本發(fā)明涉及一種針對可卡因的即時(shí)定量便攜檢測新裝置，屬于可視化定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：核酸適體是能夠與特定靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，是一種新型的分析、診斷分子。自出現(xiàn)以來，核酸適體便得到了越來越廣泛的應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)蛋白單克隆抗體，核酸適體具有易合成、更穩(wěn)定、易修飾、親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(1、GoldL.，PoliskyB.，UhlenbeckO.，et.al.，Diversityofoligonucleotidefunctions,AnnualReviewofBiochemistry[J].1995,64.763-797；2、Van-ThuanNguyen，YoungSeopKwon，ManBockGu，Aptamer-basedenvironmentalbiosensorsforsmallmoleculecontaminants[J].2017,45:15–23；3、TarunKumarSharma，JohnG.Bruno，AbhijeetDhiman，ABCsofDNAaptamerandrelatedassaydevelopment[J].2017,35:275-301.)?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，近數(shù)十年已經(jīng)發(fā)展了縱多利用核酸適體構(gòu)建的的生物傳感器，用于多種小分子、蛋白或金屬離子的定性或定量檢測(4、S.Tombelli,M.Minunni,M.Mascini，Analyticalapplicationsofaptamers[J].2005,20:2424-2434.)。DNA水凝膠(DNAHydrogel)就是利用核酸適體的特異性實(shí)現(xiàn)對特定靶標(biāo)的智能響應(yīng)。水凝膠是以水為分散介質(zhì)的凝膠，是在具有網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子中引入一部分疏水基團(tuán)和親水殘基，親水殘基與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，而疏水殘基遇水膨脹的交聯(lián)聚合物，是一種高分子網(wǎng)絡(luò)體系，性質(zhì)柔軟，能保持一定的形狀，能吸收大量的水。DNA水凝膠是由兩條分別帶有鏈A序列和鏈B序列的聚合物鏈通過一條與鏈A和鏈B皆能部分互補(bǔ)的Linker鏈進(jìn)行交聯(lián)后形成的膠狀固體，當(dāng)加入與Linker核酸適體特異性結(jié)合的靶標(biāo)后，競爭奪取Linker，使膠狀水凝膠瓦解，釋放出包埋在水凝膠中的信號分子或信號啟動(dòng)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)信號放大及輸出(5、LiuJ，LiuH，KangH，et.al.，Aptamer-incorporatedhydrogelsforvisualdetection，controlleddrugrelease,andtargetedcancertherapy[J].AnalBioanalChem.2012,402:187–194；6、ZhiZhu，CuichenWu，HaipengLiu，et.al.，AnAptamerCross-LinkedHydrogelasaColorimetricPlatformforVisualDetection[J].Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,1052-1056.)。即時(shí)診斷是一門實(shí)驗(yàn)醫(yī)療學(xué)科，近年來也日漸成熟成為一項(xiàng)重要的診斷技術(shù)。所謂即時(shí)診斷(PointofCareTest，POCT)，是指在能夠在病人身旁快速獲得診斷結(jié)果(7、PeterB.Luppa，CarolinMuller，AliceSchlichtiger，Point-of-caretesting(POCT):Currenttechniquesandfutureperspectives[J].TrendsinAnalyticalChemistry,2011,30:887-898.)