本申請是分案申請，原申請的申請日為2012年5月24日，中國申請?zhí)枮?01280050243.5，國際申請?zhí)枮閜ct/gb2012/051171，發(fā)明名稱為“蛋白質(zhì)檢測”。本發(fā)明涉及從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)的試劑、在洗滌劑存在的情況下檢測蛋白質(zhì)的試劑及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的背景通常發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與洗滌劑結(jié)合。例如，在從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)時，洗滌劑常常用于分裂細(xì)胞膜，以使其分裂。洗滌劑還通常在利用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)混合物時被應(yīng)用。由于洗滌劑不利地影響考馬斯染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時的顏色變化，所以洗滌劑必需通過若干洗滌步驟被去除，導(dǎo)致染色程序延長和復(fù)雜。還已知一些洗滌劑諸如十二烷基硫酸鈉使蛋白質(zhì)變性。因此，常常期望在其隨后的應(yīng)用之前從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)。wo2007/125372公開蛋白質(zhì)檢測試劑，其含有考馬斯染料與糊精諸如環(huán)糊精。據(jù)其聲稱，糊精的存在克服與考馬斯染料一起存在的洗滌劑的困難。因此，不需要進(jìn)行通常要求的費力的洗滌步驟。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)wo2007/125372中公開的試劑——含有酸諸如磷酸——常常穩(wěn)定性差并且由于不期望的沉淀而具有高的背景染色。仍需要提供另外的試劑，以從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)。還需要提供另外的高靈敏度和穩(wěn)定性試劑，以檢測蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明提供組合物(下文稱為“分離組合物”)，用于從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)，所述組合物包括a)纖維素衍生物，和b)環(huán)狀寡聚物。本發(fā)明還提供方法(下文稱為“分離方法”)，用于從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)，所述方法，包括1)使含蛋白質(zhì)樣品和洗滌劑與溶液接觸，所述溶液包括a)纖維素衍生物，和b)環(huán)狀寡聚物；和2)從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供方法(下文稱為“染色方法”)，以檢測和/或量化蛋白質(zhì)，包括i)使含蛋白質(zhì)樣品與包括環(huán)狀寡聚物的第一溶液接觸；ii)使含蛋白質(zhì)樣品與包括蛋白質(zhì)復(fù)合染料的第二溶液接觸；和iii)檢測和/或量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。優(yōu)選地，第一或第二溶液中的至少一種包括pka為4或更小的酸。優(yōu)選地，第一溶液包括纖維素衍生物。本發(fā)明還提供組合物(下文稱為“染色組合物”)，以檢測蛋白質(zhì)，包括：a)蛋白質(zhì)復(fù)合染料；b)環(huán)狀寡聚物；和c)羥基羧酸。優(yōu)選地，染色組合物中的羥基羧酸是酒石酸。優(yōu)選地，染色組合物包括纖維素衍生物。發(fā)明詳述本發(fā)明組合物通常含有纖維素衍生物。“本發(fā)明組合物”意為上述“染色組合物”和/或“分離組合物”。同樣，“本發(fā)明方法”意為上述“染色方法”和/或“分離方法”?！袄w維素衍生物”意為其中至少一些游離羥基基團(tuán)已經(jīng)被烷基、羥烷基或羧基烷基基團(tuán)官能化的纖維素。優(yōu)選地，纖維素衍生物包括具有兩個或三個碳原子的羥烷基或羧基烷基基團(tuán)。因而，優(yōu)選纖維素衍生物包括羥乙基、羥丙基、羧甲基和羧乙基。優(yōu)選纖維素衍生物選自羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素。優(yōu)選地，纖維素衍生物選自羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。