本發(fā)明涉及中藥材質(zhì)量檢測領(lǐng)域，具體涉及七葉一枝花的鑒定方法。

背景技術(shù)：

七葉一枝花為百合科植物p.polyphyllasmithvar.chinensis(franch.)hara.的干燥根莖，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定以重樓皂苷為其質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，它與云南重樓均被藥典規(guī)定為重樓的正規(guī)來源。重樓甾體皂苷是重樓的主要活性成分，具有抗腫瘤、消炎、止血、抗菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成、保護肝臟與腎臟作用。

云南白藥集團、四川光大制藥有限公司和通化萬通藥業(yè)股份有限公司等相關(guān)企業(yè)對重樓根莖資源需求量大，過度采挖野生資源，市場價格暴漲，目前重樓根莖野生資源日漸瀕危，同時，人工種植目前尚無優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的種源供給市場，導(dǎo)致非藥典重樓植物種的根莖充斥商品市場，已經(jīng)成為制約重樓制藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸，藥材市場的重樓根莖很難采用常規(guī)的性狀、顯微、理化、薄層鑒別等方法進行準(zhǔn)確的鑒別，因此，建立七葉一枝花的新鑒別方法顯得特別必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種對七葉一枝花的單一和復(fù)合鑒定方法。

具體地，本發(fā)明提供了七葉一枝花的鑒定方法，它包括如下操作：

(1)取10批以上七葉一枝花，粉碎，壓片后，采用紅外光譜檢測，測定區(qū)域4000-400cm^-1，以各批樣品檢測數(shù)據(jù)中的各峰吸收強度平均值和各峰對應(yīng)的波數(shù)為基礎(chǔ)，得到紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

(2)取待檢藥材，采用步驟(1)相同的條件進行檢測，獲得待檢藥材指紋圖譜；

(3)將待檢藥材指紋圖譜與紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行相似度比較，鑒別待檢藥材的真?zhèn)危?/p>

其中，所述紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，至少在約3400cm^-1、2940cm^-1、1640cm^-1、1411cm^-1、1250cm^-1、1200-950cm^-1、1150cm^-1處有吸收峰。

進一步地，所述紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，還在約1020cm^-1、920cm^-1、860cm^-1、760cm^-1、700cm^-1處有吸收峰。

紅外光譜圖通常用波長(λ)或波數(shù)(σ)為橫坐標(biāo)，表示吸收峰的位置，用透光率(t％)或者吸光度(a)為縱坐標(biāo)，表示吸收強度。

本發(fā)明一個具體實施方式中，所述紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖2所示。

其中，紅外光譜檢測前，選取七葉一枝花或待檢藥材與kbr的質(zhì)量比為4：200進行壓片。使用上述配比時，最強吸收峰的透光率在10以下，利于檢測。

本發(fā)明實驗表明，當(dāng)相似度在0.90以上時，則可以判斷待檢藥材為七葉一枝花。

另外，本發(fā)明還提供了七葉一枝花的另外一種鑒定方法，它至少包括采用紅外光譜和x線粉末衍射兩種鑒定方法，各方法鑒定次序不分先后，其中：紅外光譜鑒定方法：(1)取10批以上七葉一枝花，粉碎，壓片后，采用紅外光譜檢測，測定區(qū)域4000-400cm^-1，以各批樣品檢測數(shù)據(jù)中的各峰吸收強度平均值和各峰對應(yīng)的波數(shù)為基礎(chǔ)，得到紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

(2)取待檢藥材，采用步驟(1)相同的條件進行檢測，獲得待檢藥材指紋圖譜；

(3)將待檢藥材指紋圖譜與紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行相似度比較，鑒別待檢藥材的真?zhèn)危?/p>

其中，所述紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，至少在約3400cm^-1、2940cm^-1、1640cm^-1、1411cm^-1、1250cm^-1、1200-950cm^-1、1150cm^-1處有吸收峰；

x線粉末衍射鑒定方法：取10批以上七葉一枝花，采用x線粉末衍射進行檢測，以各批樣品檢測數(shù)據(jù)中的各衍射峰峰強度平均值和各衍射峰對應(yīng)的2θ值為基礎(chǔ)，得到x線粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；取待檢藥材，采用前述相同的x線粉末衍射條件進行檢測，獲得待檢藥材指紋圖譜；將待檢藥材指紋圖譜與x線粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行相似度比較；