。該技術(shù)方便、快捷，無需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、專業(yè)人員，亦不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品處理，而是僅僅依靠簡單的設(shè)備來讀出信號或者通過觀察試紙上的條紋、斑點(diǎn)等顏色變化實(shí)現(xiàn)檢測目的。即時(shí)診斷除應(yīng)用于醫(yī)院、診所中以達(dá)到迅速獲取病人信息外，也使疫情早期預(yù)警、家庭保健防護(hù)、貧困地區(qū)醫(yī)療以及食物、水、環(huán)境等的現(xiàn)場監(jiān)測等成為可能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對傳統(tǒng)可卡因檢測方法的操作復(fù)雜、成本高、所需儀器昂貴等問題，設(shè)計(jì)出了一種快速、低成本、特異性強(qiáng)的可卡因檢測新裝置及方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種基于距離變化信號輸出的可卡因便攜檢測裝置，其特征在于：包括一PCR管，管蓋打孔，孔中連接上一短硅膠管；一長硅膠管，長硅膠管中封裝有染料；一連接管，所述的連接管一端和長硅膠管連接，另一端能夠插入短硅膠管；一用于測量距離的刻度工具。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，所述的連接管為硬質(zhì)管，例如聚四氟乙烯管。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，所述的短硅膠管長度為0.5-2cm，長硅膠管的長度大于20cm(例如30cm。40cm,50cm,60cm,70cm,80cm)；連接管長度0.5-2cm。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，所用的長、短硅膠管尺寸為：內(nèi)徑0.6-1.0mm，外徑1.7-2.1mm，連接管的尺寸為：內(nèi)徑0.5-0.6mm，外徑0.9-1.2mm。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，長硅膠管中封裝的染料，長度為0.5-2cm。本發(fā)明所用的PCR管，優(yōu)選為200微升規(guī)格。本發(fā)明的又一技術(shù)方案為：一種基于距離變化信號輸出的可卡因便攜檢測方法，包括如下步驟：(1)制備前述的便攜裝置；(2)設(shè)計(jì)并合成可卡因核酸適體及與其一末端部分序列互補(bǔ)的鏈A和與其另一末端部分序列互補(bǔ)的鏈B，并通過化學(xué)方法在鏈A、鏈B的遠(yuǎn)離互補(bǔ)序列的一端修飾上丙烯酰胺單體；(3)將修飾后的鏈A、鏈B分別與一定比例的丙烯酰胺單體聚合形成線狀高分子聚合產(chǎn)物PS-A、PS-B；(4)將PS-A、PS-B、鉑納米顆粒、可卡因核酸適體鏈組裝成水凝膠；(5)往水凝膠中緩慢加入可卡因樣品液并充分孵育反應(yīng)，在較佳的實(shí)施例中，可以為反應(yīng)2-3小時(shí)；(6)吸取上清解膠液加入到含過氧化氫的檢測裝置的產(chǎn)氣部分，迅速蓋上管蓋并連接長硅膠管，開始記時(shí)；(7)反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后拔下長硅膠管，用刻度尺測量染料移動(dòng)距離，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的可卡因濃度。在步驟(1)中，所用的長短硅膠尺寸為：內(nèi)徑0.8mm，外徑1.9mm，聚四氟乙烯管的尺寸為：內(nèi)徑0.56mm，外徑1.07mm。在步驟(4)中，水凝膠中鏈A、鏈B及Linker鏈的終濃度分別為110μM、110μM、77μM。在步驟(7)中，通過先斷開產(chǎn)氣部分可以保證每次測量時(shí)染料的起始位置相同，且可以通過產(chǎn)氣反應(yīng)結(jié)束時(shí)拔下長硅膠管來定格住距離信號值，便于后期距離的刻度測量。優(yōu)選方法如下：(1)有機(jī)方法合成丙烯酸亞磷酰胺單體(2)5’端修飾有甲基丙烯基團(tuán)的寡核苷酸分子的合成與純化寡核苷酸的合成及修飾，所用方法是亞磷酰胺固相合成法?