本發(fā)明涉及一種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物質(zhì)譜定量方法，進(jìn)一步說(shuō)是一種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物全同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜定量方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)維持各種生理功能的一類(lèi)重要的生物活性分子。它們的含量變化與許多神經(jīng)紊亂如抑郁、帕金森病、精神分裂癥等疾病密切相關(guān)。這類(lèi)物質(zhì)代謝主要涉及色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路和兒茶酚胺通路等。定量研究這類(lèi)物質(zhì)的組成及其含量變化對(duì)于神經(jīng)科學(xué)研究和臨床診斷具有極其重要的意義。目前主要采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)，該方法僅能對(duì)少數(shù)幾個(gè)濃度高的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，且通量低和定性定量準(zhǔn)確度差，因而限制了其臨床應(yīng)用和神經(jīng)科學(xué)研究的深度。高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其特異性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確和高通量等優(yōu)點(diǎn)而逐漸被生命科學(xué)研究、藥物研發(fā)和臨床等應(yīng)用，已成為定量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物尤其是兒茶酚胺類(lèi)代謝物因其高度親水性和熱不穩(wěn)定性，在反相色譜柱上具有保留極差的缺點(diǎn)，在電噴霧離子化時(shí)常常發(fā)生源內(nèi)降解，結(jié)果導(dǎo)致這些物質(zhì)的色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)難于檢測(cè)或定量準(zhǔn)確度非常差，且每次只能檢測(cè)少數(shù)幾個(gè)物質(zhì)，與實(shí)際應(yīng)用具有非常大的差距。

最近，韓國(guó)科學(xué)家采用hmds(hexamethyldisilazane)和mbhfba(n-methyl-bis-heptafluorobutyramide)這兩種衍生試劑分別對(duì)不同活性基團(tuán)進(jìn)行選擇性衍生，并采用gc-ms/ms(mrm模式)行檢測(cè)，成功地對(duì)該類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，具有特異性好和靈敏度高(定量限在ng/ml水平)等優(yōu)點(diǎn)(hongj.y.,j.chromatogr.b2013,940:94-103)。但是繁瑣的樣本純化步驟和衍生步驟，非常耗時(shí)。最近，科學(xué)家采用多種化學(xué)衍生法對(duì)該類(lèi)物質(zhì)的活性基團(tuán)如氨基、羧基和酚羥基進(jìn)行化學(xué)衍生，再行l(wèi)c-ms/ms(mrm模式)法檢測(cè)，有效地提高了待檢測(cè)物的熱穩(wěn)定性、色譜保留和檢測(cè)靈敏度。如中科院上海有機(jī)化學(xué)所采用dmmsp(4,6-dimethoxy-2-(methylsulfonyl)pyrimidine)對(duì)4個(gè)兒茶酚胺物質(zhì)的酚羥基進(jìn)行化學(xué)衍生，提高了熱穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度，但是存在衍生溫度高達(dá)70℃且衍生反應(yīng)結(jié)束后的衍生試劑清除復(fù)雜等缺點(diǎn)(高玉平等，中國(guó)化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28,1704-1708)。

grecos等采用sptpp(5-n-succinimidoxy-5-oxopentyl)triphenylphosphoniumbromide)對(duì)3個(gè)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的活性基團(tuán)氨基進(jìn)行化學(xué)衍生和高選擇性、高靈敏度和高通量分析(grecos.,analyticachimicaacta2013,771:65-72)。以上兩個(gè)衍生方法都存在僅能對(duì)一種活性基團(tuán)進(jìn)行衍生且無(wú)商業(yè)化可用的穩(wěn)定性同位素衍生試劑等缺點(diǎn)。最近，我們采用一種常見(jiàn)的紫外衍生反應(yīng)的苯甲酰氯反應(yīng)試劑——苯甲酰氯及同位素標(biāo)記的苯甲酰氯，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)活性基團(tuán)如氨基、亞氨基和酚羥基進(jìn)行衍生反應(yīng)，有效地提高了神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的熱穩(wěn)定性、色譜保留、檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)神經(jīng)地質(zhì)類(lèi)代謝物的高靈敏度質(zhì)譜檢測(cè)定量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物全同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜定量方法，解決現(xiàn)有的對(duì)色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路等神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關(guān)的多個(gè)化合物檢測(cè)定量存在靈敏度低和準(zhǔn)確度不高的問(wèn)題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物全同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜定量方法，該方法采用神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的苯甲酰氯的衍生產(chǎn)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)參照物，對(duì)生物樣本中神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)的定性定量分析測(cè)試，包括以下具體步驟：

(1)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的制備：取神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品母液兩份，干燥，分別向兩份干燥物中加入四硼酸鈉緩沖液，然后分別加入非標(biāo)記的苯甲酰氯和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯，進(jìn)行?；苌磻?yīng)，分別得到神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物，其中，同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的溶液作為內(nèi)標(biāo)母液，對(duì)該內(nèi)標(biāo)母液進(jìn)一步稀釋?zhuān)@得基準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和生物樣本的制備。

