衍生化HPLC?DAD法測定藥物或其合成中間體中酰氯的方法與流程
本發(fā)明屬于藥品分析檢測領域，涉及一種衍生化hplc-dad法測定酰氯的方法，尤其涉及衍生化hplc-dad法測定藥物或其合成中間體中酰氯的方法。
背景技術：
近幾年來，藥物中的基因毒性雜質(genotoxicimpurities，gtis)由于對人類存在潛在的致癌性而受到廣泛重視，需要將其控制在一個安全水平[1]。氣相色譜法(gc)、高效液相色譜法(hplc)或者毛細管電泳色譜法(ce)法與質譜(ms)聯用技術在基因毒性雜質分析中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。有些分析策略如化學衍生化[4]可以提高分析物的可檢測性，或者實驗的設計(doe)[5]可以協(xié)助進行方法條件的系統(tǒng)優(yōu)化。酰氯是藥物合成中重要的?；噭?sup>[6-12]。例如，乙酰氯和2-氯丙酰氯是可用于合成布洛芬；氯乙酰氯常用于他達拉非的制備；5-氯噻吩-2-甲酰氯是合成利伐沙班的重要中間體等。盡管有文獻質疑酰氯引起基因突變的可能性[13]，但是監(jiān)管機構對藥物中殘留酰氯的監(jiān)測仍然十分重視[14]。因此需要建立一種專屬性強、靈敏度高的方法對藥物中的這類雜質進行監(jiān)控。
一般來說，由于酰氯非?；顫姡苯佑胔plc法或gc法分析往往會產生錯誤的結果。因此常采用衍生化方法用于檢測酰氯。水是檢測酰氯常用的衍生化試劑之一，酰氯和水衍生化后產物通過ce[14]或者hplc-ms[15]進行分析，但是水解法不能區(qū)分酰氯和藥物本身存在的相應的羧酸，導致測定的結果偏高[16]。文獻也曾報道用gc-ms[17]或者gc-fid[18]法對酰氯進行甲醇衍生化后檢測，但是該方法常常會受到水分的競爭，并且反應速率慢，需要催化劑。而且這兩種方法在非質子性溶劑中的回收率都比較差[16]。酰氯和堿性化合物的反應速率高于酰氯和水或者醇類的反應速率，氨基或肼基為常見的堿性基團，申請人嘗試選擇含有此兩種基團的化合物進行衍生化測定。
在各種分離分析方法中，hplc-dad方法因其簡單實用而成為了大多數實驗室的首選方法，但是由于大多數藥物及其合成中間體有較強的紫外吸收，因此專屬性不足是該法的主要缺陷。申請人通過對氨基取代化合物或肼基取代化合物與酰氯衍生化產物的紫外吸收光譜比較，發(fā)現硝基苯肼類衍生化試劑與酰氯衍生化反應后生成的產物可以避免藥物及其合成中間體的基質干擾，進一步通過衍生化條件優(yōu)化，發(fā)明了一種衍生化hplc-dad法測定藥物或其合成中間體中酰氯的方法。
技術實現要素：
本發(fā)明的不足是針對現有技術的不足，提供衍生化hplc-dad法測定酰氯的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供衍生化hplc-dad法測定藥物或其合成中間體中酰氯的方法。
本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現：
衍生化hplc-dad法測定酰氯的方法，包含以下步驟：
(1)、在室溫下，使用硝基苯肼衍生化試劑對酰氯衍生化生成在紫外可見光區(qū)(320～450nm)內有較強吸收的產物；
(2)、以步驟(1)中衍生化反應產物，利用hplc反相分配色譜法在紫外可見光區(qū)(320～450nm)測定其中酰氯的衍生化產物，從而實現對酰氯的定性或定量檢測。
優(yōu)選的，所述的衍生化hplc-dad法測定酰氯的方法，包含以下步驟：
(1)、在常溫下，以乙腈為反應體系，使用硝基苯肼類衍生化試劑對酰氯衍生化反應生成在紫外可見光區(qū)(330～420nm)有較強的吸收的產物；
(2)、以步驟(1)中衍生化反應產物，利用hplc-dad法，基于反相分配色譜法原理在紫外可見光區(qū)(330～420nm)測定其中酰氯的衍生化產物，從而實現對酰氯的定性或定量檢測。
所述的酰氯包括脂肪族酰氯或芳香族酰氯，如