因此，用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選纖維素衍生物包括具有如下通式的重復(fù)單元：其中，r表示r’、r”或r”’，其中r’表示h或ch2ch2oh(即，羥乙基纖維素)，r”表示h或ch2ch(oh)ch3(即，羥丙基纖維素)，和r”’表示h、ch3或ch2ch(oh)ch3(即，羥丙基甲基纖維素)。特別優(yōu)選的纖維素衍生物選自羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素(即，r表示r’或r”)。最優(yōu)選的纖維素衍生物是羥乙基纖維素(即，r表示r’)諸如2-羥乙基纖維素。本發(fā)明組合物還含有環(huán)狀寡聚物?！碍h(huán)狀寡聚物”意為形成環(huán)(或大環(huán))的寡聚物。換言之,“環(huán)狀寡聚物”不意為環(huán)狀單體單元的寡聚物(盡管這些可被術(shù)語諸如環(huán)狀低聚糖包含)而是形式為單體單元的連續(xù)環(huán)的寡聚物。合適的環(huán)狀寡聚物具有親水基團(tuán)諸如羥基，以使它們?nèi)苡谒匀芤?。環(huán)狀寡聚物是環(huán)形的，并具有內(nèi)腔。優(yōu)選地，環(huán)狀寡聚物有一定大小，以便其內(nèi)腔可容納分子諸如染料、表面活性劑或洗滌劑。優(yōu)選的環(huán)狀寡聚物選自環(huán)狀低聚糖、杯芳烴、葫蘆脲(cucurbituril)、柱芳烴(pillararene)或其衍生物?！碍h(huán)狀低聚糖”意為低聚糖或由糖分子制成的化合物，其形成環(huán)(或大環(huán))。任何類型的環(huán)狀低聚糖理論上均可被利用，盡管優(yōu)選利用僅含一種類型糖分子的環(huán)狀低聚糖。優(yōu)選地，環(huán)狀低聚糖的環(huán)含有5至12個糖分子，更優(yōu)選地，6至8個糖分子，最優(yōu)選地，6個糖分子。優(yōu)選環(huán)狀低聚糖選自環(huán)糊精(或環(huán)-α(1→4)-葡糖苷)、環(huán)葡聚糖(環(huán)-α(1→6)-葡糖苷)、環(huán)凝膠多糖(環(huán)-β(1→3)-葡糖苷)、環(huán)甘露聚糖(環(huán)-α(1→4)-甘露糖苷)、環(huán)果聚糖(環(huán)-β(1→2)-果苷糖)和環(huán)催乳激素(環(huán)-β(1→4)-半乳糖苷)。可用于本發(fā)明組合物的特別優(yōu)選的環(huán)糊精選自α-環(huán)糊精(環(huán)-α(1→4)-葡己糖苷)、β-環(huán)糊精(環(huán)-α(1→4)-葡庚糖苷)和γ-環(huán)糊精(環(huán)-α(1→4)-葡辛糖苷)，其中α-環(huán)糊精(環(huán)-α(1→4)-葡己糖苷)是最優(yōu)選的。優(yōu)選杯芳烴選自杯[4]芳烴、杯[6]芳烴和杯[8]芳烴。優(yōu)選葫蘆脲選自葫蘆脲[6]脲和葫蘆[8]脲。優(yōu)選柱芳烴選自柱[5]芳烴和柱[6]芳烴。術(shù)語“環(huán)狀寡聚物”和“環(huán)狀低聚糖”和上述各具體的環(huán)狀寡聚物/低聚糖還包含這些化合物的衍生物諸如低聚糖，其中，游離羥基基團(tuán)已經(jīng)被官能化，或含有親水基團(tuán)和/或能夠與水氫鍵合的基團(tuán)的環(huán)狀寡聚物。這些類型的衍生物是優(yōu)選的，因為它們提高環(huán)狀寡聚物在水中的溶解度。合適的衍生物包括環(huán)狀寡聚物，例如任意上述具體環(huán)狀寡聚物或環(huán)狀低聚糖，其中，游離羥基基團(tuán)中的一個或多個已經(jīng)用c1-4烷基、羧甲基、磺酰基、乙?；?、羥乙基或羥丙基官能化。親水的和/或能夠與水氫鍵合的衍生基團(tuán)包括羧甲基、磺?；⒘u乙基或羥丙基。本發(fā)明組合物通常是水性溶液。因為蛋白質(zhì)可對離子強(qiáng)度敏感，所以優(yōu)選利用去離子水，以形成本發(fā)明組合物，盡管這不是必要的。分離組合物通常使蛋白質(zhì)游離并可用于進(jìn)一步的應(yīng)用，諸如用于形成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物。因此，分離組合物優(yōu)選地不含有任何蛋白質(zhì)復(fù)合染料?！暗鞍踪|(zhì)-復(fù)合染料”意為蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的形成時顯示光學(xué)性質(zhì)變化的任意部分，諸如吸收光譜的變化或發(fā)射光譜的變化。本發(fā)明組合物中任選的另外的成分包括增溶劑，以在洗滌劑-環(huán)狀寡聚物復(fù)合物形成時幫助避免蛋白質(zhì)集結(jié)?？