當(dāng)各鑒定方法中所得相似度均在0.90以上時，則判斷待檢藥材為七葉一枝花。

本發(fā)明一個具體實施方式中，采用cukα輻射進行x線粉末衍射。

其中，掃描速度8°/min。

其中，狹縫寬度ds＝ss＝1°，rs＝0.3mm。

其中，掃描范圍2θ：5-65°。

其中，各樣品進行檢測前需要粉碎，并過100～200目篩。

本發(fā)明一個具體實施方式中，采用omnic軟件處理紅外光譜檢測的指紋圖譜；采用originpro軟件處理x線粉末衍射檢測的指紋圖譜。另外，x線粉末衍射指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理，亦可采用專利201410105727.6中的相關(guān)方法。

本發(fā)明一個具體實施方式中，所述x線粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖4所示。

進一步地，它還可以包括uplc鑒定方法：

取待檢藥材，采用甲醇或乙醇提取，提取物制備供試品溶液，經(jīng)uplc檢測；當(dāng)色譜圖中至少存在重樓皂苷vii和h相對應(yīng)的色譜峰時，則判斷待檢藥材為七葉一枝花；

其中，所述uplc色譜條件如下：

色譜柱：c18色譜柱，規(guī)格2.1mm×75mm，1.7μm

elsd條件：漂移管溫度55℃，氮氣壓力40psi，增益500，冷卻模式，柱溫40℃，流速0.2ml·min^-1

流動相為乙腈-水，梯度條件如下：

本發(fā)明研究過程中，采用3種不同的色譜柱behc18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)、hssc18色譜柱(2.1mm×75mm，1.7μm)、behc18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，試驗結(jié)果表明：采用hssc18色譜柱(2.1mm×75mm，1.7μm)進行洗脫最佳，各色譜峰保留時間適中，峰形和分離均較好。

采用上述復(fù)合方法，可以更為精確地鑒定出七葉一枝花的真?zhèn)?，為七葉一枝花的鑒定提供了新的方法。

本發(fā)明在實驗中使用了相關(guān)系數(shù)法、向量夾角余弦法兩種方法來計算相似度，兩種方法均是相似度的常用方法，其計算公式如下：

本發(fā)明一個具體實施方式中，對于七葉一枝花而言，使用相關(guān)系數(shù)法進行相似度的判斷，其判定結(jié)果可能優(yōu)于向量夾角余弦法。

步驟(1)中藥材批次的選取應(yīng)保證在10批以上，但具體數(shù)值并不固定，只要滿足統(tǒng)計學(xué)意義即可。另外，步驟(1)中所述“七葉一枝花或云南重樓”，是指經(jīng)其他已知的成熟手段鑒定為七葉一枝花或云南重樓的正品。

步驟(2)中所述“待檢藥材”，可以是正品，也可以是偽品。本發(fā)明通過上述方法即可將正品與偽品鑒別區(qū)分。

指紋圖譜是指某些復(fù)雜物質(zhì)，比如中藥，某種生物體或某種組織或細(xì)胞的dna，蛋白質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖?！跋嗨贫取?，已被國家藥典委員會作為一個定性定量參數(shù)，確定為中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)中的一項重要評價指標(biāo)，目前被應(yīng)用于色譜類指紋圖譜的研究(國家藥品監(jiān)督管理局，2000)。

為了保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，可以按照常規(guī)方式對每個樣品進行3次或以上的檢測。

附圖說明

圖1七葉一枝花根莖的紅外圖譜

圖2七葉一枝花根莖的紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖3多批次七葉一枝花根莖的x射線衍射指紋圖譜

圖4七葉一枝花根莖的x射線衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖5混合對照品uplc色譜圖,其中，1.重樓皂苷vii；3.重樓皂苷h；4.重樓皂苷vi；5.柴胡皂苷d；6.重樓皂苷ii；7.纖細(xì)薯蕷皂苷；8.重樓皂苷i

具體實施方式

儀器與材料

普析xd-6型x射線粉末衍射儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、ir200傅立葉變換紅外光譜儀(美國thermonecolet公司)；hx-200型高速中藥粉碎機(浙江永康溪岸五金藥具廠)；dhg-9246型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。瑪瑙研缽。kbr粉末(光譜純)(美國thermo公司)。