r優(yōu)選為取代或未取代的c1～c4烷基、含有s、n、o的取代或未取代的五元或六元雜環(huán)、取代或未取代的苯甲酰氯；c1～c4烷基的取代基為鹵素如氯、溴；五元或六元雜環(huán)、苯甲酰氯的取代基為氯、溴、硝基、氨基、取代或未取代的c1～c6烷基、取代或未取代的c1～c4烷氧基，烷基或烷氧基的取代基為鹵素。
所述的酰氯進一步優(yōu)選自乙酰氯、氯乙酰氯、2-氯丙酰氯、異丁酰氯、苯甲酰氯和5-氯噻吩-2-甲酰氯中的任意一種。
硝基苯肼類衍生化試劑優(yōu)選自2-硝基苯肼、3-硝基苯肼、4-硝基苯肼、2，3-二硝基苯肼、2，4-二硝基苯肼、3，4-二硝基苯肼中的任意一種，優(yōu)選為2-硝基苯肼。
進一步優(yōu)選的，衍生化反應的條件：以乙腈為反應體系，2-硝基苯肼與總酰氯的摩爾比為1.45:1～145:1，反應0.5～3h；優(yōu)選以乙腈為反應體系，2-硝基苯肼與總酰氯的摩爾比為14.5:1，反應時間為0.5h。
優(yōu)選的，所述的hplc-dad法：采用hplc色譜儀；采用反相分配色譜法；以非極性鍵合相為固定相，采用極性流動相，檢測波長位于320～450nm之間，進一步優(yōu)選位于330～420nm之間，更進一步優(yōu)選位于390～400nm之間。
更進一步優(yōu)選的，所述的hplc-dad法使用的儀器為shimadzulc20at液相色譜儀，該色譜儀配置有在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、dad檢測器和lc-solution色譜工作站；色譜柱采用250mm×4.6mm，5μm的迪馬科技公司的diamonsiltmc18柱；進樣量：20μl；流動相流速：1.0ml/min；流動相梯度：a相為乙腈，b相為0.1％磷酸，0min30％a相，5min40％a相，10min40％a相，15min60％a相，20min60％a相，22min70％a相，25min70％a相；柱溫：30℃；檢測波長：395nm。
本發(fā)明所述的方法用于多種樣品中酰氯的定性與定量檢測，優(yōu)選在測定藥物及其合成中間體中酰氯的應用。
衍生化hplc-dad法測定藥物及其合成中間體中酰氯的方法，包含以下步驟：
(1)、室溫下，使用硝基苯肼類衍生化試劑進行衍生化反應0.5～3h，反應液作為樣品進樣測定；
(2)、以步驟(1)中衍生化反應結束后的反應液作為進樣樣品，利用hplc-dad法在320-450nm測定其中酰氯的衍生化產物，從而實現對藥物中酰氯的定性或定量檢測。
所述的酰氯包括脂肪族酰氯或芳香族酰氯，如
r優(yōu)選為取代或未取代的c1～c4烷基、含有s、n、o的取代或未取代的五元或六元雜環(huán)、取代或未取代的苯甲酰氯；c1～c4烷基的取代基為鹵素如氯、溴；五元或六元雜環(huán)、苯甲酰氯的取代基為氯、溴、硝基、氨基、取代或未取代的c1～c6烷基、取代或未取代的c1～c4烷氧基，烷基或烷氧基的取代基為鹵素。
所述的酰氯進一步優(yōu)選自乙酰氯、氯乙酰氯、2-氯丙酰氯、異丁酰氯、苯甲酰氯和5-氯噻吩-2-甲酰氯中的任意一種。
硝基苯肼類衍生化試劑優(yōu)選自2-硝基苯肼、3-硝基苯肼、4-硝基苯肼、2，3-二硝基苯肼、2，4-二硝基苯肼、3，4-二硝基苯肼中的任意一種，優(yōu)選為2-硝基苯肼。
進一步優(yōu)選的，衍生化反應的條件：其特征在于以乙腈為反應體系，2-硝基苯肼濃度為0.01～1mg/ml，反應0.5～3h；優(yōu)選以乙腈為反應體系，2-硝基苯肼濃度為100μg/ml，反應時間為0.5h。
優(yōu)選的，所述的hplc-dad法：采用hplc色譜儀；采用反相分配色譜法；以非極性鍵合相為固定相，采用極性流動相，檢測波長位于320～450nm之間，進一步優(yōu)選位于330～420nm之間，更進一步優(yōu)選位于390～400nm之間。