(2)質(zhì)譜定性定量方法的建立：采用流動(dòng)注射法分別對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記的苯甲酰氯衍生產(chǎn)物和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯衍生產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧離子化質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化,建立非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)條件；并將串聯(lián)四極桿質(zhì)譜與液相色譜儀聯(lián)用，采用反相液相色譜柱對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物和穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離，確定各物質(zhì)的色譜保留時(shí)間，建立神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的定性、定量檢測(cè)條件。

(3)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：對(duì)步驟(1)獲得的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑴c步驟(1)獲得的內(nèi)標(biāo)母液進(jìn)行混合；采用步驟(2)中建立的質(zhì)譜定性定量方法進(jìn)行檢測(cè)定量，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的各神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物與基準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液中與之對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的峰面積或峰高的豐度比值為縱坐標(biāo)，建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

(4)生物樣本的制備、檢測(cè)和定量：取生物樣本，采用直接或經(jīng)提取、干燥后再?gòu)?fù)溶后，加入四硼酸鈉緩沖液和非標(biāo)記的苯甲酰氯試劑，進(jìn)行衍生反應(yīng)，再加入基準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩，上清液用于檢測(cè)，檢測(cè)方法為步驟(2)建立和優(yōu)化的方法；分別計(jì)算各神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物及基準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)溶液中與之對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的峰面積或峰高的豐度比值，代入定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得到樣本中神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的含量。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(1)中的神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物指天然或人工合成的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路中所有代謝物或代謝中間物。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(1)和(4)的加入四硼酸鈉緩沖液，具體條件指四硼酸鈉緩沖液的濃度為10-200mm，體積為生物樣本體積或以毫克為單位的質(zhì)量的0.5-20倍。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(4)中的非標(biāo)記的苯甲酰氯試劑具體指為體積百分比0.1％至10％苯甲酰氯的乙腈溶液。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(1)和(2)中的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯是指碳13或氘原子標(biāo)記的苯甲酰氯。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：碳13標(biāo)記或氘原子標(biāo)記的苯甲酰氯是指含有2-6個(gè)碳13或1-5個(gè)氘原子的苯甲酰氯。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：碳13或氘原子標(biāo)記的苯甲酰氯具體為體積百分比0.1％至10％的乙腈溶液。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(1)和(4)的衍生反應(yīng)，具體條件指溫度為10-50℃，時(shí)間為5秒-5分鐘。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：生物樣本是指來(lái)自于人或動(dòng)物的腦脊液、脊髓液、血漿、血清、腦組織勻漿、尿液、細(xì)胞、濾紙干血片中的任一種。

本發(fā)明的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物全同位素內(nèi)標(biāo)定量檢測(cè)方法，是指對(duì)色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的串聯(lián)質(zhì)譜或者液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析中的內(nèi)標(biāo)采用色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)品與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的苯甲酰氯的衍生產(chǎn)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：本發(fā)明涉及的是一種生物樣本中與神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關(guān)的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的質(zhì)譜定量檢測(cè)分析方法，進(jìn)一步說(shuō)是一種以穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯試劑與這些化合物的化學(xué)衍生產(chǎn)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)參照物質(zhì)，以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，尤其是超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)模式為檢測(cè)手段，對(duì)生物樣本中這些化合物的衍生產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性定量分析的方法，該方法具有如下特點(diǎn)：(1)無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜的前處理如干燥和固相微萃取等；(2)無(wú)需對(duì)衍生后的衍生試劑進(jìn)行清除，可直接上機(jī)檢測(cè)，(3)反應(yīng)條件溫和(無(wú)需加熱)、快速；(4)衍生產(chǎn)物對(duì)光不敏感、常溫下較穩(wěn)定且不存在電噴霧離子源內(nèi)降解現(xiàn)象；(5)高特異性、高靈敏度(定量限在亞pg/ml水平)和定量準(zhǔn)確度高。該方法已在腦組織、血漿或血清、腦脊液、脊髓液和尿液等生物樣本定量檢測(cè)方面成功應(yīng)用。本發(fā)明方法將有助于顯著改善神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的檢測(cè)定量，具有可預(yù)期的臨床應(yīng)用前景，本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前科學(xué)研究和臨床需要，采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯和非標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品的衍生產(chǎn)物為定量?jī)?nèi)標(biāo)參照物，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)色氨酸代謝通路、γ-氨基丁酸和兒茶酚胺代謝通路中的神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)定量分析。