衫玫暮线m的增溶劑包括醇諸如甲醇、乙醇和異丙醇，其中乙醇是特別優(yōu)選的。本發(fā)明分離組合物中每種成分的典型量總結(jié)在下表中(所有量均作為百分比w/v，即克/ml給出)：組分典型量優(yōu)選量最優(yōu)選量環(huán)狀寡聚物0.1-20％0.5-6％2-5％纖維素衍生物0.01-2％0.05-1％0.1-0.5％增溶劑(例如乙醇)0-10％0.5-4％1-3％上面表中的量是彼此獨立的，并且代表本發(fā)明分離組合物中含有的每種成分的典型和優(yōu)選量。環(huán)狀寡聚物的其它優(yōu)選范圍包括0.1至10％w/v，優(yōu)選地，0.1至4％w/v，更優(yōu)選地，0.5至4％w/v，例如1至3％w/v。增溶劑的其它優(yōu)選范圍包括0至5％w/v。分離組合物在從洗滌劑分離蛋白質(zhì)中具有用途。因此，優(yōu)選分離組合物本身不含有任何洗滌劑/表面活性劑。分離組合物可通過簡單地將成分混合在一起而制成，例如以形成水性溶液。然而，優(yōu)選在加入下一種成分之前確保每種成分充分溶解。這可包括一些適度加熱，例如至大約40-50℃。典型地，環(huán)狀寡聚物溶于去離子水中混合直到獲得平衡溶液(例如達(dá)大約30分鐘至1小時，如果需要可能更長)。纖維素衍生物在此時加入，例如通過形成纖維素衍生物在去離子水中的溶液和將其加入含有環(huán)狀寡聚物的溶液。然而，其它加入順序當(dāng)然也是可能的。最近，已經(jīng)提議低聚糖諸如環(huán)糊精可用于克服與干擾蛋白質(zhì)-染色染料顏色變化的洗滌劑和表面活性劑有關(guān)的困難。不希望受理論的限制，據(jù)信洗滌劑與本發(fā)明分離組合物中存在的環(huán)狀寡聚物形成復(fù)合物。通過利用合適量的一種或多種環(huán)狀寡聚物，洗滌劑可被捕獲在寡聚物-洗滌劑復(fù)合物中，從而使其與蛋白質(zhì)分離。本發(fā)明分離組合物能夠捕獲洗滌劑/表面活性劑，使其能夠容易地與蛋白質(zhì)分離。分離組合物在蛋白質(zhì)/洗滌劑混合物包含在電泳凝膠中時尤其有用。在這樣的情況下，洗滌劑常常存在，以減輕蛋白質(zhì)集結(jié)，確保蛋白質(zhì)能夠在凝膠中有效分離。分離后，凝膠可暴露于含有環(huán)狀寡聚物的溶液，以捕獲洗滌劑。蛋白質(zhì)然后可通過繼續(xù)電泳而與洗滌劑分離。因此，本發(fā)明還提供方法(下文稱為“分離方法”)，用于從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)，所述方法包括1)使含蛋白質(zhì)樣品和洗滌劑與溶液接觸，所述溶液包括a)纖維素衍生物，和b)環(huán)狀寡聚物；和2)從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)。在本發(fā)明分離方法中，環(huán)狀寡聚物和洗滌劑形成復(fù)合物，其能夠與蛋白質(zhì)分離。技術(shù)人員會知道從洗滌劑中分離蛋白質(zhì)的合適方法。合適的方法包括但不限于離心法；層析法諸如尺寸排阻層析法、離子交換層析法、親和層析法和高效液相層析法(hplc)；和電泳。在優(yōu)選實施方式中，含蛋白質(zhì)樣品是電泳凝膠，和方法中步驟2)包括施加電壓至凝膠，以分離蛋白質(zhì)。雖然本發(fā)明分離組合物通常用于分離蛋白質(zhì)和洗滌劑，但在用蛋白質(zhì)復(fù)合染料染色之前其作為預(yù)處理尤其有用。因此，本發(fā)明分離組合物優(yōu)選地形成試劑盒的部分，所述試劑盒包括i)第一溶液，包括a)纖維素衍生物，和b)環(huán)狀寡聚物；和ii)第二溶液，包括蛋白質(zhì)復(fù)合染料。優(yōu)選地，第一(或分離)溶液不含有蛋白質(zhì)復(fù)合染料。蛋白質(zhì)-復(fù)合染料在本領(lǐng)域中是悉知的。一般而言，任何bradford分析試劑或其他考馬斯蛋白質(zhì)染色試劑均可組合本發(fā)明分離組合物而使用?？梢允褂玫纳淌鄣鞍踪|(zhì)復(fù)合染料的實例包括考馬斯亮藍(lán)g-250和考馬斯亮藍(lán)r-250，可獲自sigma-aldrich。對于一些蛋白質(zhì)染色染料，尤其地，諸如考馬斯染料，要求低ph，以在染料與蛋白質(zhì)復(fù)合時獲得期望的顏色變化。典型地，蛋白質(zhì)染色試劑的ph需要低于大約4，諸如大約ph1-2。這些低ph值常常通過加入無機(jī)酸諸如磷酸而達(dá)到。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含有環(huán)狀寡聚物和蛋白質(zhì)復(fù)合染料的蛋白質(zhì)-染色試劑在利用酸諸如磷酸時可具有高水平的不期望的沉淀物。這些沉淀物導(dǎo)致高背景噪音，其使得小量蛋白質(zhì)的檢測困難——如果不是不可能的話。