七葉一枝花及根莖由西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院劉圓教授、四川大學(xué)華西藥學(xué)院張浩教授鑒定，原植物標(biāo)本及藥材樣品保存在西南民族大學(xué)、四川大學(xué)華西藥學(xué)院。樣品信息見表1。

表1七葉一枝花樣品基源及產(chǎn)地信息

實施例1紅外指紋鑒定

檢測方法:

樣品處理：取原藥材粉碎后，過5號篩備用。取各樣品粉末60℃干燥6h。分別精取各樣品4mg(使其最強吸收峰的透光率在10以下)，加入kbr200mg，在紅外燈下混合研磨均勻，放入模具內(nèi)，壓片，光譜分辨率4cm^-1，測定區(qū)域4000-400cm^-1，中速掃描，掃描次數(shù)16次，掃描時即時去除水分和co2的背景干擾為確保圖譜的可比性。為了減少裝樣造成的誤差，每個樣品研磨均勻后平行掃描3次，即每次測定后將樣品倒出重新裝樣壓片，以保證光譜采集具有代表性，取3次測定得到的光譜平均值作為該樣品的吸收光譜。

檢測結(jié)果

進行光譜掃描，收集數(shù)據(jù)，并用紅外光譜儀自帶的ezomnic32應(yīng)用軟件來進行處理，扣除背景，并進行基線校正和自動平滑處理。得到各樣品紅外光圖譜圖(見圖1)。

紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

在進行相似度分析之前，以10份七葉一枝花的根莖吸收強度的平均值為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的吸收強度，最終得到的紅外圖譜如圖2。

從圖1、2可以觀察到，其中3400cm^-1附近強而寬的吸收峰，歸屬為多糖的羥基形成多種氫鍵o-h鍵、氨基n-h鍵的伸縮振動吸收；2940cm^-1附近的吸收峰是多糖、脂類等亞甲基c-h反對稱伸縮振動；1640cm^-1附近的吸收峰主要為甾體苷、多糖類等物質(zhì)中o-h彎曲振動和羰基c-o伸縮振動吸收峰；1411cm^-1附近的吸收峰歸屬為亞甲基變角振動；1250cm^-1附近吸收峰主要來自羧酸中c-oh的伸縮振動；在1200-950cm^-1多糖吸收區(qū)顯示了較強的吸收峰，主要為苷類、醇類或糖類物質(zhì)c-o伸縮振動吸收峰；其中1150cm^-1附近的吸收峰是多糖和苷類物質(zhì)c-o鍵特征振動和甾體皂苷元中羥基o-h的彎曲振動。

另外，在1020cm^-1附近吸收峰歸屬為直鏈c-c的伸縮振動；920、860、760、700cm^-1附近的吸收峰為糖環(huán)中的c-c伸縮振動和甾體皂苷的特征吸收振動。

紅外圖譜相似度分析

以各樣品的整個紅外光譜圖為分析對象，對樣品的全譜進行相似度分析。把儀器測得數(shù)據(jù)點作為特征值，根據(jù)每個數(shù)據(jù)點位置所對應(yīng)的吸收強度值的差異進行相似度分析。常用的相似度分析方法有“相關(guān)系數(shù)法”和“向量夾角余弦法”兩種，計算公式如下：

計算各樣品間相似度(相關(guān)系數(shù)和夾角余弦)，計算結(jié)果見表1。

表2紅外相似度計算結(jié)果

從表2中可知s8相對其他樣品有一點差距，根據(jù)課題組采樣時發(fā)現(xiàn)其栽培于土壤貧瘠、雜草叢生、日常管理疏忽的環(huán)境條件中；同時，前期試驗得到的結(jié)果表明s8的皂苷總含量明顯略低，這可能是引起差異變化的原因。用向量夾角余弦法計算相似度時，不同樣品的計算結(jié)果極為接近，且與樣品的質(zhì)量狀況沒有明顯的關(guān)系，不利于樣品間的比較；而用相關(guān)系數(shù)法計算時，其結(jié)果則有較大的差異。經(jīng)前期鑒定s8重樓皂苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定0.6％，其相似度在0.92；其余紅外圖譜與對照圖譜的相似度均在0.95以上?？梢姴捎孟嚓P(guān)系數(shù)法對七葉一枝花的根莖紅外指紋圖譜進行全譜相似度分析時，其結(jié)果可以準(zhǔn)確地反映出七葉一枝花根莖的實際質(zhì)量狀況，因此可用于七葉一枝花藥材根莖的鑒別和質(zhì)量評價。

