本發(fā)明屬于光學(xué)超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種基于散斑照明的超分辨顯微方法和裝置。

背景技術(shù)：

隨著科技的發(fā)展，人們對微觀世界的需求日益增加，尤其是生命科學(xué)和材料科學(xué)。為了滿足對納米尺度物質(zhì)信息的探索，許多學(xué)者都在致力于提高分辨率的研究。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的超分辨技術(shù)有：結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(structuredilluminationmicroscopy,sim)，受激發(fā)射減損顯微技術(shù)(stimulatedemissiondepletion,sted)，隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,storm)，光激活定位顯微技術(shù)(photoactivatedlocalizationmicroscopy,palm)等。

上述超分辨成像技術(shù)中，storm和palm的成像速度有限，極大地限制了分子動力學(xué)、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等基礎(chǔ)生物學(xué)研究工作的開展；sted需要很強(qiáng)的光源，容易漂白熒光分子；而sim適用于各種熒光標(biāo)記的樣品，且有較好的時間分辨率，無需很強(qiáng)的光源。這些特點(diǎn)使sim在實(shí)時觀測樣品的生命活動上具有非常大的優(yōu)勢。

根據(jù)照明圖樣的不同，sim可以分為線性-sim、非線性-sim、盲-sim。其中，盲-sim由于其對像差引起的照明變形的不敏感性，所以對實(shí)驗(yàn)器材的像差校正要求低，而且不需要對照明圖案的形狀進(jìn)行精準(zhǔn)的控制，大大簡化了實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

而原始的盲-sim的算法在實(shí)驗(yàn)過程中往往不能夠使得分辨率提高到我們滿意的程度，所以之后又有基于盲-sim的優(yōu)化算法。目前，基于盲-sim的優(yōu)化算法有pe-sims-pr，但是這種基于協(xié)方差的盲-sim算法在復(fù)原一個灰度圖像時，最終結(jié)果會使得強(qiáng)度較弱的熒光信號被丟失，從而損傷最終的圖像的信息。

同樣的，散班照明的fp(pattern-illuminatedfourierptychography,pifp)算法也不需要對于照明圖案進(jìn)行精確的控制，但是這種方法需要知道照明圖案移動的精確位置，也給這個算法的實(shí)現(xiàn)帶來了一定的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于散斑照明的超分辨顯微方法和裝置。該種方法結(jié)合了散斑照明、圖樣估計和fp算法，來復(fù)原一個超分辨圖像。在隨機(jī)散斑照明圖樣下，獲取物體圖像，并且通過一個新算法估計照明圖樣。基于獲得的物體圖像和估計出的照明圖樣，使用fp算法復(fù)原出高分辨率圖像。此方法不需要提前知道照明圖樣的具體信息，只要照明圖樣滿足所有圖樣求和均勻即可，對樣品或像差引起的照明變形的不敏感，對裝置的要求大大降低，特別適合生命科學(xué)研究中的超分辨成像。

一種基于散斑照明的超分辨顯微方法，包括步驟：

1)對激光光束進(jìn)行調(diào)制，聚焦到待測樣品上形成散斑照明圖樣，并收集所述待測樣品發(fā)出的熒光，得到熒光強(qiáng)度圖像；

2)改變所述的散斑照明圖樣，得到不同散斑照明圖樣下的多幅熒光強(qiáng)度圖像；

3)將所有的熒光強(qiáng)度圖像相加得到的圖像作為寬場圖，并對所述的寬場圖進(jìn)行反卷積得到樣品的初始估計；

4)根據(jù)得到的初始估計，使用梯度下降算法算初始的照明圖像；

5)利用fp算法，在獲得的物體圖像和初始的照明圖像的基礎(chǔ)上算出更高分辨率的樣品圖像；

6)以步驟5)中算出的樣品圖像作為樣品的估計值，重復(fù)上述的步驟4)和步驟5)，直至迭代完成，即可得到超分辨圖像。

在步驟1)和步驟2)中，利用數(shù)字微鏡器件調(diào)制激光光束。

在步驟6)中，當(dāng)最近兩次迭代產(chǎn)生的照明圖像之間的均方差達(dá)到預(yù)設(shè)值時，則結(jié)束迭代?；蛘弋?dāng)最近兩次迭代產(chǎn)生的樣品圖像之間的均方差達(dá)到預(yù)設(shè)值時，則結(jié)束迭代。

作為優(yōu)選的，步驟2)不同的散斑照明圖樣相加得到的圖像的強(qiáng)度分布是均勻的。

本發(fā)明還提供一種基于散斑照明的超分辨顯微裝置，包括沿激光光束光路依次布置的激光器、數(shù)字微鏡器件、照明光路上的場鏡和顯微物鏡組成的4f系統(tǒng)和放置待測樣品的樣品臺，以及用于采集所述待測樣品發(fā)出熒光的熒光強(qiáng)度圖像的探測器；

由計算機(jī)控制所述數(shù)字微鏡器件調(diào)制激光光束，聚焦到待測樣品上形成不同的散斑照明圖樣；

并在所述的計算機(jī)內(nèi)，對不同散斑照明圖樣對應(yīng)的多幅熒光強(qiáng)度圖像進(jìn)行處理得到超分辨圖像。

優(yōu)選的，聚焦到待測樣品的不同散斑照明圖樣相加得到的圖像的強(qiáng)度分布是均勻的。

其中，所述計算機(jī)內(nèi)的處理過程如下：

將所有的熒光強(qiáng)度圖像相加得到的圖像作為寬場圖，并對所述的寬場圖進(jìn)行反卷積得到樣品的初始估計；

根據(jù)得到的初始估計，使用梯度下降算法算初始的照明圖像；

利用fp算法，在獲得的物體圖像和初始的照明圖像的基礎(chǔ)上算出更高分辨率的樣品圖像；

以高分辨率的樣品圖像作為樣品的估計值，重復(fù)梯度下降算法和fp算法的迭代過程，直至迭代完成，即可得到超分辨圖像。

優(yōu)選的，當(dāng)最近兩次迭代產(chǎn)生的照明圖像之間的均方差達(dá)到預(yù)設(shè)值時，則結(jié)束迭代?；蛘弋?dāng)最近兩次迭代產(chǎn)生的樣品圖像之間的均方差達(dá)到預(yù)設(shè)值時，則結(jié)束迭代。