因此，含有環(huán)糊精、考馬斯染料和磷酸的“耐受洗滌劑的”試劑的典型檢測水平大約為20-30ng(毫微克)蛋白質(zhì)。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明分離組合物降低當(dāng)酸諸如磷酸與蛋白質(zhì)復(fù)合染料組合使用時形成的沉淀物的量。如實施例中所示，磷酸可包括在本發(fā)明分離組合物中和/或與蛋白質(zhì)復(fù)合染料組合(即，包括在本發(fā)明試劑盒中的第一和/或第二溶液中)，以提供不含沉淀物的蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)。與蛋白質(zhì)-染色染料組合使用的酸的pka為4或更小，優(yōu)選地，1至4，更優(yōu)選地，2至3.5?？砂ㄔ诒景l(fā)明分離組合物中或與蛋白質(zhì)復(fù)合染料組合使用的合適的酸包括磷酸、亞磷(膦)酸、高碘酸、硒酸、馬來酸、草酸、二氯乙酸和羥基羧酸(例如α-羥基羧酸)。優(yōu)選的酸是磷酸和α-羥基羧酸，例如酒石酸。優(yōu)選地，本發(fā)明分離組合物利用α-羥基羧酸。優(yōu)選α-羥基羧酸選自酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、異檸檬酸、乙二醇酸和乳酸。特別優(yōu)選的α-羥基羧酸選自酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和異檸檬酸，以酒石酸最優(yōu)選。優(yōu)選利用α-羥基羧酸，因為它們通常比酸諸如磷酸毒性更小。此外，發(fā)現(xiàn)α-羥基羧酸諸如酒石酸提供高度靈敏的染色系統(tǒng)，該染色系統(tǒng)能夠以低至4ng的水平檢測蛋白質(zhì)，而沒有由于沉淀物導(dǎo)致的高背景噪音引起的問題。典型地，酸存在時其在本發(fā)明試劑盒的第一和/或第二溶液中的量是1至30％w/v(即，g/ml)，優(yōu)選地，5至25％w/v，最優(yōu)選地，15至25％w/v。技術(shù)人員會知道，如果ph太低，蛋白質(zhì)復(fù)合染料可能不能適當(dāng)發(fā)揮作用。因此，第一和/或第二溶液通常僅含有5至15％w/v的強(qiáng)酸諸如磷酸，而較弱的酸諸如酒石酸可以較高的量諸如15至25％w/v存在。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)纖維素衍生物諸如2-羥乙基纖維素的包含大大提高蛋白質(zhì)凝膠染色的反襯度(對比度，contrast)，所述蛋白質(zhì)凝膠已經(jīng)通過本發(fā)明分離或染色組合物進(jìn)行處理。產(chǎn)生該效果的具體機(jī)制尚未被充分了解。然而，可能是纖維素衍生物使環(huán)狀寡聚物-洗滌劑復(fù)合物穩(wěn)定，進(jìn)一步降低游離洗滌劑的量和減輕洗滌劑可能對蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的任何干擾。本發(fā)明還提供方法(下文稱為“染色方法”)，用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)，包括i)使含蛋白質(zhì)樣品與包括環(huán)狀寡聚物的第一溶液接觸；ii)使含蛋白質(zhì)樣品與包括蛋白質(zhì)復(fù)合染料的第二溶液接觸；和iii)檢測和/或量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。本發(fā)明優(yōu)選染色方法利用本發(fā)明優(yōu)選分離組合物作為第一溶液，和本發(fā)明優(yōu)選試劑盒，其中試劑盒中的成分i)對應(yīng)于染色方法中的第一溶液，和試劑盒中的成分ii)對應(yīng)于染色方法中的第二溶液，所述優(yōu)選組合物和試劑盒與上面和權(quán)利要求書中給出的一樣。尤其地，本發(fā)明染色方法中的第一溶液優(yōu)選含有纖維素衍生物，諸如上述纖維素衍生物。還優(yōu)選第一或第二溶液中的至少一種包括pka為4或更小的酸，諸如上述優(yōu)選酸。優(yōu)選地，第一和第二溶液是水性溶液。在本發(fā)明染色方法的步驟i)中，環(huán)狀寡聚物與可能存在于含蛋白質(zhì)樣品中的任意洗滌劑形成復(fù)合物。因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合染料在步驟ii)中被加入時，洗滌劑不能干擾蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物形成。染色方法因此允許以非常低的水平檢測蛋白質(zhì)，即使明顯量的洗滌劑存在于初始含蛋白質(zhì)樣品中。