本申請(qǐng)是向中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的申請(qǐng)?zhí)枮?01410397103.6，申請(qǐng)日為2014年08月13日，發(fā)明創(chuàng)造名稱(chēng)為“一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及一種藥物檢測(cè)方法，特別涉及一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：雙環(huán)鉑(dicycloplatin)是由卡鉑與環(huán)丁烷二酸通過(guò)四個(gè)氫鍵組成的相對(duì)穩(wěn)定的超分子化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1,1-環(huán)丁烷二羧酸，二氨配鉑(ⅱ)合1,1-環(huán)丁烷二羧酸(bis-[1,1-cyclobutanedicarboxylicaciddiaminoplatin(ⅱ)]complex)。研究表明雙環(huán)鉑具有廣譜、高效、低毒、低耐藥、低交叉耐藥以及穿透性好等特點(diǎn)，是新一代超分子抗癌藥物。例如，公開(kāi)號(hào)為cn1311183a的發(fā)明專(zhuān)利對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行了急毒、藥效實(shí)驗(yàn)及臨床檢驗(yàn)，結(jié)果表明雙環(huán)鉑不僅低毒而且抗癌活性高，對(duì)泌生癌、頭頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、腸癌、淋巴癌等均有顯著療效。目前，尚無(wú)對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行有效定性和/或定量的相關(guān)方法報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法，用于對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行有效的定性和/或定量分析。雙環(huán)鉑作為新一代超分子抗癌藥物的臨床功效的證明為其推廣應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)該藥物的工業(yè)化生產(chǎn)，建立相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)和監(jiān)控體系不可或缺。雙環(huán)鉑的超分子結(jié)構(gòu)來(lái)自分子中卡鉑與環(huán)丁烷二酸之間的氫鍵結(jié)合，本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，由于雙環(huán)鉑的這種超分子結(jié)構(gòu)特性，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(lc-ms)、流動(dòng)注射-質(zhì)譜分析、紅外光譜分析、毛細(xì)管電泳(cze)等多數(shù)測(cè)試方法均無(wú)法對(duì)以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物中的雙環(huán)鉑進(jìn)行精確地定性，尤其是無(wú)法將雙環(huán)鉑的化合物與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物區(qū)分開(kāi)，測(cè)定結(jié)果容易出現(xiàn)假象。因此，本發(fā)明提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法，所述藥物為雙環(huán)鉑原料藥，所述檢測(cè)方法包括：對(duì)雙環(huán)鉑原料藥進(jìn)行x射線(xiàn)粉末衍射分析，獲得第一衍射圖譜；確認(rèn)所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰；若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰中的一種或兩種情況存在，則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用x射線(xiàn)粉末衍射分析(xrpd)能夠有效地對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行定性分析。其中，室溫以透射模式得到的衍射圖譜中，2θ角為10.3-10.7°處(10.51°左右處)具有衍射峰可以表明雙環(huán)鉑存在，而環(huán)丁二酸、卡鉑、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物在該處均不具有衍射峰；此外，2θ角為11.4-11.7°處(11.55°左右處)不具有衍射峰也可以表明雙環(huán)鉑存在，環(huán)丁二酸、卡鉑、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物在該處均具有衍射峰。