；驹硎且訡PG共價(jià)結(jié)合的核苷單體作為3’端，再經(jīng)過脫保護(hù)、活化、偶合、封閉、氧化五個(gè)不斷循環(huán)的步驟，不斷順序結(jié)合上所需序列的核苷單體，直至完成整個(gè)寡核苷酸鏈的合成。DNA合成與修飾完成后，將DNA捅入2mL的離心管中，再加入氨水甲胺混合液約0.5mL，并用封口膜封口置于65℃下加熱半小時(shí)，再用1mL槍頭吸取液體成分于2mL離心管中，再用酒精沉淀法(3MNaCl溶液約60μL，無水乙醇約1.25mL，并置于-20℃下保存約30min，以促進(jìn)其充分沉淀)，再用冷凍離心機(jī)在10℃、12000r/min下，離心5min，離心后去上清液，再加入200～400μL的0.1M的TEAA溶液(若是現(xiàn)配溶液需過膜除雜)，再振蕩、離心，再用0.45μm截留分子量的針頭膜過濾純化，之后再過HPLC分離純化，再真空抽干為固體，最后用乙酸約150μL于37℃孵育30min去除DMT(對苯二甲酸二甲酯)基團(tuán)，再真空抽干，再用排阻色譜或超濾離心去掉小分子雜質(zhì)(如乙酸)，再用紫外分光光度計(jì)定量DNA的純度和濃度，再放置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?3)鏈A和鏈B的聚合首先，將修飾有甲基丙烯基團(tuán)的鏈A和鏈B分別溶于超純水中配制成高濃度DNA儲存液；然后配制新鮮的10％的過硫酸銨和5％的TEMED，即0.05g過硫酸銨溶解至0.5ml超純水和25μLTEMED溶解于0.475mL超純水中；再將DNA與終濃度為4％的丙烯酰胺振蕩混勻，放入真空干燥器中抽真空除氣10min；再加入終濃度為1.4％的引發(fā)劑過硫酸銨和加速劑5％TEMED，混勻后將反應(yīng)體系置于真空干燥器中，37℃條件下抽真空反應(yīng)15min，從而得到鏈A和鏈B的線狀高分子聚合產(chǎn)物PS-A、PS-B；最后，用超濾離心管過濾掉示聚合或聚合不完全的反應(yīng)物，得到較純的PS-A、PS-B。(4)組裝搭建檢測裝置(5)可卡因特異性響應(yīng)的定量便攜檢測將可卡因樣品液與制備好的水凝膠孵育后，吸取一定量的解膠液加入到檢測裝置的產(chǎn)氣PCR管中，與PCR管中的過氧化氫反應(yīng)，立即蓋上蓋子，接上硅膠管，記時(shí)，反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，拔下硅膠管，用刻度尺測量染料移動(dòng)距離，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到樣品的可卡因濃度值。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的裝置，1)所需材料，包括PCR管、硅膠管、聚四氟乙烯管、刻度尺、染料、502膠水均常見易得，且組裝快捷，成本低廉。制備迅速，非常有利于可卡因的便攜式現(xiàn)場檢測，無需大型儀器。2)檢測操作簡單，3)結(jié)果證明本發(fā)明裝置選擇性好，檢測結(jié)果可靠，4)檢測結(jié)果通過刻度尺量染料移動(dòng)距離即可，為可視化，便于工作人員現(xiàn)場檢測。在方法上，該方法在設(shè)計(jì)上符合ASSURED(MartinezA.，PhillipsS.，WhitesidesG.，et.al.，DiagnosticsfortheDevelopingWorld:MicrofluidicPaper-BasedAnalyticalDevices,AnalyticalChemistry[J].2010,82.3-10.)的國際標(biāo)準(zhǔn)；另外，由于SELEX技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多靶標(biāo)的核酸適體被篩選出來，因此，改變水凝膠中的Linker-Aptamer序列，即可得到針對不同種靶標(biāo)的定量便攜檢測。鑒于成本低廉、操作簡單、檢測迅速、用戶友好以及裝置的普適性好，該裝置的可進(jìn)一步發(fā)展用于更多臨床靶標(biāo)的定量便攜可視化檢測。