本發(fā)明涉及光譜成像技術和光譜鑒別技術領域，尤其涉及一種用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)。

背景技術：

由于水體富營養(yǎng)化等原因，在海洋或者淡水水系中均會出現(xiàn)“赤潮”現(xiàn)象?！俺喑薄爆F(xiàn)象是指在特定的環(huán)境條件下，水體中某些浮游植物、原生動物或細菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象。赤潮生物釋放毒素赤潮生物釋放的毒素可引起海洋魚、蝦、貝等生物死亡，或使毒素富集在海產品中最終對攝食它們的其他動物包括人類產生毒害作用，此外赤潮生物大量消耗氧氣，造成水體溶解氧減少，也會使海洋生物因缺氧而大量死亡。作為赤潮形成的重要因素，藻類在水體中的繁殖情況備受關注。

然而，目前仍缺乏有限的研究工具和研究方法對水體中各種藻類的繁殖情況進行持續(xù)監(jiān)控。采用傳統(tǒng)顯微鏡對水體進行觀察雖然可以實現(xiàn)無損檢測，進而能夠持續(xù)監(jiān)控，但水體中藻類成分復雜，有些藻類的類別不能僅僅從形貌上進行分辨，也很難憑肉眼來統(tǒng)計水體中藻類個數(shù)。而采用化學標記的辦法盡管非常精確和便于統(tǒng)計，但是藻類自身及所處環(huán)境受到了嚴重干擾，甚至直接影響藻類的生長，故也不合適用于持續(xù)監(jiān)測水體中的藻類繁殖情況。

目前亟待開發(fā)一種能夠對水體中藻類繁殖情況進行持續(xù)準確監(jiān)測的設備和方法，這將有助于推動與赤潮相關的研究，為預防和控制赤潮的產生提供有力的支持。鑒于各種藻類各自的色素成分和組成物質有差別，因此其顏色或者自發(fā)熒光也有差別，可以通過光譜信息對藻類進行種類鑒別。

因此，現(xiàn)有技術存在缺陷，需要改進。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于克服本發(fā)明的主要目的在于克服傳統(tǒng)檢測手段和檢測方法無法滿足對水體中藻類繁殖情況進行準確和無損監(jiān)控的缺點，提出一種光譜鑒別技術與光譜成像技術結合的全新監(jiān)控系統(tǒng)，致力于推動赤潮相關研究的發(fā)展。

本發(fā)明公開了一種用于持續(xù)無干擾地監(jiān)控復雜水體環(huán)境中藻類種類和增殖情況的系統(tǒng)。通過對水體中的藻類進行顯微光譜成像，并通過獲取其每個藻類的光譜信息進行比較，從而對藻類類別進行鑒別，并進行計數(shù)。

本發(fā)明所述用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)通過以下的技術方案實現(xiàn)：

一種用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)，包括：照明光源、載物臺、顯微鏡、反射鏡、成像透鏡和成像器件；所述照明光源射出的光投射在載物臺上，再透過載物臺投射進顯微鏡中；從顯微鏡中投射出來的光經過反射鏡反射進入成像器件中。

進一步地，所述反射鏡為45°反射鏡，包括第一45°反射鏡和第二45°反射鏡；所述成像透鏡包括第一成像透鏡和第二成像透鏡；所述成像器件包括灰度成像透鏡和彩色成像透鏡；所述用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)還包括二向分色鏡和液晶濾波器件；

照明光源射出的光投射在載物臺上，再透過載物臺，從上至下穿過顯微鏡中，并投射在第一45°反射鏡上。第一45°反射鏡再將光線反射到45°半透半反鏡。反射到45°半透半反鏡上的光分為兩路，一路光被45°半透半反鏡反射后穿過第一成像透鏡射入彩色成像器件內；另一路光透過45°半透半反鏡后射在第二45°反射鏡上，經過第二45°反射鏡反射的光透過液晶濾波器件和第二成像透鏡后，最終投入灰度成像器件內。

進一步地，所述用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)還包括激發(fā)光系統(tǒng)、準直透鏡組以及二向分色鏡；

所述激發(fā)光系統(tǒng)發(fā)射的光透過準直透鏡組射在二向分色鏡上，再經過二向分色鏡反射由下至上射入顯微鏡中。照明光源射出的光投射在載物臺上，再透過載物臺，從上至下投射進顯微鏡中，并透過二向分色鏡投射在第一45°反射鏡上。第一45°反射鏡再將光線反射到45°半透半反鏡。反射到45°半透半反鏡上的光分為兩路，一路光被45°半透半反鏡反射后穿過第一成像透鏡射入彩色成像器件內；另一路光透過45°半透半反鏡后射在第二45°反射鏡上，經過第二45°反射鏡反射的光透過液晶濾波器件和第二成像透鏡后，最終投入灰度成像器件內。