實施例2七葉一枝花的復(fù)合鑒定方法

雖然目前實驗中并沒有發(fā)現(xiàn)與紅外指紋圖譜鑒定不符的案例，但是為了盡量避免藥材鑒定中的疏漏，保證鑒定更高的準(zhǔn)確性，本發(fā)明還使用了復(fù)合鑒定方法，即將紅外、x線衍射等方法聯(lián)合使用。

其中，紅外鑒定方法如實施例1。

x線粉末衍射方法如下：

檢測方法：

樣品處理：取七葉一枝花根莖樣品粉碎，60℃烘干6h，過100目篩備用。試驗條件：cukα輻射；掃描方式：定性，步進掃描；電壓/電流：36kv/20ma；掃描速度：8°/min；ds＝ss＝1°，rs＝0.3mm；步寬：0.02°；掃描范圍2θ：5-65°。

檢測結(jié)果：

1、全部試驗數(shù)據(jù)用originpro8.5處理(35點平滑)，得到粉末衍射圖譜，結(jié)果如圖3。

2、x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

在進行相似度分析之前，以10份七葉一枝花根莖峰強度的平均值為x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的峰強度，最終得到的x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖4。

3、x衍射圖譜相似度分析

常用的相似度分析方法有“相關(guān)系數(shù)法”和“向量夾角余弦法”兩種，計算公式如下：

采用表格計算各樣品間相似度(相關(guān)系數(shù)和夾角余弦)。

表3相似度計算結(jié)果

上述實施例根據(jù)峰的匹配結(jié)果采用平均值法計算獲得x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的峰值；晶面間距d衍射相對強度i/i0表示衍射峰值；以角度2θ為橫坐標(biāo)，衍射峰值(d/i/i0)為縱坐標(biāo)，形成了七葉一枝花根莖x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并進行了相似度的比較。用向量夾角余弦法計算相似度時，s8與對照相似度較其他樣品低，說明與樣品的質(zhì)量狀況有一定關(guān)系，但是數(shù)據(jù)計算結(jié)果極其接近，差距不明顯，不利于樣品間的比較；而用相關(guān)系數(shù)法計算時，其結(jié)果則有較大的差異。經(jīng)前期鑒定s8重樓皂苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定0.6％，其相似度在0.9987，這一分析結(jié)果與紅外光譜鑒別結(jié)果一致；其余x衍射圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均在0.9992以上。根據(jù)比較的結(jié)果可見相似度均大于0.9900，體現(xiàn)了彼此之間非常高的相似性，進一步說明了四川產(chǎn)區(qū)的不同七葉一支花根莖質(zhì)量的相對穩(wěn)定性，同時也說明了建立的x衍射標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可靠。

實施例3七葉一枝花的復(fù)合鑒定方法

除了實施例2中將紅外與x線粉末衍射結(jié)合鑒定的方法外，本發(fā)明中還可以加上uplc。

紅外和x線粉末衍射鑒定方法如實施例2。

uplc鑒定方法如下:

色譜條件

acquityhssc18色譜柱(2.1mm×75mm，1.7μm)；elsd檢測器漂移管溫度55℃，氮氣壓力40psi，增益500，冷卻模式；柱溫40℃；流速0.2ml·min^-1；進樣量：2μl；流動相為乙腈(a)-水(b)，梯度洗脫程序見表4?；旌蠈φ掌穲D見圖5。

表4梯度洗脫程序

供試品溶液的制備

將干燥的七葉一枝花根莖粉碎，過40目篩，精密稱取重樓根莖粉末0.500g，置于100ml錐形瓶中，按料液比1：100(g：ml)加入50ml甲醇，搖勻，靜置4h后，超聲30min，過濾，取濾液置于燒瓶，重復(fù)上述操作1次。合并濾液，45℃減壓旋蒸至干，殘渣用色譜甲醇溶解后，定容于10ml容量瓶，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，備用。