附圖說明圖1為丙烯酸亞磷酰胺單體合成路線；圖2-1、2-2、2-3分別為本發(fā)明檢測裝置檢測原理和實(shí)物圖；圖3-1、3-2、表2為可卡因水凝膠PS-A、PS-B和Linker的比例優(yōu)化結(jié)果；圖4為實(shí)施例6中裝置用于可卡因定量檢測的工作曲線結(jié)果；圖5為實(shí)施例7中裝置對于可卡因及可卡因水解產(chǎn)物選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6為實(shí)施例8中裝置用于尿樣中可卡因的定量檢測結(jié)果；圖7為實(shí)施例9中裝置檢測與標(biāo)準(zhǔn)LC/MS方法比較結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1丙烯酸亞磷酰胺單體的合成參見圖1，丙烯酸亞磷酰胺單體的有機(jī)合成分為兩個(gè)步驟：第一步：合成Acrydite-OH稱取440mg(5mmol)2-甲基丙烯酸，1356mg(6mmol)DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)，810mg(6mmol)HOBT(1-羥基苯并三唑),59.5mg(0.5mmol)DMAP(4-二甲氨基吡啶)及585mg(5mmol)氨基己醇于一50ml圓底燒瓶中，加磁子，后加入4mlDMF溶劑，用橡膠塞封口，氮?dú)夥諊率覝財(cái)嚢璺磻?yīng)過夜。反應(yīng)現(xiàn)象：有大量白色固體生成(DCU，1，3-二環(huán)己基脲)。后處理：先用棉花漏斗過濾除去沉淀，再水洗用乙酸乙酯萃取。目的是除去DMF(二甲基甲酰胺)。萃取收集有機(jī)相，用無水硫酸鎂干燥半小時(shí)以上，再用濾芯漏斗抽濾后抽去大部分溶劑，保留3-4ml待過柱上樣。稍后過柱純化。產(chǎn)物點(diǎn)板情況：紫外顯色，后用高錳酸鉀溶液亦顯色。第二步：合成Acrydite-phosphoramidite取213mg(1.15mmol)上步產(chǎn)物，抽排三次，加少量二氯甲烷溶解，在0℃溫度下后滴加0.55mlDIPEA，最后滴加0.28mlP-(N-iPr2)2(OCH2CH2CN)，滴加完畢后，避光0℃反應(yīng)約4小時(shí)。后處理：旋蒸除去二氯甲烷，直接上樣過硅膠柱純化。產(chǎn)物：碘缸和紫外都顯色。得到的終產(chǎn)物為無色油狀液體。終產(chǎn)物的核磁表征數(shù)據(jù)如下：1HNMR(500MHz,CDCl3):5.83(s,1H),5.65(s,1H),5.29(s,1H),3.85–3.76(m,2H),3.65–3.55(m,4H),3.32–3.27(q,2H),2.65–2.62(t,2H),1.954(s,1H),1.61–1.53(m,4H),1.41–1.34(m,4H),1.18–1.16(m,12H).31P(CDCl3):δ147.ESI-MS(m/z)[1+H]+386.2,found:386.4.實(shí)施例2甲基丙烯基團(tuán)修飾的寡核苷酸分子的合成及純化寡核苷酸的合成及修飾，所用方法是亞磷酰胺固相合成法。基本原理是以CPG共價(jià)結(jié)合的核苷單體作為3’端，再經(jīng)過脫保護(hù)、活化、偶合、封閉、氧化五個(gè)不斷循環(huán)的步驟，不斷順序結(jié)合上所需序列的核苷單體，直至完成整個(gè)寡核苷酸鏈的合成。DNA合成與修飾完成后，將DNA捅入2mL的離心管中，再加入氨水甲胺混合液約0.5mL，并用封口膜封口置于65℃下加熱半小時(shí)，再用1mL槍頭吸取液體成分于2mL離心管中，再用酒精沉淀法(3MNaCl溶液約60μL，無水乙醇約1.25mL，并置于-20℃下保存約30min，以促進(jìn)其充分沉淀)，再用冷凍離心機(jī)在10℃、12000r/min下，離心5min，離心后去上清液，再加入200～400μL的0.1M的TEAA溶液(若是現(xiàn)配溶液需過膜除雜)，再振蕩、離心，再用0.45μm截留分子量的針頭膜過濾純化，之后再過HPLC分離純化，再真空抽干為固體，最后用乙酸約150μL于37℃孵育30min去除DMT(對苯二甲酸二甲酯)基團(tuán)，再真空抽干，再用排阻色譜或超濾離心去掉小分子雜質(zhì)(如乙酸)，再用紫外分光光度計(jì)定量DNA的純度和濃度，再放置于-20℃下保存?zhèn)溆谩＞唧w合成的序列見表1。表1實(shí)施例2中所用DNA序列實(shí)施例3鏈A和鏈B的聚合首先，將修飾有甲基丙烯基團(tuán)的鏈A和鏈B分別溶于超純水中配制成高濃度DNA儲存液；然后配制新鮮的10％的過硫酸銨和5％的TEMED，即0.05g過硫酸銨溶解至0.5ml超純水和25μLTEMED溶解于0.475mL超純水中；再將DNA與終濃度為4％的丙烯酰胺振蕩混勻，放入真空干燥器中抽真空除氣10min；再加入終濃度為1.4％的引發(fā)劑過硫酸銨和加速劑5％TEMED，混勻后將反應(yīng)體系置于真空干燥器中，37℃條件下抽真空反應(yīng)15min，從而得到鏈A和鏈B的線狀高分子聚合產(chǎn)物PS-A、PS-B；最后，用超濾離心管過濾掉示聚合或聚合不完全的反應(yīng)物，得到較純的PS-A、PS-B。