因此，環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精與蛋白質(zhì)-染色染料的組合應(yīng)用提供“耐受洗滌劑的”蛋白質(zhì)染色系統(tǒng)，該系統(tǒng)不需要費力的洗滌步驟來去除可能存在的任意洗滌劑。這些試劑大大簡化在電泳期間用于給蛋白質(zhì)染色的方案。本發(fā)明染色方法中利用的第二溶液可以是任意類型的蛋白質(zhì)復(fù)合染料，盡管考馬斯染料是特別優(yōu)選的。商售蛋白質(zhì)復(fù)合染料可用作本發(fā)明染色方法中的第二溶液——如所提供的或諸如通過加入pka為4或更小的酸被適當(dāng)改性。第一(或分離)溶液充當(dāng)“預(yù)處理”，以去除存在的洗滌劑(或取消存在的洗滌劑的作用)。第二溶液然后可用于根據(jù)針對該染料的普通程序給蛋白質(zhì)染色。利用根據(jù)本發(fā)明的預(yù)處理(即，第一溶液)的優(yōu)勢是不言而喻的，因為通常必須采取的任意去除洗滌劑的步驟均可省略。含蛋白質(zhì)樣品的形式可以是溶液諸如水性溶液(溶解的或作為懸浮液)、作為固體諸如沉淀物或形式為含有蛋白質(zhì)的支持物?？珊械鞍踪|(zhì)的典型支持物包括層析板、濾紙、硝基纖維素膜或樹脂或凝膠基質(zhì)諸如電泳凝膠。合適的凝膠基質(zhì)是技術(shù)人員所知道的，其包括聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。當(dāng)含蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)溶液或懸浮液時，一旦形成，則從溶液中分離環(huán)狀寡聚物/洗滌劑復(fù)合物通常是不值得的。相反，蛋白質(zhì)復(fù)合染料可被簡單地加入染色方法的步驟i)中形成的溶液。當(dāng)含蛋白質(zhì)樣品的形式為含有所述蛋白質(zhì)的支持物時，支持物可在步驟i)后在步驟ii)中加入第二溶液之前從第一溶液(例如通過倒掉第一溶液)中去除。這避免含有蛋白質(zhì)復(fù)合染料的溶液變得太稀釋，這有助于保持形成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物所需的時間最少。任選地，支持物可在步驟ii)之前被漂洗。然而，這不是必須的，因為第一和第二溶液彼此相容。典型地，本發(fā)明染色和分離方法在室溫下完成。然而，在需要時可使用微高的溫度諸如上至50℃。環(huán)狀寡聚物/洗滌劑復(fù)合物形成的速率將取決于含蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)確形式。例如，如果含蛋白質(zhì)樣品是溶液，則形成速率幾乎是瞬間的。然而，在蛋白質(zhì)被捕獲在基質(zhì)諸如電泳凝膠中的情況下，使含蛋白質(zhì)樣品與第一溶液接觸的步驟在大多數(shù)情況下通常耗費上至15分鐘，但可耗費上至1小時，這取決于洗滌劑在含蛋白質(zhì)樣品中的濃度。步驟ii)需要類似的時段，以形成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物。當(dāng)被用于給凝膠諸如電泳凝膠染色時，第一溶液優(yōu)選在微波中與凝膠一起被加熱上至30秒，例如20秒。這些值是針對典型的1000w微波。微波加熱后，組合物和凝膠通常在室溫(例如20-25℃)或在高溫諸如50℃下靜置例如15分鐘?？赏ㄟ^利用水浴或任意其他合適的手段維持高溫。在需要時，該方案可任選地重復(fù)步驟ii)。然而，步驟ii)的方案可根據(jù)所使用的蛋白質(zhì)復(fù)合染料而輕微變化。技術(shù)人員會知道應(yīng)該用于任意給定蛋白質(zhì)復(fù)合染料的合適的方案。盡管這些是優(yōu)選方案，但實施例顯示本發(fā)明染色試劑盒可在室溫下用于在僅15分鐘內(nèi)給電泳凝膠染色。典型地，本發(fā)明方法包括暴露電泳凝膠于第一溶液達(dá)上至30分鐘，例如5至15分鐘；傾倒第一溶液；和暴露電泳凝膠于第二溶液達(dá)上至30分鐘，例如5至15分鐘。當(dāng)然，凝膠暴露于第一和第二溶液越久，該方法將越靈敏，尤其當(dāng)凝膠在上述高溫下被染色時。因此，在優(yōu)選實施方式(尤其當(dāng)含蛋白質(zhì)樣品是電泳凝膠和要求高靈敏度時)中，本發(fā)明染色方法包括在使第一溶液與含蛋白質(zhì)樣品接觸的步驟之后加熱第一溶液和含蛋白質(zhì)樣品(諸如在微波中加熱10-30秒，優(yōu)選地，15-20秒)和維持溶液和樣品處于20-60℃，優(yōu)選地，20-50℃的溫度達(dá)上至1小時，優(yōu)選地，達(dá)5至30分鐘，更優(yōu)選地，5至20分鐘。有利地，環(huán)狀寡聚物的利用意為在檢測蛋白質(zhì)之前不需要去除洗滌劑和/或表面活性劑。因此，電泳凝膠可利用本發(fā)明組合物被染色而無需跑完凝膠后被洗滌。