優(yōu)選地，所述照明光源為寬光譜光源，所述照明光源為高壓氙燈或者鹵素燈。

優(yōu)選地，所述顯微物鏡為消色差無窮遠系統(tǒng)顯微物鏡。

優(yōu)選地，所述二向分色鏡需采用對短于激發(fā)光波長的光進行反射，對于長于激發(fā)光波長的光進行透射。

優(yōu)選地，所述的準直透鏡組有三個凸透鏡組成，激發(fā)光系統(tǒng)應位于前透鏡焦點處，前透鏡與中間透鏡的距離不限，中間透鏡與后透鏡焦距為f2和f3，則兩者距離為f2+f3，激發(fā)光通過該系統(tǒng)被放大的倍數(shù)為a＝f2/f3。

優(yōu)選地，所述液晶濾波器件對可見光波段(380-760nm)進行濾波調節(jié)；所述的激發(fā)光系統(tǒng)為短波長(波長<410nm)光源，所述的激發(fā)光系統(tǒng)的光源為紫外光燈、紫外ld以及紫外led；所述反射鏡反射的光的波段為可見光波段。

優(yōu)選地，所述的液晶濾波器的光譜分辨率達到1nm，能夠對第二反射鏡反射進來的信號光進行濾波，從而輸出單波長信號光并經過第二成像透鏡在灰度成像器件中成單波長下的灰度圖像。

優(yōu)選地，所述的灰色成像器件和彩色成像器件為ccd或cmos器件。

采用上述方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果：

1、本發(fā)明克服了傳統(tǒng)化學方法會干擾樣品及其周邊環(huán)境的缺點，實現(xiàn)了無損檢測，可以對水體中的藻類進行反復和持續(xù)的監(jiān)測。

2、本發(fā)明提供的系統(tǒng)及方法能夠獲得更多和更準確的樣品信息，相對于傳統(tǒng)顯微鏡，除了能獲得其形貌信息外，還能夠獲得每個藻體的光譜信息，并能夠直觀地將各種藻類的分布情況客觀的顯示在圖片上，實現(xiàn)對每一種藻類的準確統(tǒng)計。此外，傳統(tǒng)的化學方法雖然也能夠區(qū)分藻體種類并能對個數(shù)進行統(tǒng)計，但也無法獲得形貌信息，所獲取信息量遠低于本發(fā)明提供的系統(tǒng)及方法。

3、本發(fā)明提供的系統(tǒng)操作簡單，檢測準確快速，適用性強，對于自發(fā)熒光比較弱的藻類可采用透射光譜成像進行檢測，對于色素較少，透明度較高的藻類可以采用熒光光譜成像進行檢測，也可以分別采用這兩種方法對樣品進行檢測，獲得更多的信息和更高的準確率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的結構示意圖；

圖2為本發(fā)明的光譜信息提取過程示意圖；

圖3為本發(fā)明的操作流程圖；

圖4為本發(fā)明中實施案例的鑒別結果展示圖。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

參照圖1至圖4所示，本發(fā)明中用于持續(xù)無干擾地監(jiān)控復雜水體環(huán)境中藻類種類和增殖情況的顯微系統(tǒng)包括照明光源1、三維可調載物臺2、顯微物鏡3、二向分色鏡4、第一45°反射鏡5、45°半透半反鏡6、第二45°反射鏡7、液晶濾波器件8、第一成像透鏡9、第二成像透鏡10、灰度成像器件11、彩色成像器件12、激發(fā)光系統(tǒng)13以及準直透鏡組14。

激發(fā)光系統(tǒng)13發(fā)射的光透過準直透鏡組14射在二向分色鏡4上，再經過二向分色鏡4反射由下至上射入顯微鏡中。照明光源1射出的光投射在三維可調載物臺2上，再透過載物臺2上的樣本，從上至下投射進顯微鏡中，并透過二向分色鏡4投射在第一45°反射鏡5上。第一45°反射鏡5再將光線反射到45°半透半反鏡6。反射到45°半透半反鏡6上的光分為兩路，一路光被45°半透半反鏡6反射后穿過第一成像透鏡9射入彩色成像器件12內；另一路光透過45°半透半反鏡6后射在第二45°反射鏡7上，經過第二45°反射鏡7反射的光透過液晶濾波器件8和第二成像透鏡10后，最終投入灰度成像器件11內。