因此，x射線(xiàn)粉末衍射分析尤其能夠?qū)Ψ勰畹暮须p環(huán)鉑的藥物進(jìn)行定性檢測(cè)，例如雙環(huán)鉑原料藥。對(duì)于含有雙環(huán)鉑的溶液(例如雙環(huán)鉑針劑)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)多數(shù)的檢測(cè)條件(例如液相色譜分析等)會(huì)破壞雙環(huán)鉑分子內(nèi)氫鍵，使其無(wú)法以超分子的形式存在，即雙環(huán)鉑在溶液中完全解離成卡鉑和環(huán)丁二酸，因此無(wú)法有效地對(duì)雙環(huán)鉑溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測(cè)，例如無(wú)法將其與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液區(qū)分開(kāi)。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，盡管雙環(huán)鉑在溶液狀態(tài)下(例如水溶液)中完全解離成卡鉑和環(huán)丁二酸，然而該溶液在經(jīng)凍干后僅存在少量的卡鉑和環(huán)丁二酸，在對(duì)雙環(huán)鉑溶液的水溶凍干粉末進(jìn)行x射線(xiàn)粉末衍射分析所得到的衍射圖譜中，在2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和/或在2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰(下稱(chēng)特征峰)，即雙環(huán)鉑溶液的水溶凍干粉末與雙環(huán)鉑原料藥具有相同的特征峰；而環(huán)丁二酸和卡鉑物理混合物的水溶凍干粉中雖然形成少量雙環(huán)鉑，但在上述特征峰處呈現(xiàn)不同，即在在2θ角為10.3-10.7°處不具有衍射峰和/或在2θ角為11.4-11.7°處具有衍射峰。因此，利用xrpd能夠有效地對(duì)雙環(huán)鉑溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測(cè)，從而將其與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液區(qū)分開(kāi)。因此，本發(fā)明還提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法，所述藥物為雙環(huán)鉑針劑，所述檢測(cè)方法包括：對(duì)雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行凍干處理，制得雙環(huán)鉑藥粉；對(duì)所述雙環(huán)鉑藥粉進(jìn)行x射線(xiàn)粉末衍射分析，獲得第一衍射圖譜；確認(rèn)所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰；若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰中的一種或兩種情況存在，則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。在本發(fā)明中，所述藥物中含有雙環(huán)鉑，其為該藥物的有效成分；此外，該藥物中可能還含有未結(jié)合成雙環(huán)鉑或者由雙環(huán)鉑解離所形成的卡鉑和/或環(huán)丁二酸，本發(fā)明將這些卡鉑和/或環(huán)丁二酸定義為雜質(zhì)。具體地，本發(fā)明可以通過(guò)三種方式對(duì)藥物中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測(cè)，即：1)若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰，則所述藥物中含有雙環(huán)鉑；2)若所述第一衍射圖譜中2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰，則所述藥物中含有雙環(huán)鉑；3)若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰，則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。并且，上述第2)和第3)種情況說(shuō)明該藥物中不含有所述雜質(zhì)。進(jìn)一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物，所述雜質(zhì)(尤其是卡鉑)表現(xiàn)為在2θ角為11.4-11.7°處具有衍射峰。