本發(fā)明不需要所有色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的穩(wěn)定性同位素標(biāo)準(zhǔn)品，僅需要普通(非同位素標(biāo)記)的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)品以及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯試劑。色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)品以及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯試劑在商業(yè)上可以獲得，而色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品目前僅能提供少數(shù)，且價(jià)格過(guò)于昂貴。因此，本方法提供的是一種定性定量準(zhǔn)確、高通量和花費(fèi)成本低的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路類(lèi)物質(zhì)的全同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜定量檢測(cè)分析方法。該方法可以用于多種生物樣本如干血紙片、血漿或血清、尿液、腦脊液、精液、細(xì)胞、肌肉、肝臟、脂肪和腎臟組織等色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的質(zhì)譜定量檢測(cè)分析，既適合于臨床疑似代謝病的篩選，也適于高端生命科學(xué)研究。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為以五羥色氨酸為例，說(shuō)明該方法的化學(xué)反應(yīng)原理圖(苯甲酰氯與帶酚羥基或氨基?；磻?yīng))。

圖2為生物樣本中神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)化合物的全同位素質(zhì)譜法定性定量分析流程示意圖。

圖3為色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的苯甲酰氯與d5-苯甲酰氯衍生物的uplc-ms/ms分析的提取離子色譜圖。

圖4為從小鼠腦組織可定性定量檢測(cè)到22種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物，代表性的提取離子色譜圖。

圖5為從人血漿中定性定量得到22種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物，代表性的提取離子色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例的目的是建立神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)化合物同位素試劑衍生法的uplc-ms/ms定量方法，如圖1-3所示。

配制色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)品的50％乙腈溶液(混合標(biāo)準(zhǔn)品母液)，稀釋?zhuān)?00微升稀釋液兩份，氮?dú)獯蹈?，分別加入30微升(范圍為20-50微升，以下范圍取值用此方法表示)濃度為100mm(50-200mm)四硼酸鈉緩沖液，接著分別加入30微升(20-50微升)的5％苯甲酰氯溶液(體積比)的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的衍生試劑和非標(biāo)記衍生試劑，30℃反應(yīng)25分鐘,分別得到色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的同位素標(biāo)記衍生產(chǎn)物和非標(biāo)記的衍生產(chǎn)物；氮?dú)獯蹈?，分別加入700微升(200-1000微升)80％乙腈水溶液(體積比)復(fù)溶，分別得到色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物與苯甲酰氯或d5-苯甲酰氯的酰化衍生產(chǎn)物。采用流動(dòng)注射法和absciex5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對(duì)以上獲得的?；苌a(chǎn)物進(jìn)行電噴霧離子化質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)如dp和ce值進(jìn)行優(yōu)化,建立mrm檢測(cè)條件，其中每個(gè)同位素衍生標(biāo)準(zhǔn)品的母離子(precursor)為非同位素衍生標(biāo)準(zhǔn)品的分子量加5，將各個(gè)色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的同位素標(biāo)記和非標(biāo)記的衍生產(chǎn)物的mrm條件輸入質(zhì)譜方法中，接上高效液相色譜儀，在無(wú)色譜柱分離的情況下，直接將經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣的衍生標(biāo)準(zhǔn)品引入質(zhì)譜離子源進(jìn)行離子化和mrm檢測(cè)，從而建立流動(dòng)注射法質(zhì)譜mrm檢測(cè)方法。

進(jìn)一步地，采用waters超高效液相色譜儀(uplc)并在色譜和質(zhì)譜間連接一根uplc色譜柱(watersacquityuplcbehc18色譜柱，1.7μm，2.1x100mm),對(duì)進(jìn)樣的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的苯甲酰氯和d5-苯甲酰氯衍生物同時(shí)進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜mrm檢測(cè)，建立色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的uplc-ms/ms檢測(cè)方法；代表性的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的苯甲酰氯與d5-苯甲酰氯衍生物的uplc-ms/ms分析的提取離子色譜圖如附圖3所示。

對(duì)色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的d5-苯甲酰氯衍生物母液進(jìn)行梯度稀釋1-1000倍，用以上建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，得到積分面積或峰高，以各濃度的積分面積或峰高與內(nèi)標(biāo)之比作為縱坐標(biāo)，以各濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果，所有色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍均為1-1000倍，r2值均大于0.99。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例的目的是采用建立的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的uplc-/ms/ms定量方法對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行半定量的分析，為科學(xué)研究提供重要的研究數(shù)據(jù)。

取神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品母液乙腈溶液，稀釋?zhuān)?0微升，氮?dú)獯蹈?，先加入四硼酸鈉緩沖液(預(yù)冷)100微升(50-200微升)，然后加入100微升(50-200微升)穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的衍生試劑d5-苯甲酰氯，進(jìn)行衍生反應(yīng)，50℃加熱處理30秒鐘，得到神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的同位素標(biāo)記衍生產(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物同位素標(biāo)記的衍生產(chǎn)物進(jìn)行稀釋15倍，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)母液。