其中，所述的激發(fā)光系統(tǒng)13為短波長(波長<410nm)光源，所述的激發(fā)光系統(tǒng)13的光源為紫外光燈、紫外ld以及紫外led；所述反射鏡反射的光的波段為可見光波段。所述的準直透鏡組14有三個凸透鏡組成，激發(fā)光系統(tǒng)13應位于前透鏡焦點處，前透鏡與中間透鏡的距離不限，中間透鏡與后透鏡焦距為f2和f3，則兩者距離為f2+f3，激發(fā)光通過該系統(tǒng)被放大的倍數(shù)為a＝f2/f3。

所述照明光源1可以是高壓氙燈或者是鹵素燈等寬光譜光源，以便于用作透射光譜成像。所述顯微物鏡3需要采用消色差無窮遠系統(tǒng)顯微物鏡3，便于在光路中添加或者移除光學元件而不改變后續(xù)光路的成像面。所述的激發(fā)光系統(tǒng)13應該是短波長的藍紫光或者紫外光，如紫外激光器，紫外led或紫外燈等。所述二向分色鏡4需采用對短于激發(fā)光波長的光進行反射，對于長于激發(fā)光波長的光進行透射，由于樣品所發(fā)射的自發(fā)熒光的波長要比激發(fā)光系統(tǒng)13所發(fā)射的光波波長要長，因此二向分色鏡4可以隔絕激發(fā)光進入后續(xù)光路系統(tǒng)，進入對熒光信號產生干擾。

由于本發(fā)明所采用的透射光譜成像和熒光光譜成像都是在可見光范圍內，液晶濾波器件8應選用對可見光波段(400nm-700nm)進行濾波調節(jié)的。所述的液晶濾波器的光譜分辨率達到1nm，能夠對第二反射鏡反射進來的信號光進行濾波，從而輸出單波長信號光并經過第二成像透鏡10在灰度成像器件11中成單波長下的灰度圖像。系統(tǒng)中需要同時設置一個灰度成像器件11為灰度ccd或者coms相機，來配合液晶濾波器實現(xiàn)光譜成像，以及一個彩色成像器件12——彩色ccd或者coms相機，以獲得樣品真實顏色下的成像。

用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的方法，包括以下步驟：

1)采用一種用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)獲得樣本的光譜顯微圖像；

2)將光譜顯微圖像通過二值化處理去除背景，并進行邊緣檢測，從而獲得樣本的光譜信息；

3)將光譜信息進行提取、鑒別，并統(tǒng)計藻類個數(shù)。

其中，采用一種用于藻類鑒別和藻類增殖無損監(jiān)測情況的系統(tǒng)可獲得兩種光譜顯微圖像，一種是透射光譜成像，另一種是熒光光譜成像。

所述采用成像器件獲得樣本透射光譜成像的光譜顯微圖像的方法包括以下步驟：

1)將放在透明培養(yǎng)皿中的含水體的藻類樣本放置在系統(tǒng)的載物臺2上，開啟照明光源1、液晶濾波器件8和成像器件，照明光源1發(fā)出的光通過樣品后部分被吸收，形成帶有藻類樣本的信號光；

2)調節(jié)顯微物鏡3位置直至在灰度成像器件11和彩色成像器件12中均能觀察到清晰的成像，從而獲取透射光譜成像；

3)設置液晶濾波器件8濾波范圍和掃描精度，設置成像器件曝光時間，開啟連續(xù)掃描拍攝模式，獲取一段光波波長區(qū)間下的一系列光譜顯微圖像，該光譜顯微圖像為透射光譜成像。

當關閉激發(fā)光系統(tǒng)13，僅開啟白光照明系統(tǒng)，該照明光通過樣品后，部分被吸收，形成帶有吸收信息的信號光。此信號光被顯微物鏡3收集，通過二向分色鏡4、反射鏡和半透半反鏡后被分為兩路，一路經過成像透鏡在彩色成像器件12中形成彩色圖像。另一路信號光則被反射鏡反射，進入液晶濾波器。液晶濾波器通過以1nm的光譜分辨率進行掃描，每轉換一個濾波波長，通過成像透鏡和灰度成像器件11進行一次成像，直至掃描整個可見光波段，獲得每個波長下的灰度圖像，即透射光譜成像。

所述采用成像器件獲得樣本熒光光譜成像的光譜顯微圖像的方法包括以下步驟：

1)將放在透明培養(yǎng)皿中的含水體的藻類樣本放置在系統(tǒng)的載物臺2上，開啟激發(fā)光系統(tǒng)13、液晶濾波器件8和成像器件，照明光源1發(fā)出的光通過樣品后部分被吸收，形成帶有藻類樣本的信號光；