因此，本發(fā)明還提供了對(duì)藥物中所述雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，即：若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和2θ角為11.4-11.7°處均具有衍射峰，則所述檢測(cè)方法還包括：將雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品與雜質(zhì)制成混合粉末進(jìn)行x射線(xiàn)粉末衍射分析，獲得第二衍射圖譜，所述混合粉末中雜質(zhì)的質(zhì)量百分含量為x％；分別獲得所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度a11和2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度a12，以及分別獲得所述第二衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度a21和2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度a22，計(jì)算a12/a11和a22/a21；若a12/a11≤a22/a21，則所述藥物中雜質(zhì)的含量≤x％，若a12/a11＞a22/a21，則所述藥物中雜質(zhì)的含量＞x％；其中，所述雜質(zhì)為卡鉑和環(huán)丁二酸中的一種或兩種。在本發(fā)明中，可以藥物中的卡鉑含量(雜質(zhì)為卡鉑)作為藥物雜質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)對(duì)藥物中的雜質(zhì)含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，特別是所述x％可以為0.1-1％。此時(shí)，若a12/a11≤0.67，則所述藥物中卡鉑的含量≤1％；若a12/a11＞0.67，則所述藥物中卡鉑的含量＞1％；進(jìn)一步地，若a12/a11≤0.55，則所述藥物中卡鉑的含量≤0.5％；若a12/a11＞0.55，則所述藥物中卡鉑的含量＞0.5％；再進(jìn)一步地，若a12/a11≤0.5，則所述藥物中卡鉑的含量≤0.1％；若a12/a11＞0.5，則所述藥物中卡鉑的含量＞0.1％。在本發(fā)明中，所述藥物中卡鉑含量的檢測(cè)限可達(dá)0.1％。在本發(fā)明具體方案中，采用配有透射旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)的x射線(xiàn)粉末衍射儀進(jìn)行所述x射線(xiàn)粉末衍射分析，方法包括：使用單色cukα輻射，管壓為40kv，管流為40ma，2θ掃描范圍為6-55°，掃描速度為0.6s/步，步長(zhǎng)為0.015°/步。所述第一衍射圖譜和第二衍射圖譜均是在室溫以透射模式得到。進(jìn)一步地，本發(fā)明的檢測(cè)方法還包括對(duì)以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物進(jìn)行定量檢測(cè)，即：將雙環(huán)鉑原料藥制成溶液后或雙環(huán)鉑針劑稀釋后進(jìn)行反相高效液相色譜檢測(cè)，同時(shí)以0.025-0.999mg/ml的卡鉑溶液和0.101-3.99mg/ml的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別確定所述雙環(huán)鉑針劑中卡鉑和環(huán)丁二酸的質(zhì)量含量。進(jìn)一步地，使所述溶液或稀釋后的所述雙環(huán)鉑針劑中雙環(huán)鉑的質(zhì)量濃度為1mg/ml，并且以0.7mg/ml的卡鉑溶液和0.3mg/ml的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。所述質(zhì)量含量的確定可以通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行。本發(fā)明還可以采用其它定量檢測(cè)方法，例如：將雙環(huán)鉑原料藥制成溶液后或雙環(huán)鉑針劑稀釋后進(jìn)行反相高效液相色譜檢測(cè)，同時(shí)以0.067-2.7mmol/l的卡鉑溶液和0.7-27.8mmol/l的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別確定所述雙環(huán)鉑針劑中卡鉑和環(huán)丁二酸的摩爾含量以及卡鉑與環(huán)丁二酸的摩爾比。進(jìn)一步地，使所述溶液或稀釋后的所述雙環(huán)鉑針劑中雙環(huán)鉑的摩爾濃度為2mmol/l，并且以2mmol/l的卡鉑溶液和2mmol/l的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。