在優(yōu)選方面，本發(fā)明因此涉及檢測和/或量化蛋白質(zhì)的方法，包括a)提供含蛋白質(zhì)凝膠，b)施加電場至所述凝膠，c)暴露凝膠于包括環(huán)狀寡聚物的第一溶液，d)任選地，從第一溶液中去除凝膠，e)暴露含蛋白質(zhì)樣品于含有蛋白質(zhì)復(fù)合染料的第二溶液，和f)檢測和/或量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成。在這樣的方法中，優(yōu)選凝膠在步驟b)后和步驟c)前不被洗滌。任何合適的電泳凝膠均可用于該方法，諸如聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠。步驟d)中“任選地從第一溶液中去除凝膠”意為凝膠和第一溶液通過任意手段被分離，以便在步驟e)期間當(dāng)凝膠暴露于第二溶液時第一溶液不再存在。在實踐中，可能不期望在步驟d)中實際上移動凝膠，因為電泳凝膠通常是十分易碎的。相反，步驟d)通常包括倒掉第一溶液，以便凝膠保留在該方法正在使用的容器中。在本發(fā)明染色方法中，檢測蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物可包括量化存在的蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物的量，以便確定蛋白質(zhì)的量或濃度。典型地，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的形成導(dǎo)致染料光譜學(xué)性質(zhì)的變化，這可利用已知的方法檢測和分析。例如，量化可通過包括測量染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收或發(fā)射光譜的變化的方法執(zhí)行。量化可包括例如測量顏色變化。對于大部分蛋白質(zhì)復(fù)合染料，吸光度通常在大約400至大約700nm范圍內(nèi)的波長處被測量。利用合適的實時光譜學(xué)手段允許測量吸光度隨時間的變化。對于考馬斯亮藍(lán)g-250，吸光度在大約595nm的波長處被測量，在與蛋白質(zhì)復(fù)合時該染料的吸光度最大。當(dāng)利用考馬斯亮藍(lán)g-250時，蛋白質(zhì)可通過監(jiān)測由于形成染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸光度在595nm處的增加而被檢測。為確定蛋白質(zhì)濃度，測量的吸光度或發(fā)射(emission)可以與標(biāo)準(zhǔn)值、標(biāo)準(zhǔn)值集或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。本發(fā)明方法高度易于自動化和分析大量樣品。合適的高通量設(shè)備是商業(yè)上可得的，技術(shù)人員應(yīng)該知道。如上所示，本發(fā)明分離組合物的應(yīng)用避免組合利用無機(jī)酸諸如磷酸與蛋白質(zhì)復(fù)合染料和環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精時產(chǎn)生的問題。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)當(dāng)羥基羧酸被用于“多效合一”染色組合物中時這些缺點還可被克服。本發(fā)明因此涉及組合物(本文中被稱為“染色組合物”)，用于檢測蛋白質(zhì)，所述組合物包括：a)蛋白質(zhì)復(fù)合染料；b)環(huán)狀寡聚物；和c)羥基羧酸。在一些實施方式中，染色組合物中的環(huán)狀寡聚物不是α-環(huán)糊精(環(huán)-α(1→4)-葡己糖苷)。優(yōu)選地，染色組合物中的羥基羧酸是α-羥基羧酸，諸如酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、異檸檬酸、乙二醇酸或乳酸。最優(yōu)選的羥基羧酸是酒石酸。優(yōu)選地，染色組合物還包括纖維素衍生物，諸如上面在分離組合物背景下提及的任意優(yōu)選纖維素衍生物。最優(yōu)選的纖維素衍生物是羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素，其中羥乙基纖維素，尤其是2-羥乙基纖維素是特別優(yōu)選的。本發(fā)明染色組合物中各種成分的典型量顯示在以下表中(所有量均作為百分比w/v，即克/ml給出)：雖然本發(fā)明染色組合物的形式可以是溶液諸如水性溶液，但含有兩種或更多種溶液——組合以形成本發(fā)明染色組合物——的試劑盒也形成本發(fā)明的部分。