本發(fā)明中的照明圖樣滿足求和后強(qiáng)度均勻分布，所有樣品圖像信息反映為每變換一次照明圖樣，得到的樣品圖像信息。

本發(fā)明的工作原理如下：

對在隨機(jī)照明圖樣下拍到的圖像進(jìn)行處理：由于成像過程中照明圖樣不是均勻分布的，所以拍到的圖像其實(shí)是照明圖樣強(qiáng)度分布乘以樣品熒光分布，再卷積系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)得到的。由于所有照明圖樣求和后強(qiáng)度分布是均勻的，所以可以將圖像求和得到的圖作為樣品的初始估計圖。對樣品的初始估計圖進(jìn)行反卷積，可以提高圖像的對比度。

使用梯度下降算法得到照明圖樣，通過該照明圖樣得到分辨率更高的樣品圖像，重復(fù)該過程，直至迭代完成，即可獲得高分辨率的樣品圖像。在本發(fā)明中，迭代完成的判斷依據(jù)是最近兩次迭代產(chǎn)生的照明圖像的均方差達(dá)到預(yù)設(shè)值，對樣品圖像也是同理。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點(diǎn)：

(1)首次提出了結(jié)合了pifp和盲-sim的復(fù)原算法；

(2)可以不需要控制照明散斑的形狀；

(3)相比原始的pifp，本發(fā)明所述的算法不需要知道散斑掃描的具體位置；

(4)裝置簡單，操作方便。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的圖像重構(gòu)程序的流程圖；

圖2為本發(fā)明圖像處理的原理示意圖；

圖3為本發(fā)明中成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。

如圖3所示，一種基于散斑照明的超分辨顯微裝置，包括：激光器1，單模光纖2，準(zhǔn)直透鏡3，第一反射鏡4，數(shù)字微鏡器件(dmd)5，第一場鏡6，二色鏡7，第二反射鏡8，顯微物鏡9，樣品臺10，濾光片11，第二場鏡12，ccd探測器13，主控計算機(jī)14。

其中，從激光器1發(fā)出的激光光束，單模光纖2、準(zhǔn)直透鏡3、第一反射鏡4、數(shù)字微鏡器件(dmd)5、第一場鏡6、二色鏡7、第二反射鏡8、顯微物鏡9和樣品臺10依次設(shè)置在激光光束光路的光軸上。準(zhǔn)直透鏡3對激光光束進(jìn)行準(zhǔn)直，數(shù)字微鏡器件(dmd)5用于改變照明圖樣，二色鏡7用于反射激發(fā)光和透射樣品的熒光，顯微物鏡9用于聚焦激發(fā)光和收集樣品發(fā)射的熒光，樣品臺10用于放置固定樣品和調(diào)焦。其中，第一場鏡6和顯微物鏡9組成了一個4f系統(tǒng)，使數(shù)字微鏡器件(dmd)5與顯微物鏡9的后焦面共軛。

濾光片11，第二場鏡12，ccd探測器13依次設(shè)置在二色鏡7的透射光路上。其中，顯微物鏡9和第二場鏡12組成另一個4f系統(tǒng)，使顯微物鏡9的后焦面和第二場鏡12的后焦面共軛。

主控計算機(jī)14同時數(shù)字微鏡器件(dmd)5和ccd探測器13。

采用圖3所示的裝置實(shí)現(xiàn)基于散斑照明的超分辨顯微方法，流程圖和圖像處理的原理示意圖分別如圖1和圖2所示，其工作過程如下：

1.利用圖3系統(tǒng)記錄在不同照明圖樣下的樣品信息的過程：

從激光器1發(fā)出的激光光束(本實(shí)施例采用波長為647nm的紅光作為激發(fā)光)，經(jīng)過單模光纖2耦合和準(zhǔn)直透鏡3準(zhǔn)直，得到準(zhǔn)直光束；準(zhǔn)直光束經(jīng)過第一反射鏡4反射到數(shù)字微鏡器件(dmd)5，使光源照明圖樣得到調(diào)制；調(diào)制后的照明圖樣依次經(jīng)過第一場鏡6、二色鏡7、第二反射鏡8，最后經(jīng)過顯微物鏡9聚焦到熒光標(biāo)記的待測樣品10上；

待測樣品經(jīng)過激光激發(fā)發(fā)射熒光，經(jīng)顯微物鏡9收集，經(jīng)過第二反射鏡8，再經(jīng)二色鏡7透射，最后通過濾光片11和第二場鏡12，聚焦到ccd探測器13上，ccd探測器13將獲取的圖片傳至主控計算機(jī)14；主控計算機(jī)14通過依次數(shù)字微鏡器件(dmd)5和ccd探測器13，獲得在不同照明圖樣下的樣品圖像。

2.對記錄的樣品圖像進(jìn)行處理：

將所有樣品圖像相加得到的圖像作為寬場圖，將得到的寬場圖進(jìn)行反卷積得到樣品的初始估計；使用梯度下降算法算出照明圖樣；使用fp算法，通過照明圖樣算出更高分辨率的樣品圖像；將獲得的樣品圖像作為樣品的估計值，重復(fù)上述步驟，直至迭代完成，即可得到超分辨圖像。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。