更進一步優(yōu)選的，所述的hplc-dad法使用的儀器為shimadzulc20at液相色譜儀，該色譜儀配置有在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、dad檢測器和lc-solution色譜工作站；色譜柱采用250mm×4.6mm，5μm的迪馬科技公司的diamonsiltmc18柱；進樣量：20μl；流動相流速：1.0ml/min；流動相梯度：a相為乙腈，b相為0.1％磷酸，0min30％a相，5min40％a相，10min40％a相，15min60％a相，20min60％a相，22min70％a相，25min70％a相；柱溫：30℃；檢測波長：395nm。
所述的藥物及其合成中間體優(yōu)選為布洛芬、他達拉非、利伐沙班、酮洛芬、辛伐他汀和維拉佐酮，但不局限于上述化合物。
本發(fā)明所述的室溫是指常規(guī)的分析實驗進行的溫度，通常為20～30℃之間均可。
本發(fā)明的有益效果：
大多數藥物及其雜質在近可見光區(qū)紫外吸收很弱，本發(fā)明基于硝基苯肼的酰氯衍生化產物由于苯環(huán)上硝基吸電子基團的存在，因此紫外吸收帶回產生明顯的紅移效應、可以避免藥物及其合成中間體的基質干擾，建立了一種簡單、通用的柱前衍生化hplc-dad測定酰氯的方法。方法學驗證的結果顯示藥物中的本身含有的羧酸和雜質不會對分析造成干擾，表明該方法專屬性良好。此外，方法的檢測限為0.01-0.03μg/ml,定量限為0.03-0.08μg/ml，線性關系良好(r>0.999)；進樣精密度小于0.97％；平均回收率在87.8-114.1％之間(rsd<3.36％)，無明顯的基質干擾；且衍生化產物在8h內穩(wěn)定性良好。
針對衍生化條件優(yōu)化的過程中出現的2-氯丙酰氯未出峰，創(chuàng)造性地的發(fā)現，當2-硝基苯肼濃度過高時，酰氯的衍生化產物可能發(fā)生降解。基于此發(fā)現，對衍生化試劑與總酰氯的摩爾比進行了優(yōu)化，不僅能確保酰氯被完全衍生化，還能有效避免產物的降解。
附圖說明
圖1為分別以苯胺(a)、2-硝基苯胺(b)、4-硝基苯胺(c)、苯肼(d)、2-硝基苯肼(e)和4-硝基苯肼鹽酸鹽(f)作為衍生化試劑與異丁酰氯反應生成產物的紫外吸收光譜圖。衍生化試劑的濃度均為100μg/ml。
圖2為用酮洛芬(2mg/ml)與2-硝基苯肼(100μg/ml)衍生化反應得到的色譜圖(a-e代表不同檢測波長)：a.224nm,b.274nm,c.314nm,d.356nm,e.395nm。(imp1-7代表酮洛芬原料藥中所含的未知內源性雜質)。
圖3為反應條件對酰氯衍生化的影響：(a)2-硝基苯肼/總酰氯的摩爾比對衍生化反應效率的影響；(b)反應溫度對衍生化反應效率的影響；(c)反應時間對衍生化反應效率的影響；(d)1％(v/v)含量的水、甲醇和乙醇對衍生化反應效率的影響。衍生化反應效率通過歸一化的峰面積表示，歸一化峰面積是以每個衍生化反應參數優(yōu)化實驗下的最大峰面積為100％對照，其它峰面積與最大峰面積的比值稱為歸一化峰面積。乙酰氯的濃度是0.5μg/ml，其余酰氯的濃度均為1μg/ml。
圖4為相同條件下空白溶液(2-nph)(a)、乙酸(b)、氯乙酸(c)、異丁酸(d)、2-氯丙酸(e)、苯甲酸(f)和5-氯噻吩-2-甲酸(g)以及6種脂肪族和芳香族酰氯(h)衍生化產物的色譜圖：(1)乙酰氯衍生物；(2)氯乙酰氯衍生物；(3)異丁酰氯衍生物；(4)2-氯丙酰氯衍生物；(5)苯甲酰氯衍生物；(6)5-氯噻吩-2-甲酰氯衍生物。羧酸的濃度均為10μg/ml。
圖5為混合酰氯(1μg/ml)在同一藥物中與2-硝基苯肼(100μg/ml)發(fā)生衍生化反應后的色譜圖(a-f代表不同的藥物)：布洛芬(a)、他達拉非(b)、辛伐他汀(c)、酮洛芬(d)、利伐沙班(e)和維拉佐酮(f)；六種脂肪族和芳香族酰氯的衍生化產物：(1)乙酰氯衍生物；(2)氯乙酰氯衍生物；(3)異丁酰氯衍生物；(4)2-氯丙酰氯衍生物；(5)苯甲酰氯衍生物；(6)5-氯噻吩-2-甲酰氯衍生物。