因此，本發(fā)明還提供試劑盒，包括a)蛋白質(zhì)復(fù)合染料，b)環(huán)狀寡聚物，和c)羥基羧酸，其中成分a)、b)和c)以兩種或更多種獨立的組合物存在，其在組合時形成用于蛋白質(zhì)檢測的組合物。在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，試劑盒包括i)組合物，包括蛋白質(zhì)-染色染料，和ii)組合物，包括環(huán)狀寡聚物和羥基羧酸，其中成分i)和ii)在組合時形成用于蛋白質(zhì)檢測的組合物。在這樣的試劑盒中，第一溶液優(yōu)選地還包括羥基羧酸諸如α-羥基羧酸。優(yōu)選α-羥基羧酸在上面提及，以酒石酸最優(yōu)選。提供試劑盒形式的染色組合物是有利的，因為它可增加組合物作為整體的穩(wěn)定性和保存期限。這樣的試劑盒還優(yōu)選在第二溶液中含有纖維素衍生物。優(yōu)選纖維素衍生物在上面提及，以2-羥乙基纖維素最優(yōu)選。這樣的試劑盒還優(yōu)選在第二溶液中含有增溶劑。優(yōu)選增溶劑在上面提及，以乙醇最優(yōu)選。環(huán)狀寡聚物、α-羥基羧酸、任選的纖維素衍生物和任選的增溶劑的優(yōu)選類型和量涉及本發(fā)明分離組合物時在上面提及。本發(fā)明染色組合物還可在本發(fā)明可選方法中直接應(yīng)用于含蛋白質(zhì)樣品。因此，本發(fā)明還提供檢測和/或量化蛋白質(zhì)的方法，包括使含蛋白質(zhì)樣品與溶液接觸，所述溶液包括a)蛋白質(zhì)復(fù)合染料，b)環(huán)狀寡聚物，和c)羥基羧酸；和檢測和/或量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成。優(yōu)選地，含蛋白質(zhì)樣品的形式為含有所述蛋白質(zhì)的支持物諸如電泳凝膠。因此，利用染色組合物的特別優(yōu)選的方法包括i)提供含蛋白質(zhì)凝膠，ii)施加電場至所述凝膠，iii)暴露凝膠于本發(fā)明染色組合物，和iv)檢測和/或量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成。在這樣的方法中，凝膠優(yōu)選在步驟ii)后和步驟iii)前不被洗滌。任何合適的電泳凝膠均可用于該方法，諸如聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠。如上所述，染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的速率將取決于含蛋白質(zhì)樣品的具體形式。例如，在蛋白質(zhì)被捕獲在基質(zhì)諸如電泳凝膠中的情況下，使含蛋白質(zhì)樣品與本發(fā)明染色組合物接觸的步驟通常在大多數(shù)情況下通常耗費上至15分鐘，但可耗費上至1小時，以有效地給僅以非常低濃度存在的蛋白質(zhì)染色。典型地，利用上面針對分離組合物提出的相同方法，染色組合物被應(yīng)用于電泳凝膠以給蛋白質(zhì)染色。因此，當(dāng)被用于給凝膠諸如電泳凝膠染色時，本發(fā)明染色組合物優(yōu)選在微波中與凝膠一起被加熱上至30秒例如20秒。這些值是針對典型的1000w微波。微波加熱后，組合物和凝膠通常在室溫(例如20-25℃)或在高溫諸如50℃下靜置例如15分鐘?？赏ㄟ^利用水浴或任意其他合適的手段維持高溫。如上所述，本發(fā)明試劑盒中第一(即，分離)和第二溶液的應(yīng)用降低蛋白質(zhì)復(fù)合染料與含蛋白質(zhì)樣品接觸時形成的沉淀物的量。即使如此，在利用α-羥基羧酸諸如酒石酸時仍獲得最佳結(jié)果。此外，利用纖維素衍生物提高染料/蛋白質(zhì)-復(fù)合物——尤其在存在于電泳凝膠中時——的反襯度。本發(fā)明因此還涉及羥基羧酸，尤其是α-羥基羧酸諸如酒石酸降低含蛋白質(zhì)復(fù)合染料的酸化溶液中沉淀物的量的用途。本發(fā)明還涉及纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)增強(qiáng)染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物染色的用途。本發(fā)明還涉及纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)和環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精(例如α-、β-或γ-環(huán)糊精)的組合來增強(qiáng)染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物染色的用途。清楚地是，用于檢測蛋白質(zhì)的組合物中的沉淀物必將提供任意染色混合物諸如染色電泳凝膠的不清楚的背景。