程冰上低溫操作。得到的cdna置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(1)去除基因組dna反應(yīng)

表6除去基因組dna反應(yīng)體系

加樣完成后室溫靜置20min。

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

表7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

37℃15min，85℃5sec，hold4℃。

2.實(shí)時(shí)熒光定量pcr

取步驟1抽提得到的cdna為模板，按以下體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，總體積為25μl，全程冰上低溫操作。引物序列見下表。

表8.熒光定量pcr引物.

表9.熒光定量pcr反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

step1：95℃30秒

step2：pcr反應(yīng)

goto：39(40cycles)

95℃5秒

55℃30秒

72℃60秒

step3：meltcurve

he染色結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組相比，模型組的皮膚表皮重度角化過度(由于嚴(yán)重的搔抓或暴力性搔抓皮膚導(dǎo)致角質(zhì)層已基本破壞)，出現(xiàn)苔蘚樣浸潤(rùn)，表皮與真皮的界限不清，大量淋巴細(xì)胞在真皮上部與表面平行呈帶狀浸潤(rùn)；與模型組相比，地塞米松(dem)0.08mg/kg陽性組，氧化苦參堿(omt)80mg/kg、氧化苦參堿40mg/kg、氧化苦參堿20mg/kg劑量組的情況均有所改善。表皮各層厚度減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有所下降。由此可見，氧化苦參堿具有改善sadbe引起的acd頑固性瘙癢小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及損傷情況的作用。

omt對(duì)炎癥因子il-1β、tnf-α的基因表達(dá)量的影響結(jié)果如圖10所示，與對(duì)照組(control)相比，模型組(model)小鼠面頰激發(fā)處皮膚的tnf-α與il-1β的mrna表達(dá)水平均顯著上升(p＜0.01)；而氧化苦參堿80mg/kg、氧化苦參堿40mg/kg、氧化苦參堿20mg/kg劑量組的表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著性下降趨勢(shì)(p＜0.01orp＜0.05)。而地塞米松組則只有il-1β的表達(dá)水平與模型組相比有顯著降低。以上結(jié)果說明，氧化苦參堿可以通過下調(diào)acd模型小鼠炎性因子il-1β與tnf-α達(dá)到抗炎作用。

本發(fā)明的實(shí)施例2～5采用了小鼠的不同瘙癢模型對(duì)苦參提取液細(xì)胞膜固相色譜篩選得到的特異結(jié)合的成分氧化苦參堿進(jìn)行藥效學(xué)測(cè)定活性驗(yàn)證，氧化苦參堿有望開發(fā)為新一代抗頑固性瘙癢藥物。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>暨南大學(xué)

<120>一種篩選中藥神經(jīng)活性成分的細(xì)胞膜固相色譜法及其應(yīng)用

<130>1

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>mrgpra3上游引物

<400>1

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<212>dna

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<220>

<223>mrgpra3下游引物

<400>2

ggaagccaaggagccagaac20

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<212>dna

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agcatccacaaccccagaag20

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<212>dna

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<223>mrgprc11下游引物

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tggagtgcagttgggatgac20

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<223>h1r下游引物

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<223>trpa1上游引物

<400>9

aatctctgtcctctgcatcacg22

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<211>21

<212>dna

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acaatgcagtggggtatttcc21

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gapdh上游引物

<400>11

catccatgacaactttggca20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gapdh下游引物

<400>12

cctgcttcaccaccttcttg20

<210>13

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>il-1β上游引物

<400>13

ccttgtgcaagtgtctgaagcagc24

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>il-1β下游引物

<400>14

gccacagcttctccacagcca21

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tnf-α上游引物

<400>15

tctactgaacttcggggtgatcg23

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tnf-α下游引物

<400>16

acgtgggctacaggcttgtca21

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gapdh上游引物（實(shí)施例5）

<400>17

ttcagtgatgtggacttggac21

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gapdh下游引物（實(shí)施例5）

<400>18

ctgagagggaaatcgtgcgt20