在本發(fā)明具體方法中，所述反相高效液相色譜的條件為：色譜柱：aq-c18，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣量：10μl；流速：1.0ml/min；流動(dòng)相：a相為20mmol/l且ph為3.0的磷酸二氫鈉緩沖液，b相為甲醇；梯度條件：0-3min，5％b相，3-8min，5-60％b相，8-12min，60％b相。本發(fā)明所提供的以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測(cè)方法，能夠?qū)λ幬镏械碾p環(huán)鉑進(jìn)行定性和/或定量分析，其能夠排除其它測(cè)定方法所帶來(lái)的假象，真實(shí)且直觀地對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行有效地測(cè)定，尤其是本發(fā)明能夠?qū)⑵渑c卡鉑與環(huán)丁二酸的物理混合物區(qū)分開(kāi)，并且能夠?qū)λ幬镏械碾s質(zhì)含量(以卡鉑計(jì))進(jìn)行有效地測(cè)定，從而為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中樣品1在透射模式和反射模式下的x射線(xiàn)粉末衍射圖譜，其中a為透射模式，b為反射模式；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1各樣品的x射線(xiàn)粉末衍射圖譜；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2各樣品的x射線(xiàn)粉末衍射圖譜；圖4為本發(fā)明實(shí)施例4各樣品的dsc曲線(xiàn)；圖5為本發(fā)明對(duì)照例1的樣品1的紅外圖譜；圖6為本發(fā)明對(duì)照例1的樣品4的紅外圖譜；圖7為本發(fā)明對(duì)照例2的雙環(huán)鉑針劑在正離子模式下的質(zhì)譜圖；圖8為本發(fā)明對(duì)照例2的雙環(huán)鉑針劑在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明實(shí)施例所采用的樣品包括：雙環(huán)鉑原料藥(以下稱(chēng)樣品1)：四批，均購(gòu)自北京市興大科學(xué)系統(tǒng)公司，批號(hào)分別為：20130115-1、20130115-2、2013015-3和20130216；環(huán)丁二酸(以下稱(chēng)樣品2)：純度為99.5％以上；卡鉑(以下稱(chēng)樣品3)：純度為99％以上；環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物(以下稱(chēng)樣品4)：取19mg環(huán)丁二酸和50mg卡鉑，混合后于研缽中輕微研成粉末狀，其中環(huán)丁二酸與卡鉑的摩爾比約為1:1；在本發(fā)明中，將環(huán)丁二酸和卡鉑直接混合所得到的混合物定義為環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物，該混合物中環(huán)丁二酸和卡鉑未形成氫鍵；雙環(huán)鉑原料藥的水溶凍干粉(以下稱(chēng)樣品5)：取60mg雙環(huán)鉑原料藥，用2.5ml去離子水溶解，室溫放置2h后，置于-70℃冰箱冷凍4h，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)(冷阱溫度-69℃，真空為10pa)，冷凍干燥12h，制得白色凍干粉；環(huán)丁二酸和卡鉑物理混合物的水溶凍干粉(以下稱(chēng)樣品6)：將上述環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物按照上述方法制成凍干粉；雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品和針劑：購(gòu)自北京市興大科學(xué)系統(tǒng)公司，其中：雙環(huán)鉑針劑為5ml安瓿，雙環(huán)鉑的含量為1％(即1g/100ml)；雙環(huán)鉑針劑的凍干粉：將上述雙環(huán)鉑針劑按照上述方法制成凍干粉。實(shí)施例1x射線(xiàn)粉末衍射(xrpd)分析一、儀器和條件x射線(xiàn)粉末衍射儀：brukerd8-advance，配有反射和透射旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)；透射：cukα輻射，聚焦單色器，gobel-mirror聚焦光路，管壓40kv管流40ma；掃描方式：θ/2θ掃描；ds發(fā)散狹縫1.2mm，索拉狹縫2.5mm；2θ掃描范圍：6-55°；掃描速度：0.6s/step；步長(zhǎng)：0.015°/step。二、xrpd分析在室溫下采用透射模式和反射模式分別對(duì)一批樣品1進(jìn)行xrpd測(cè)定，衍射圖譜如圖1所示。