2)調節(jié)顯微物鏡3位置直至在灰度成像器件11和彩色成像器件12中均能觀察到清晰的成像，從而獲取透射光譜成像；

3)設置液晶濾波器件8濾波范圍和掃描精度，設置成像器件曝光時間，開啟連續(xù)掃描拍攝模式，獲取一段光波波長區(qū)間下的一系列光譜顯微圖像，該光譜顯微圖像為熒光光譜成像。

當關閉白光照明系統(tǒng)，僅開啟激發(fā)光系統(tǒng)13，激發(fā)光將通過二向分色鏡4反射至載物臺2上的樣品，并激發(fā)其自身的熒光，熒光信號被顯微物鏡3收集，通過二向分色鏡4，反射鏡和半透半反鏡后被分為兩路，一路經過成像透鏡在彩色成像器件12中形成彩色圖像。另一路信號光則被反射鏡反射，進入液晶濾波器。液晶濾波器通過以1nm的光譜分辨率進行掃描，每轉換一個濾波波長，通過成像透鏡和灰度成像器件11進行一次成像，直至掃描整個可見光波段，獲得每個波長下的灰度圖像，即熒光光譜成像。

在獲得樣品光譜顯微圖像后，還需要經過背景去除、邊沿檢測、光譜信息提取、光譜信息鑒別、數(shù)量統(tǒng)計等步驟后，最終實現(xiàn)藻類種類的鑒別和藻類個數(shù)的統(tǒng)計。

具體而言，背景去除是為了在獲取光譜顯微成像后將藻類和背景分開，因此，需要對圖像二值化處理并進行邊沿檢測。其中，二值化可采用otsu算法實現(xiàn)。所述將光譜顯微圖像通過二值化處理去除背景的方法包括以下步驟：

1)先統(tǒng)計整幅光譜顯微圖像的灰度值直方圖，再通過設置閾值將原圖像分成前景，背景兩個圖象；

2)將背景設為0灰度值，將樣品設為最高灰度值，從而將被測物與背景分離。

所述的邊沿檢測用于勾勒圖像中每個藻體的輪廓，并將輪廓中所有像素點歸為某一藻體的內部信息，從而可對每個藻體光譜信息進行合理提取，并可對藻體個數(shù)進行清點；所述的邊沿檢測以經過二值化后的圖像為基礎，通過背景與被測物之間的灰度差異進行邊沿判斷；所述邊沿檢測的方法包括：微分算子法、樣板匹配法、小波檢測法、神經網絡法。

將某一光波長下所拍攝的光譜圖像的像素點灰度值代表光強值，即可表示出該像素點在該波長下的透射或者熒光強度。一旦像素點選擇為某個藻體內部，就可以知道這個藻體在該波長下的透射或者熒光強度。通過掃描所有波長下的光譜圖像描繪波長與強度的光譜曲線，即可完成光譜信息提取。所述光譜信息提取的方法包括以下步驟：

1)提取目標像素點坐標，通過手動選擇數(shù)據(jù)光譜圖像對應的目標像素點的x軸和y軸坐標值，或者通過鼠標雙擊目標像素點，獲取該點處對應的x軸和y軸坐標值；

2)獲取目標像素點的坐標值后，讀取每一個波長下光譜圖片該坐標值處灰度值，該灰度值大小表示著該目標像素點處于該波長時的強度；

3)則在讀取完所有波長下圖片的該像素點灰度值數(shù)據(jù)后，以波長值為x軸，以灰度值為y軸可以描繪該像素點對應的光譜曲線；

所述的藻類鑒別方法是采用標準品的光譜曲線與目標測像素點的光譜曲線比較；所述目標像素點選擇位于藻類邊沿之內的像素點。

所述藻類的統(tǒng)計方法為對每個藻體進行種類鑒別后，在光譜顯微圖像中采用不同顏色對不同藻類進行標記，將位于藻類邊沿之內的像素點計為一個藻體，并標記為同一種顏色，并統(tǒng)計相同顏色藻體個數(shù)。

可采用比值法、神經網絡算法或者遺傳算法等方法對光譜信息進行鑒別進而對藻類進行鑒別。在鑒別出各個藻體的類別后，按照邊沿檢測結果，結合藻體類別，對各種類別的藻類進行數(shù)量統(tǒng)計，在長期監(jiān)控下變可研究各種藻類在水體中的繁殖情況。