具體實施方式
1.1.儀器
shimadzulc20at液相色譜儀(含在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、dad檢測器和lc-solution色譜工作站)；aglient6520lc-tof液相色譜串聯質譜儀(含在線真空脫氣機、高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、dad檢測器、mettlertoledoab135-s分析天平(梅特勒瑞典公司)；sartoriousbs110分析天平(北京賽多利斯有限公司)。
1.2.試劑
乙酰氯(98％)、氯乙酰氯(97％)、2-氯丙酰氯(97％)、苯甲酰氯(98％)、異丁酰氯(98％)和5-氯噻吩-2-甲酰氯(97％)；苯胺(99.5％)、苯肼(98.0％)、2-硝基苯胺(98.5％)、4-硝基苯胺(99.5％)、2-硝基苯肼(97％)和4-硝基苯肼鹽酸鹽(97％)；布洛芬(98％)、他達拉非(97％)、利伐沙班(99％)、酮洛芬(98％)、辛伐他汀(98％)和維拉佐酮(99.5％)。
純化水，乙腈(tedia，色譜純)、磷酸(分析純)。
1.3.溶液的制備
各種酰氯的儲備液：取各酰氯約10mg酰氯，精密稱定，置于10ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度線，搖勻即可。各儲備液室溫下8h內穩(wěn)定性良好。
苯胺、2-硝基苯胺(2-na)、4-硝基苯胺(4-na)、苯肼、2-硝基苯肼(2-nph)和4-硝基苯肼鹽酸鹽(4-nph·hcl)試液：取各試劑約20mg，精密稱定，置于10ml量瓶中，用純乙腈稀釋至刻度，搖勻即可。
1.4.衍生化實驗條件
精密移取100μl的酰氯母液，置于10ml量瓶中，分別加入500μl衍生化試劑加乙腈稀釋至刻度，搖勻。室溫下反應1h后，取20μl直接進樣。
實施例1
以異丁酰氯為代表，用相同濃度的苯胺、2-硝基苯胺、4-硝基苯胺、苯肼、2-硝基苯肼、4-硝基苯肼衍生化試劑對其進行衍生化。衍生化實驗條件見1.4。在相同的色譜條件下，用dad掃描各衍生化產物，記錄產物的光譜圖和色譜圖，以產物的最大吸收波長和吸收強度來評價衍生化試劑的優(yōu)劣。
圖1a顯示苯胺及其異丁酰氯的衍生化產物最大紫外吸收波長分別是234nm和241nm。而2-硝基苯胺和4-硝基苯胺的最大吸收波長紅移至408nm(圖1b)和374nm(圖1c)。但是它們各自的異丁酰氯衍生化產物峰因削弱了共軛效應而使吸收波長發(fā)生了藍移且吸收強度變小。
圖1d顯示苯肼及其異丁酰氯衍生化產物分別在224nm和233nm處有最大紫外吸收波長。而2-硝基苯肼和4-硝基苯肼分別在383nm(圖1e)和337nm(圖1f)處有很好的吸收強度，而且與異丁酰氯發(fā)生衍生化后產物的最大吸收波長和吸收強度均略有增加。本實驗理想的情況是在近可見光區(qū)(>380nm)處進行測定，如此可以使藥物及其內源性雜質產生的基質干擾降到最低，從而提高方法的專屬性。從圖1的衍生化產物的最大吸收波長和吸收強度來看，硝基苯肼類衍生物符合上述要求，特別以2-硝基苯肼最為合適。
在實際測樣中，由于大量藥物基底的存在，對微量的酰氯衍生化產物而言影響較大，若推廣使用則每個藥物都要建立一個色譜條件去分離藥物和雜質，干擾多，靈敏度低(基線噪音大)。而使用2-硝基苯肼作為衍生化試劑時，由于大多數藥物及其雜質在近可見光區(qū)(>380nm)紫外吸收很弱，所以在此波長處進行測定可以大大提高方法的專屬性。例如用2-硝基苯肼對一定量的酮洛芬進行衍生化，并采用dad記錄不同檢測波長下的色譜圖時(圖2)發(fā)現，相比于其他較短波長，395nm波長檢測下的色譜圖能夠提供更為平衡的基線和較少的雜質吸收峰，從而改善了方法的專屬性。這一事實作為2-硝基苯肼重要的優(yōu)勢在其他藥物上也有體現。
實施例2