取冷凍保存的腦組織勻漿樣本40微升，加入四硼酸鈉緩沖液(預(yù)冷)50微升(50-200微升)，置-60℃保存過(guò)夜，取出低溫(4℃)超聲破碎腦組織7分鐘，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，取60微升上清液，氮?dú)獯蹈?，向干燥殘?jiān)屑尤氡郊柞Ｂ鹊囊译嫒芤?0微升，50℃加熱處理30秒鐘，氮?dú)獯蹈?加入50微升內(nèi)標(biāo)母液復(fù)溶，低溫離心(4℃，16000g，15min)，上清液用于檢測(cè)；采用超高效液相色譜結(jié)合反相色譜柱分離(watersacquityuplchsst3色譜柱，1.7μm，2.1x100mm)，進(jìn)樣量2微升，洗脫物進(jìn)入串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行電噴霧離子化和mrm檢測(cè)分析。通過(guò)比較樣本中每個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯酰化衍生物與其相應(yīng)的d5-苯甲酰氯?；苌锏纳V保留時(shí)間和transition(母離子→子離子對(duì))進(jìn)行定性，通過(guò)計(jì)算它們的峰面積比進(jìn)行相對(duì)定量。

結(jié)果，從小鼠腦組織可定性定量檢測(cè)到22種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物，代表性的提取離子色譜圖如附圖4所示。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的目的是采用建立的色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物的uplc-/ms/ms定量方法對(duì)人血漿樣本進(jìn)行定量分析。

取神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品母液乙腈溶液60微升，先加入四硼酸鈉緩沖液100微升(50-200微升)，然后加入穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的衍生試劑¹³c6-苯甲酰氯，進(jìn)行?；苌磻?yīng)，10℃加熱處理30分鐘，得到神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的¹³c6-苯甲酰氯?；苌a(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物同位素標(biāo)記的衍生產(chǎn)物進(jìn)行稀釋15倍，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)母液。

取冷凍保存人血漿樣本，解凍，短時(shí)震蕩混勻，取30微升解凍血漿，加入四硼酸鈉緩沖液(預(yù)冷)70微升(50-200微升)，置-20℃保持20分鐘，取出，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，上清液用氮?dú)獯蹈?。向干燥殘?jiān)屑尤氡郊柞Ｂ鹊囊译嫒芤?5微升，10℃加熱處理30分鐘，氮?dú)獯蹈?加入60微升內(nèi)標(biāo)溶液復(fù)溶，低溫離心(4℃，16000g，15min)，上清液用于檢測(cè)。采用超高效液相色譜結(jié)合反相色譜柱分離(watersacquityuplcbehc18色譜柱，1.7μm，2.1x100mm)，進(jìn)樣量3微升(2-5微升)，洗脫物進(jìn)入串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行電噴霧離子化和mrm檢測(cè)分析。通過(guò)比較樣本中每個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記衍生物與其相應(yīng)的¹³c6標(biāo)記的苯甲酰氯?；苌锏纳V保留時(shí)間和transition(母離子→子離子對(duì))進(jìn)行定性，進(jìn)一步計(jì)算每個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物的非標(biāo)記苯甲酰氯?；苌锱c其相應(yīng)的¹³c6標(biāo)記的¹³c6-苯甲酰氯酰化衍生物的峰面積比，采用定量校正曲線(xiàn)進(jìn)行相對(duì)定量，最終得到人血漿中的神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物及其濃度。

結(jié)果，采用該方法從人血漿中定性定量得到22種神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物，代表性的提取離子色譜圖如附圖5所示。

本發(fā)明是一種新的同時(shí)對(duì)生物樣本中色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝物進(jìn)行全同位素衍生內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜定量方法，所述的方法是指：采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯試劑與該類(lèi)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)衍生反應(yīng)產(chǎn)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，以液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜為檢測(cè)手段的神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)代謝化合物的全同位素衍生內(nèi)標(biāo)定量法。

本發(fā)明具有樣本制備簡(jiǎn)單、定性定量準(zhǔn)確、高通量和花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)，具有可預(yù)期的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的方法彌補(bǔ)了當(dāng)前該類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝化合物測(cè)試定性定量準(zhǔn)確度低、成本高以及僅能同時(shí)對(duì)幾個(gè)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)分析等低通量缺點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是提供一種以色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路化合物標(biāo)準(zhǔn)品與穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的苯甲酰氯的衍生反應(yīng)產(chǎn)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，從而顯著性提供流動(dòng)注射-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜或液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜定性定量分析生物樣本中色氨酸通路、γ-氨基丁酸通路、兒茶酚胺通路中重要化合物的準(zhǔn)確性。該分析方法具有定性定量準(zhǔn)確、高通量和花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)，將有助于改善科學(xué)研究和臨床檢測(cè)水平。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。