由圖1可知：鑒于雙環(huán)鉑原料藥為針狀晶體，存在嚴(yán)重的擇優(yōu)取向，相對(duì)于反射模式(b)，采用透射模式(a)能夠弱化雙環(huán)鉑的擇優(yōu)取向，從而排除晶體形狀干擾，因此能夠更為真實(shí)地反映樣品的結(jié)構(gòu)信息。在本實(shí)施例中，xrpd均在室溫下采用透射模式進(jìn)行。將上述各樣品分別裝入透射樣品臺(tái)后進(jìn)行xrpd測(cè)定，衍射圖譜如圖2所示。由圖2可知：含有雙環(huán)鉑的樣品1和樣品5與其它樣品存在顯著差異，首先，樣品1和5在2θ角為11.4-11.7°處(11.55°左右)無(wú)明顯的衍射峰，而其它幾個(gè)樣品在該處具有明顯的衍射峰；其次，樣品1和5在2θ角為10.3-10.7°處(10.51°左右)具有明顯的衍射峰，而其它樣品在該處無(wú)明顯的衍射峰。因此，可以通過(guò)衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰來(lái)判定樣品中是否含有雙環(huán)鉑，從而將其與卡鉑、環(huán)丁二酸、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物及其水溶凍干粉區(qū)分開(kāi)。進(jìn)一步地，對(duì)上述雙環(huán)鉑針劑的凍干粉進(jìn)行xrpd測(cè)定，其衍射圖譜與樣品5基本相同，衍射圖譜中在2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰，而在2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰。實(shí)施例2藥物雜質(zhì)分析精密稱(chēng)取4份50mg雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品(不含卡鉑和環(huán)丁二酸)，向各份分別添加0.5mg、0.25mg、0.05mg和0mg卡鉑，輕微研細(xì)混合均勻，分別制成樣品a、樣品b、樣品c、樣品d，各樣品的卡鉑含量分別為1％、0.5％、0.1％和0％。將上述樣品a-d分別裝入透射樣品臺(tái)后，按照實(shí)施例1方法進(jìn)行xrpd測(cè)定，衍射圖譜如圖3所示。將衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作a21，2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作a22。經(jīng)計(jì)算，樣品a-c的a22/a21分別為0.67、0.55和0.5。對(duì)雙環(huán)鉑原料藥進(jìn)行xrpd測(cè)定，并將其衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作a11，2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作a12，計(jì)算a12/a11，并通過(guò)各樣品的卡鉑含量及其相對(duì)應(yīng)的a22/a21作為參照來(lái)確定雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量。即，若a12/a11≤0.67，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤1％，若a12/a11＞0.67，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量＞1％；進(jìn)一步地，若a12/a11≤0.55，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤0.5％，若a12/a11＞0.55，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量＞0.5％；再進(jìn)一步地，若a12/a11≤0.5，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤0.1％，若a12/a11＞0.5，則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量＞0.1％。本實(shí)施例僅示例了如何對(duì)雙環(huán)鉑原料藥中的卡鉑含量進(jìn)行定量檢測(cè)，然而上述樣品中的卡鉑含量并不局限于上述所示例的數(shù)值，只要能夠添加通過(guò)xrpd衍射圖譜檢測(cè)出樣品中的卡鉑含量(例如樣品中卡鉑含量≥0.1％)，則a22/a21可以是其它任意數(shù)值，并且可以該數(shù)值作為參照來(lái)確定雙環(huán)鉑原料藥中的卡鉑含量。