實施例1

作為一種實施案例，本發(fā)明中采用小球藻和微綠球藻作為監(jiān)測樣本，在培養(yǎng)皿的水體中進行培養(yǎng)。這兩種藻類形貌相似，體積細小，難以采用常規(guī)的顯微鏡進行鑒別，且兩者所含熒光物質較少，因此本實施案例采用透光光譜成像方式進行測試。

本實施案例所選擇的照明光源1為高壓氙燈，采用cri公司生產的varispectm型液晶濾波器400-720nm進行濾波。此外，選擇對400nm以下波長高反(99.2％的反射率)并對400nm以上波長增透(99.8％的透過率)的二向分色鏡4?；叶瘸上衿骷?1和彩色成像器件12分別選擇灰度ccd和彩色ccd。

本實施案例中選擇的半透半反鏡對整個可見光波段(380nm～780nm)均半透半反，選擇的第一45°反射鏡和第二45°反射鏡均對整個可見光波段高反(99.8％的反射率)。

本實施案例為了獲得較大的觀測范圍，選擇放大倍數(shù)為20倍的無窮遠系統(tǒng)消色差顯微物鏡3。

本實施案例設置液晶濾波器件8的掃描范圍為450nm～700nm，掃描精度為2nm。設置彩色ccd曝光時間是0.5ms，灰度ccd曝光時間是3ms。

本實施案例采用550nm波長下所拍攝的光譜圖片以及otsu算法進行二值化處理，采用樣板匹配法進行邊沿檢測和勾勒，采并用比值法對光譜信息進行鑒別。

所述系統(tǒng)的運行機制如下：開啟照明光源1后，寬帶的照明光會穿過樣品被顯微物鏡3收集。在穿過樣品的過程中，因為藻類自身含有各種色素，所以部分照明光會被吸收，透射出來的光比進入樣品前的光有較大損耗，而不通過樣品僅僅從水體中透過的光則損耗較少。不同的藻類對不同波長的光有不同的吸收損耗，這些被吸收損耗后的光便帶上了信息量，即其光譜信息。

光通過顯微物鏡3及二向分色鏡4被45°反射鏡反射并通過半透半反鏡分別進入兩個成像光路，一路直接通過成像透鏡進行彩色成像，一路通過液晶濾波器件8濾波，僅讓某一波長光進入成像透鏡，并最終在灰度ccd內進行成像。由于灰度ccd每一次拍攝的都是某一波長下的圖片，則其圖片上各像素點的灰度值表示著該位置在該波長下顯示的強度。假設某波長的光譜圖片中無藻類背景灰度值是200，某樣品上的像素點對應灰度值為100，則可以計算出該像素點對該波長的吸收率[(200-100)/200]*100％＝50％，通過統(tǒng)計該像素點所有掃描波長下的吸收率或者透過率則可以描繪出該對點所代表的物質所對應的吸收或透射光譜曲線。由于不同藻類具有不同的光吸收特性，因此通過吸收曲線或者透射曲線則可以對其種類進行鑒別，并最終分別統(tǒng)計其數(shù)量。

本實施案例按照上述設置以及圖3所述流程即可獲得如圖4所述的鑒別結構圖像，本實施案例中以兩個偽灰度分別對兩類不同的藻體進行標記，在左圖中可以看到，從形貌無法鑒別兩者，但通過對比兩者光譜，可以進行鑒別，結果如右圖所示。在獲取鑒別結果后即可統(tǒng)計水體中各種藻類的個數(shù)。

綜上所述，本發(fā)明首次將光譜成像技術與藻類鑒別結合起來，根據(jù)藻類細小需要顯微系統(tǒng)進行成像，并需要通過光譜進行無損鑒別和計數(shù)的要求，提出了一種光譜顯微成像系統(tǒng)，并針對該系統(tǒng)所獲得數(shù)據(jù)提出了采用一種算法實現(xiàn)的、基于光譜信息比較的藻類種類鑒別和各種藻類個數(shù)統(tǒng)計的方法。

相對于采用傳統(tǒng)顯微鏡觀察藻類繁殖情況，本發(fā)明所采用的系統(tǒng)除了能夠獲取形貌信息外，還能獲得更為客觀的光譜信息。此外，本發(fā)明采用算法對觀察范圍內的藻類進行精密的個數(shù)統(tǒng)計，比通過顯微鏡觀察進而人工計數(shù)或者化學方法進行鑒別更為準確。通過本系統(tǒng)及相應方法，可以獲得藻類顯微成像、光譜成像、各種藻類光譜曲線以及各種藻類的個數(shù)及分布情況等豐富的信息量。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。