對照品溶液的制備

外標(biāo)法對照品溶液的制備

分別精密稱取各重樓皂苷對照品，用色譜甲醇溶解，各對照品溶液中對照品濃度分別為0.206(vii)、0.210(h)、0.206(vi)、0.208(ii)、0.204(纖細(xì)薯蕷皂苷)、0.202(i)mg·ml^-1，即得各重樓對照品溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，備用。

內(nèi)標(biāo)法對照品溶液的制備

分別精密稱取各重樓皂苷對照品，用色譜甲醇溶解，各對照品溶液中對照品濃度分別為0.136(vii)、0.113(h)、0.104(vi)、0.121(ii)、0.106(纖細(xì)薯蕷皂苷)、0.103(i)mg·ml^-1，即得各重樓對照品溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，備用。精密稱取柴胡皂苷d，用色譜甲醇溶解，對照品濃度為0.250(柴胡皂苷d)mg·ml^-1，即得柴胡皂苷d對照品溶液。

方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察

外標(biāo)法：精密吸取對照品溶液適量均稀釋到2ml，配制成不同稀釋倍數(shù)的混合對照品溶液，進樣2μl，按色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，繪制外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表5。

表5外標(biāo)法對照品的線性回歸方程

內(nèi)標(biāo)法：精密吸取各重樓皂苷對照品溶液0.5，1，1.5，2.5，3ml，分別精密加入內(nèi)標(biāo)物(柴胡皂苷d)溶液1ml，定容至4ml，即得系列測定用對照品溶液，進樣2μl，按前述色譜條件測定。以內(nèi)標(biāo)物(柴胡皂苷d)與對照品重樓皂苷的峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，它們的進樣量比值為橫坐標(biāo)(x)，繪制內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表6。

表6內(nèi)標(biāo)法對照品的線性回歸方程

精密度試驗

取對照品溶液，精密吸取，連續(xù)進樣5次，測定記錄，得到重樓皂苷vii、h、vi、ii、纖細(xì)薯蕷皂苷、i峰面積的rsd分別為1.14％、1.36％、1.28％、1.77％、1.81％、1.55％，結(jié)果＜3％，表明儀器精密度好。

重復(fù)性試驗

取樣品s3，平行制備5份根莖供試品溶液及內(nèi)標(biāo)法系列供試品溶液，按前述色譜條件測定，記錄各重樓皂苷峰面積，計算rsd，結(jié)果均＜3％，表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(s3)，按前述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24h進樣測定，記錄各重樓皂苷峰面積，計算rsd，結(jié)果均＜3％，表明在24h內(nèi)重樓供試品溶液穩(wěn)定性好。

加樣回收試驗

取同一批已知含量的重樓藥材樣品(s3)5份，分別加精密稱量加入重樓皂苷vii、h、vi、ii、纖細(xì)薯蕷皂苷、i對照品，制樣，定容，測定，計算回收率。按外標(biāo)法計算重樓皂苷vii、h、vi、ii、纖細(xì)薯蕷皂苷、i平均加樣回收率分別為：99.91％、99.27％、98.44％、101.33％、98.78％、99.01％，rsd為1.76％、1.65％、1.44％、1.98％、1.52％、1.73％；按內(nèi)標(biāo)法計算，重樓皂苷vii、h、vi、ii、纖細(xì)薯蕷皂苷、i平均加樣回收率分別為：97.21％、98.56％、100.12％、100.15％、99.34％、98.78％，rsd為0.92％、1.77％、1.81％、1.65％、1.34％、1.80％。

檢測結(jié)果

表710份樣品根莖中6個甾體皂苷含量(％)

檢測的10批樣品中，藥典檢測指標(biāo)之一的重樓皂苷vii在所有樣品中均檢測到，而重樓皂苷h在所有樣品中也都檢測到。其余皂苷成分并非全都存在于各樣品中，因此，本發(fā)明認(rèn)為，可以同時以重樓皂苷vii和h作為鑒定七葉一枝花真?zhèn)蔚膶φ粘煞?，若以此uplc方法結(jié)合紅外和x線粉末衍射，將會更有利于提高七葉一枝花真?zhèn)舞b定的準(zhǔn)確性。