實(shí)施例4可卡因便攜檢測新裝置的制作取一個(gè)200μL的PCR管，用打孔器在其管蓋上打一個(gè)直徑2mm的小圓孔，再用502膠水粘接上一小段1.5cm的短硅膠管，硅膠管伸入PCR管蓋的距離盡量短。再剪一段長硅膠管(長度可根據(jù)需要調(diào)節(jié))，用移液槍在長硅膠管一端注入5μL的色素染料，并用聚四氟乙烯管封住染料，再備用一把刻度尺，整個(gè)裝置即制備完畢。裝置如圖2-1,2-2,2-3所示。實(shí)施例5可卡因水凝膠PS-A、PS-B和Linker的比例優(yōu)化首先固定PS-A、PS-B的濃度均為110μM，嘗試以44μM、66μM、77μM、88μM的Linker鏈濃度分別成膠，并以500μM的可卡因作為解膠液，對比成膠解膠情況，結(jié)果如圖3所示。其中，圖3-1為解膠前各比例水凝膠的圖像結(jié)果，圖3-2為以500μM的可卡因作為解膠液進(jìn)行解膠后的圖像結(jié)果，表2為圖3-2各比例水凝膠解膠上清液的520nm吸收值。通過肉眼即可觀察得知，當(dāng)可卡因Linker鏈的濃度為77μM時(shí)，成膠與解膠的上清金納米顆粒顏色深淺差異最大，故選擇Linker鏈的濃度為77μM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成膠濃度。表2水凝膠解膠后上清吸收A520解膠后A5205:5:25:5:35:5:3.55:5:4實(shí)驗(yàn)0.1010.0460.0910.022Ctrl0.0980.0070.0030.003實(shí)施例6可卡因溶液檢測實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確配制5個(gè)可卡因濃度樣品，一一使用本裝置進(jìn)行檢測，并測量最終染料移動(dòng)距離。檢測結(jié)果如圖4所示，線性方程為y＝0.72x+4.7，R2＝0.98。實(shí)施例7可卡因檢測的選擇性實(shí)驗(yàn)同時(shí)為了驗(yàn)證裝置對可卡因的特異性檢測，選擇10倍于可卡因濃度的可卡因水解產(chǎn)物，進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出裝置對可卡因具有良好的選擇性，結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例8尿樣中可卡因檢測實(shí)驗(yàn)為嘗試裝置對尿液環(huán)境中可卡因檢測可行性，將尿液進(jìn)行預(yù)處理后，稀釋一倍，并在其中加入可卡因，配制成不同濃度點(diǎn)，而后利用新裝置進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示，線性方程為y＝0.69x+3.2，R2＝0.97，以3倍空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差比曲線斜率，得出檢測限為5.6μM。實(shí)施例9裝置檢測方法與LC/MS方法比較實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證本裝置的檢測準(zhǔn)確性，在尿液環(huán)境中配制相同8個(gè)可卡因濃度點(diǎn)分別用本裝置和標(biāo)準(zhǔn)LC/MS方法進(jìn)行檢測，最終比對結(jié)果如圖7所示，其線性方程為y＝0.997x-0.647，R2＝0.99，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。<110>廈門大學(xué)<120>一種基于距離變化信號輸出的可卡因便攜檢測裝置及方法<160>3<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<400>1ACTCATCTGTGAATCTCGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC56<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2AAAATCACAGATGAGT16<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>3AAAAGTCTCCCGAGAT16當(dāng)前第1頁1 2 3