本發(fā)明涉及一種用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒。
背景技術：
目前，麻風病是由麻風桿菌引起的慢性傳染性疾病。麻風桿菌主要侵犯皮膚和神經，造成肢體的畸殘，不僅導致患者的勞動力喪失，而且引起社會對患者的恐懼和歧視，造成患者個人、家庭等社會問題。20世紀80年代，世界衛(wèi)生組織(who)推薦聯合化療(mdt)的方案，隨著該方案的全球范圍內推廣應用，大多數國家和地區(qū)的麻風病發(fā)病率明顯降低，我國亦然。氨苯砜(4，4’-diamonodiphenylsulfone，dds)是mdt方案中必需的藥物。然而氨苯砜可導致部分患者罹患嚴重的藥物過敏---氨苯砜超敏綜合征，該綜合征在臨床上常表現為：發(fā)熱、淋巴結腫大、剝脫性皮炎、溶血和肝炎等，嚴重可導致患者死亡。我們研究顯示：我國麻風患者中氨苯砜綜合征的發(fā)病率約為2％，而死亡率可高達12.5％，該病已成為導致我國麻風病患者死亡的最主要的原因之一。另外，dds在其他皮膚病的治療中也有較好的療效，如皰疹樣天皰瘡、類天皰瘡、聚合性痤瘡等；但同樣因其具有可引起患者罹患氨苯砜超敏綜合征的風險，而致其在臨床應用上受阻。
鑒于上述原因，迫切需要用于檢測氨苯砜超敏綜合征的臨床早期診斷試劑盒。
技術實現要素：
本發(fā)明要解決的技術問題是提供三種用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒。
對于第一種用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒，本發(fā)明采用的技術方案是，包括氨苯砜。
作為優(yōu)選，氨苯砜的濃度為20～40ug/ml。
對于第二種用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒，本發(fā)明采用的技術方案是，由以下所列組分組成：
氨苯砜(20-40ug/ml)、anti-humanifn-r、elispot板、生物素連接humanifn-r、鏈霉素-hrp、aec底物反應液、陽性對照(50ng/mlpma和1ug/mlinomycin)、陰性對照(1640完全培養(yǎng)基)、1640完全培養(yǎng)基、tween-20、pbs。
作為優(yōu)選，所述氨苯砜的濃度為20-40ug/ml且含量為100ul；
anti-humanifn-r的含量為1ml；
elispot板的規(guī)格為96孔；
生物素連接humanifn-r的含量為1ml；
鏈霉素-hrp的含量為1ml；
aec底物反應液的含量為5ml；
陽性對照pma和inomycin各50ul；
陰性對照的含量為3ml；
1640完全培養(yǎng)基的含量為100ml；
tween-20的含量為100ml；
pbs的含量為500ml。
作為優(yōu)選，陽性對照為50ng/mlpma和1ug/mlinomycin；陰性對照為1640完全培養(yǎng)基。
對于第三種用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒，本發(fā)明采用的技術方案是，由表1所列組分及含量組成。
表1試劑盒成分
本發(fā)明的有益效果是：
作為用于檢測及預測氨苯砜超敏綜合征的elispot診斷試劑盒，具有操作簡便、檢測快捷、靈敏度高、方便攜帶的優(yōu)點，適用于氨苯砜超敏綜合征早期診斷的檢測。
具體實施方式
一、實驗材料
1、單一核細胞：由中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院麻風疾控中心提供病人單一核細胞樣本，液氮保存待用。
2、選取10例病人、10例健康人細胞：
(1)單一核細胞藥物刺激20小時elispot檢測
(2)單一核細胞用氨苯砜刺激t細胞增殖7天，elispot檢測。
3、試劑盒成分
表1試劑盒成分
二、實驗方法
1、抗體包被與封閉：
(1)pbs稀釋anti-humanifn-r(1∶200)，加之elispot孔板中，每孔100ul，4度過夜孵育；
(2)1640完全培養(yǎng)基洗一遍，再加入1640完全培養(yǎng)基室溫封閉2小時。
2、細胞刺激：
(1)1640完全培養(yǎng)基配置氨苯砜(1∶1000)，加入elispot孔板中，每孔100ul；
(2)單一核細胞稀釋，加入每孔2x10*5；
(3)陽性對照100ul，加入每孔2x10*5細胞；
(4)陰性對照100ul，加入每孔2x10*5細胞；
(5)37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育16-26小時，水洗兩遍，pbs洗3遍。
3、抗體檢測
pbs稀釋生物素連接humanifn-r(1∶250)，加入加入elispot孔板中，每孔100ul；室溫孵育2小時。水洗兩遍，pbs洗3遍。
4、鏈霉素-hrp
pbs稀釋生物素連接鏈霉素-hrp(1∶200)，加入加入elispot孔板中，每孔100ul；室溫孵育1小時。水洗兩遍，pbs洗3遍。
5、底物反應
加100ulaec至每孔，室溫孵育15分鐘。
三、結果
選取10例病人及10例健康人單一核細胞，比較與氨苯砜共孵育t細胞反應頻率，表2表明，在相同藥物濃度、相同培養(yǎng)時間及相同培養(yǎng)溫度條件下，10例病人及10例健康人在氨苯砜刺激及共孵育7天下t細胞反應頻率。通過直觀顯示氨苯砜刺激及共孵育7天下t細胞反應頻率，氨苯砜超敏綜合征病人在本試劑盒檢測下能靈敏的監(jiān)測t細胞反應，其斑點形成數遠遠超過健康人。
表2：各中受試者在藥物刺激后t細胞反應
以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的權利要求保護范圍之內。