供試品溶液制備：精密稱取藥物適量，置于10ml量瓶中，加入500μl衍生化試劑，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫下反應0.5h，即得供試品溶液。取20μl直接進樣。
對照品溶液制備：精密移取100μl不同濃度酰氯儲備液，置于10ml量瓶中，加入500μl衍生化試劑，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫下反應0.5h，即得對照品溶液。取20μl直接進樣。
色譜條件：shimadzulc20at液相色譜儀(含在線真空脫氣機、二元梯度泵，自動進樣器、柱溫箱、dad檢測器和lc-solution色譜工作站)；色譜柱：迪馬科技公司的diamonsiltmc18(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：乙腈(a相)-0.1％磷酸(b相)，梯度洗脫見表1，流速：1.0ml/min；進樣量：20μl；柱溫：30℃；檢測波長：395nm。
表1.梯度洗脫程序
標準曲線繪制方法：分別精密移取各對照品儲備液適量置于同一只10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成混合標準品系列濃度溶液。按1.4.項下方法進行衍生化，取20μl注入液相色譜儀，測定各衍生化產物的峰面積。以酰氯濃度c(μg/ml)為橫坐標，衍生化產物峰面積(a)為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關系數。
定量方法：采用外標法進行定量。
實施例3
為了確保衍生化快速反應完全，同時避免產物降解，需要對體系中的衍生化試劑的濃度、反應時間和反應溫度進行考察。同時，因為水、甲醇或者乙醇的存在會與2-硝基苯肼競爭酰氯，所以需要對反應體系中這三種試劑的含量進行考察。以生成的衍生化產物的歸一化峰面積為指標，單因素考察了2-nph/總酰氯的不同摩爾比(1.45、2.90、7.24、14.5、29.0、72.4、145.0)、不同的反應溫度(25、40、60、80℃)、不同的反應時間(15、30、60、90、120、180min)和1％含量的水、甲醇或者乙醇對衍生化反應效率的影響。具體結果見圖3。
由圖3a可知，衍生化產物的峰面積隨著衍生化試劑濃度的增加而增大，直到2-硝基苯肼濃度為100μg/ml(相當于摩爾比為14.5：1)時達到最大值，當2-硝基苯肼濃度過高時，酰氯的衍生化產物可能發(fā)生降解，所以我們最終選擇了100μg/ml2-硝基苯肼繼續(xù)后面的研究。由圖3b可知，增大反應溫度對衍生化產物峰面積沒有太大影響，說明室溫下該衍生化反應就能快速進行。由3c可知30min的反應時間就足以使衍生化反應完全。由圖3d可知，1％(v/v)的水、甲醇或者乙醇對衍生化反應沒有干擾。
實施例4
按實施例2的方法，對乙酰氯、氯乙酰氯、異丁酰氯、2-氯丙酰氯、苯甲酰氯和5-氯噻吩-2-甲酰氯進行考察。如圖4可知，在上述色譜條件下，6種衍生化試劑產物和衍生化試劑之間分離度較好、考慮到藥物中可能存在的對應酰氯的內源性羧酸(乙酸、氯乙酸、異丁酸、2-氯丙酸、苯甲酸和5-氯噻吩-2-甲酸)可能會與2-硝基苯肼發(fā)生反應，所以本實驗在相同的條件下對這六種羧酸進行考察，研究其在相同的反應條件下會不會和衍生化反應產生相同的衍生化產物。結果如圖4所示，由于相同反應條件下羧酸和2-硝基苯肼的反應惰性，在吸收波長為395nm處沒有觀察到羧酸的衍生化產物峰。說明該方法專屬性良好。
實施例5
考察該方法在相同的藥物中辨別不同酰氯的能力。需要根據藥物在乙腈中的溶解度，精密稱取適量的藥物，置于10ml量瓶中，加入500μl衍生化試劑，再加入相同濃度的混合酰氯溶液(1μg/ml)，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫下反應0.5h。取20μl直接進樣。結果如圖5所示，說明該方法在相同的藥物基質中辨別不同酰氯的能力良好。