實(shí)施例3反相高效液相色譜分析一、儀器和色譜條件儀器：島津lc-20a高效液相色譜系統(tǒng)，配備spd-10a紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，lcsolution化學(xué)工作站；色譜柱：aq-c18，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣量：10μl；流速：1.0ml/min；流動(dòng)相及梯度條件：a相：20mmol/l磷酸二氫鈉緩沖液，ph3.0；b相：甲醇；梯度條件：0-3min，5％b相，3-8min，5-60％b相，8-12min，60％b相。二、卡鉑和環(huán)丁二酸的線(xiàn)性關(guān)系分別精確稱(chēng)取卡鉑9.99mg、環(huán)丁二酸39.94mg，置10ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，制成0.999mg/ml的卡鉑溶液和3.99mg/ml的環(huán)丁二酸溶液；經(jīng)逐級(jí)稀釋后，制得一系列不同濃度的溶液，然后分別取10μl溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。液相色譜結(jié)果表明：卡鉑溶液在0.025-0.999mg/ml(即0.067-2.7mmol/l)范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.999；環(huán)丁二酸溶液在0.101-3.99mg/ml(即0.7-27.8mmol/l)范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.999。三、雙環(huán)鉑藥物的定量測(cè)定分別精密稱(chēng)取上述四批雙環(huán)鉑原料藥各約10mg至10ml容量瓶，用流動(dòng)相溶解，配制成約1.0mg/ml的溶液；同時(shí)對(duì)上述雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥杉s1.0mg/ml的溶液。分別取10μl上述各溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)以0.7mg/ml左右的卡鉑溶液和0.3mg/ml左右的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定后，計(jì)算測(cè)定結(jié)果相對(duì)于各自標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量百分含量(即，測(cè)定的卡鉑或環(huán)丁二酸的濃度/標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度×100％)，結(jié)果如表1所示。表1雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的質(zhì)量百分含量雙環(huán)鉑藥物卡鉑的質(zhì)量百分含量環(huán)丁二酸的質(zhì)量百分含量第一批原料藥101.8％102.7％第二批原料藥100.0％100.4％第三批原料藥98.3％100.0％第四批原料藥101.3％102.6％雙環(huán)鉑針劑99.8％97.6％由表1結(jié)果可知：雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的含量在97-103％，其可作為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。進(jìn)一步地，還可以采用下述方法進(jìn)行定量測(cè)定：將上述四批雙環(huán)鉑原料藥，分別配制成摩爾濃度約為2mmol/l的溶液；同時(shí)將上上述雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行稀釋為2mmol/l左右的溶液。分別取10μl上述各溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)以2mmol/l左右的卡鉑溶液和2mmol/l左右的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，結(jié)果如表2所示。表2雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的摩爾濃度及摩爾比由表2結(jié)果可知：雙環(huán)鉑藥物中卡鉑與環(huán)丁二酸的摩爾比為0.95-1.05，其可作為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。實(shí)施例4示差掃描量熱法分析(dsc)一、儀器和參數(shù)示差掃描量熱儀：美國(guó)taq2000，al盤(pán)為參比盤(pán)，樣品盤(pán)為鋁盤(pán)，升溫速率：10℃/min，升溫區(qū)間40℃-240℃。二、示差掃描量熱法分析分別精確稱(chēng)取50mg樣品1至樣品6，并用示差掃描量熱儀測(cè)定其熱重參數(shù)，結(jié)果如圖4所示。圖4結(jié)果表明：樣品1、樣品5和樣品6的dsc曲線(xiàn)較為相似，其分別在197.82℃、198.23℃和184.13℃開(kāi)始出現(xiàn)吸熱峰；樣品4與樣品1的dsc曲線(xiàn)呈現(xiàn)較大差異，其除在182.04℃處有吸熱峰外，在153.05℃還有一個(gè)明顯的吸熱峰，該峰與環(huán)丁二酸的吸熱峰接近，可確認(rèn)為環(huán)丁二酸組分吸熱峰；而樣品3在153℃和200℃附近均未出現(xiàn)吸熱峰，當(dāng)溫度升至252℃時(shí)有一個(gè)分解峰。此外，樣品1和樣品5在197℃出現(xiàn)尖峭的相變峰，吸收峰僅略發(fā)生位移，說(shuō)明凍干過(guò)程對(duì)雙環(huán)鉑兩個(gè)組分間的影響不大；樣品6與樣品1和樣品5的dsc曲線(xiàn)相似，其在153℃附近未出現(xiàn)環(huán)丁二酸熔融峰，說(shuō)明樣品6中卡鉑與環(huán)丁二酸由于氫鍵作用形成了雙環(huán)鉑類(lèi)似物，然而其在197℃附近的峰形很寬，由此說(shuō)明雙環(huán)鉑的兩個(gè)組分處于結(jié)晶態(tài)，而卡鉑和環(huán)丁二酸物理混合物的水溶凍干粉的組分處于半結(jié)晶態(tài)或無(wú)定形態(tài)，其結(jié)晶狀態(tài)與雙環(huán)鉑顯著不同。由此說(shuō)明，雙環(huán)鉑原料藥與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物存在顯著差異，雙環(huán)鉑的兩個(gè)組分間由于氫鍵作用而形成了新的超分子氫鍵簇集體。實(shí)施例5核磁共振滴定法(nmr)一、儀器和參數(shù)核磁共振滴定采用日本電子eca-400型超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀，其配有選擇脈沖laminal波形發(fā)生器和5mmz-軸梯度脈沖多核探頭。1h工作頻率分別為400mhz，以dmso-d6為溶劑，tms為內(nèi)標(biāo)；實(shí)驗(yàn)溫度為室溫，使用ф5mm多核探頭；1hnmr的譜寬9.18khz，數(shù)據(jù)點(diǎn)32768，90°脈沖寬度11μs，弛豫延遲1.2s。二、核磁共振滴定實(shí)驗(yàn)(固定環(huán)丁二酸量)固定環(huán)丁二酸的用量并改變卡鉑的加入量，用0.5ml氘代dmso溶解后放置一夜，測(cè)定環(huán)丁二酸羧基與卡鉑氨基的1hnmr化學(xué)位移，卡鉑、環(huán)丁二酸的添加量與核磁滴定結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果表明，除環(huán)丁二酸分子中的羧基氫外，其它所有氫原子的化學(xué)位移均未隨卡鉑加入量的增加發(fā)生改變，說(shuō)明卡鉑分子中的氨基氫受環(huán)丁二酸的加入影響較小。并且，環(huán)丁二酸羧基氫的化學(xué)位移隨其自身加入量的增加而發(fā)生顯著變化，從高場(chǎng)往低場(chǎng)發(fā)生移動(dòng)(12.68→13.42ppm)，由此說(shuō)明環(huán)丁二酸與卡鉑之間的確存在氫鍵作用。此外，依據(jù)不同卡鉑添加量下的羧基氫的化學(xué)位移值(p)，通過(guò)非線(xiàn)性擬合計(jì)算得卡鉑與環(huán)丁二酸之間的解離常數(shù)為0.3mmol/l；依據(jù)羧基氫的化學(xué)位移值倒數(shù)與卡鉑摩爾濃度的倒數(shù)，計(jì)算得環(huán)丁二酸與卡鉑的結(jié)合常數(shù)為4.22x104l/mol；由此進(jìn)一步說(shuō)明雙環(huán)鉑的兩個(gè)組分之間確實(shí)存在氫鍵作用，但兩個(gè)組分之間的氫鍵結(jié)合力較弱。表3卡鉑和環(huán)丁二酸的添加量及化學(xué)位移對(duì)照例1紅外光譜分析采用perkinelmer紅外光譜儀(frontier)對(duì)樣品1和樣品4進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法具體為：預(yù)先將kbr烘干，研磨，壓片后測(cè)本底，再將樣品1、樣品4分別與適量kbr粉末研磨混勻，壓片后測(cè)定，樣品1和樣品4的紅外圖譜分別如圖5和圖6所示。圖5和圖6結(jié)果表明：樣品1和樣品4的紅外圖譜無(wú)顯著差異，表明紅外光譜分析無(wú)法對(duì)雙環(huán)鉑原料藥與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物進(jìn)行有效區(qū)分，因此無(wú)法對(duì)雙環(huán)鉑進(jìn)行有效且精確地定性分析。對(duì)照例2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms)一、儀器及色譜條件毛細(xì)管電壓：3kv(或-2.6kv)；提取錐孔電壓：4v(或-4v)；樣品錐孔電壓：15v(或-20v)；源溫：300℃；掃描范圍：80-1000；色譜柱：xdb-c18，4.6x50mm，1.8um；流動(dòng)相及梯度條件：流動(dòng)相a：0.1％甲酸水溶液；流動(dòng)相b：甲醇；梯度：0min，1％b；1min，1％b；3.5min，60％b；5.5min，60％b；流速：0.5ml/min；進(jìn)樣體積：2ul。