實施例6方法學驗證與應用
6.1.專屬性
專屬性主要考察酰氯羧對應的羧酸(乙酸、氯乙酸、異丁酸、2-氯丙酸、苯甲酸和5-氯噻吩-2-甲酸)會不會與2-硝基苯肼生成的相同的目標衍生物。結果如圖4，由于羧酸和2-nph的反應惰性，在吸收波長為395nm處沒有觀察到羧酸的衍生化產物峰。說明該方法專屬性良好。
6.2.線性與范圍
分別精密移取各酰氯儲備液適量置于同一只10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成混合標準品系列濃度溶液。按1.4.項下方法進行衍生化，取20μl注入液相色譜儀，測定各衍生化產物的峰面積。以酰氯濃度c(μg/ml)為橫坐標，衍生化產物峰面積(a)為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸分析，計算線性回歸方程及相關系數。結果顯示，乙酰氯的線性范圍為0.03-0.3μg/ml，氯乙酰氯和異丁酰氯的線性范圍均為0.05-0.5μg/ml，2-氯丙酰氯和苯甲酰氯的線性范圍為0.06-0.6μg/ml，5-氯噻吩-2-甲酰氯的線性范圍為0.08-0.8μg/ml。且各待測物線性關系良好(r>0.999)。結果見表2。
6.3.檢測限與定量限
以信噪比3:1為方法的檢測限，以信噪比10:1為方法的定量限。結果顯示，6種鹵代羧酸的檢測限在0.01-.03μg/ml之間，定量限在0.03-0.08μg/ml之間。具體見表2。
6.3.進樣精密度試驗
按6.2.項下方法配制100％限度水平(0.18-0.48μg/ml)混合標準溶液，取100μl上述溶液，置于10ml容量瓶中，按照1.4項下方法加入衍生化試劑進行前處理后，重復進樣6次，以衍生化生成物峰面積計算rsd值。由表2可知，此方法的進樣精密度良好，rsd在0.38-0.90％之間。
6.5.衍生物穩(wěn)定性
按6.2.項下方法配制100％限度水平(0.18～0.48μg/ml)混合標準溶液，取100μl上述溶液，置于10ml容量瓶中，按照1.4項下方法加入衍生化試劑進行前處理后，分別在室溫下放置0、1、2、4、6、8h時進行測定，以待測物峰面積的變化考察衍生物的穩(wěn)定性。由表2可知，衍生化產物室溫放置時，在0-8h內峰面積的rsd小于0.97％，即穩(wěn)定性良好。
表2.方法學試驗結果
x-待測物的濃度(μg/ml)，y-峰面積,r–回歸方程的相關系數
6.6.加樣回收率
為了評價該方法的準確性，我們分別計算了各酰氯的加樣回收率。涉及的藥物括布洛芬(4mg/ml)、他達拉非(6mg/ml)、維拉佐酮(1mg/ml)、辛伐他汀(1mg/ml)、酮洛芬(2mg/ml)、利伐他班(2mg/ml)。
回收率對照溶液：按6.2.項下方法配制loqs，6loqs和10loqs混合標準溶液不加藥物本底，按1.4.項下方法進行衍生化，過濾后取20μl進樣。每個濃度水平3份。
回收率樣品溶液：精密稱取適量各藥物本底，置于10ml量瓶中，分別加入合成中相應使用的三個限度水平(loq，6loq和10loq)單一標準品溶液，按照同樣的方法衍生化，過濾后取20μl進樣。每個濃度水平3份。
加樣回收率＝(樣品峰面積—本底峰面積)/對照品峰面積×100％。
并計算各個濃度水平加樣回收率的平均值和rsd。
由表3可知，各酰氯的加樣回收率均在87.8-114.1％之間，且rsd均小于3.36％。
表3.該方法的加樣回收率.
實施例7
將所建立的方法應用到藥物中殘留酰氯的檢測。精密稱取各藥物適量，分別置于10ml量瓶中，加入500μl2-硝基苯肼，用乙腈定容，室溫下反應0.5h后，取20μl進樣，觀察是否有酰氯衍生化產物峰。
結果表明，六種純化的藥物中均未檢測出相應的酰氯，但此方法仍然在醫(yī)藥工業(yè)中對殘留酰氯的檢測有重要的應用。
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