二、液相色譜-質(zhì)譜分析按照上述色譜條件對(duì)雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7和圖8結(jié)果表明：雙環(huán)鉑在液相色譜分離條件下無(wú)法以其超分子氫鍵簇集體形式存在，其完全解離成卡鉑與環(huán)丁二酸，其中在正離子和負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到解離產(chǎn)生的卡鉑和環(huán)丁二酸，圖7中m/z372.0514為卡鉑的分子離子峰[m+h]+，圖8中m/z143.0341為環(huán)丁二酸的分子離子峰[m-h]-。由此表明：lc-ms同樣無(wú)法對(duì)雙環(huán)鉑溶液進(jìn)行有效地定性分析。對(duì)照例3流動(dòng)注射-質(zhì)譜分析鑒于液相色譜分離會(huì)破壞雙環(huán)鉑分子內(nèi)的氫鍵，因此嘗試采用流動(dòng)注射進(jìn)樣，從而直接對(duì)雙環(huán)鉑水溶液(雙環(huán)鉑針劑)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：雙環(huán)鉑水溶液在正離子模式下僅檢測(cè)到卡鉑的分子離子峰[372.0543]，而在負(fù)離子模式下觀察到雙環(huán)鉑[m/z514.0917]和環(huán)丁二酸[m/z143.0375]的分子離子峰。由此可見(jiàn)，色譜分離會(huì)破壞雙環(huán)鉑超分子氫鍵簇集體，因此無(wú)法區(qū)分雙環(huán)鉑水溶液與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液；采用流動(dòng)注射進(jìn)樣后直接質(zhì)譜分析能夠在負(fù)離子模式下獲得雙環(huán)鉑的準(zhǔn)確分子量，因此其僅適用于對(duì)雙環(huán)鉑的準(zhǔn)確分子量進(jìn)行測(cè)定，不適合對(duì)雙環(huán)鉑水溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測(cè)。對(duì)照例4毛細(xì)管電泳(cze)一、儀器和參數(shù)采用agilentg1602a毛細(xì)管電泳儀；電壓：+20kv；毛細(xì)管內(nèi)徑：75μm；紫外/二極管陣列監(jiān)測(cè)器。二、水相cze分離配制四份20mm的ph為7.05左右的nah2po4-na2hpo4緩沖液，向其中三份緩沖液中分別添加β-環(huán)糊精(β-cd)、羥丙基-β-環(huán)糊精(hp-β-cd)和羧甲基-β-環(huán)糊精(cm-β-cd)，該四種緩沖液作為毛細(xì)管電泳分離緩沖液；開(kāi)啟電泳儀后，分別用1m的naoh、0.1m的naoh、水、上述四種緩沖液依次沖洗毛細(xì)管柱，進(jìn)樣后在電壓為20kv、柱溫為25℃下對(duì)樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明，在上述各分離條件下(即各緩沖液)，雙環(huán)鉑與卡鉑的出峰時(shí)間均一致，未發(fā)現(xiàn)有分離跡象，卡鉑、雙環(huán)鉑、卡鉑和雙環(huán)鉑的物理混合物的出峰時(shí)間均在7.42min左右，并且雙環(huán)鉑與卡鉑的物理混合物的峰面積約為卡鉑和雙環(huán)鉑的峰面積之和。三、非水cze分離(nace)配制20mmnh4ac的乙腈溶液，用乙酸調(diào)節(jié)ph至7左右后作為毛細(xì)管電泳分離緩沖液，按照上述方法對(duì)樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明，在上述分離條件下，雙環(huán)鉑與卡鉑未發(fā)現(xiàn)有分離跡象。四、膠束毛細(xì)管電泳分離(mekc)配制20mm的十二烷基磺酸鈉(sds)水溶液作為毛細(xì)管工作緩沖液，按照上述方法對(duì)樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明，在上述分離條件下，雙環(huán)鉑與卡鉑未發(fā)現(xiàn)有分離跡象。綜上所述，采用三種模式的毛細(xì)管電泳對(duì)各樣品進(jìn)行分離時(shí)，各樣品均未出現(xiàn)分離現(xiàn)象，且雙環(huán)鉑和卡鉑的出峰時(shí)間一致，其進(jìn)一步說(shuō)明雙環(huán)鉑由于超分子內(nèi)相對(duì)共價(jià)鍵較弱的氫鍵存在，在電場(chǎng)能量環(huán)境作用下解離為卡鉑和環(huán)丁二酸。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12