本發(fā)明因此涉及羥基羧酸尤其是α-羥基羧酸諸如酒石酸和纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)的組合增強(qiáng)染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的染色的用途。本發(fā)明還涉及羥基羧酸尤其是α-羥基羧酸諸如酒石酸、纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)和環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精(例如α-、β-或γ-環(huán)糊精)的組合增強(qiáng)染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的染色的用途?！霸鰪?qiáng)染色”意為使染料/蛋白質(zhì)-復(fù)合物更容易在染色混合物中被鑒別，例如通過提高已經(jīng)被暴露于蛋白質(zhì)復(fù)合染料的含有蛋白質(zhì)的凝膠中的反襯度。該提高可通過染料/蛋白質(zhì)-復(fù)合物形成或通過降低不含有任何蛋白質(zhì)的區(qū)域中背景的量或通過兩者。染色增強(qiáng)的提高可通過計算信噪比，例如通過利用光密度分析法而被確定。因此，鑒于其它方面，本發(fā)明涉及纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)提高凝膠中染色的染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的信號/噪音比——優(yōu)選如通過光密度分析法所測定的——的用途。本發(fā)明還涉及纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)和環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精(例如α-、β-或γ-環(huán)糊精)的組合提高凝膠中染色的染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的信號/噪音比——優(yōu)選如通過光密度分析法所測定的——的用途。本發(fā)明還涉及羥基羧酸尤其是α-羥基羧酸諸如酒石酸和纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)的組合提高凝膠中染色的染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的信號/噪音比——優(yōu)選如通過光密度分析法所測定的——的用途。本發(fā)明還涉及羥基羧酸尤其是α-羥基羧酸諸如酒石酸、纖維素衍生物諸如羥乙基纖維素(例如2-羥乙基纖維素)和環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精(例如α-、β-或γ-環(huán)糊精)的組合提高凝膠中染色的染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的信號/噪音比——優(yōu)選如通過光密度分析法所測定的——的用途。在上述用途中，纖維素衍生物優(yōu)選作為溶液的部分(即，纖維素衍生物不是固體基質(zhì))而存在。本發(fā)明因此優(yōu)選涉及纖維素衍生物——任選組合羥基羧酸和/或環(huán)狀寡聚物——的溶液實現(xiàn)上述效果的用途。提高的信號/噪音比是可實現(xiàn)的，即使在本發(fā)明方法中第一溶液在加入第二溶液之前被去除。這據(jù)信是由于在本發(fā)明方法的步驟i)期間浸漬或涂布凝膠的纖維素衍生物。因此，即使在步驟ii)之前第一溶液被去除和凝膠被漂洗，至少一些纖維素衍生物保留在凝膠中以引起信噪比的提高。相同的考慮因素適用于α-羥基羧酸，其可存在于第一和/或第二溶液中。因此，即使α-羥基羧酸僅包括在第一溶液中，酸浸漬凝膠并被保留，即使第一溶液被去除。酸因此可引起信號/噪音比提高，即使其不包含在第二溶液中。當(dāng)然，在第一和第二溶液中均利用α-羥基羧酸時獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明將通過參考以下非限制性實例和附圖被進(jìn)一步描述，在所述附圖中：圖1顯示具有制劑a(圖1a)和速溶藍(lán)(instantblue)(圖1b)的小瓶圖2顯示未洗滌的、通過制劑a染色的凝膠圖3顯示未洗滌的、通過速溶藍(lán)染色的凝膠圖4顯示獲自實施例2a的凝膠圖5顯示獲自實施例2b的凝膠圖6顯示獲自實施例2c的凝膠圖7顯示獲自實施例3a的凝膠圖8顯示獲自實施例3b的凝膠圖9顯示獲自實施例3c的凝膠圖10顯示獲自實施例3d的凝膠圖11顯示利用制劑b染色的凝膠的掃描圖12顯示利用制劑c染色的凝膠的掃描圖13顯示利用制劑d染色的凝膠的掃描圖14顯示利用制劑a和速溶藍(lán)染色的凝膠的信號/噪音比實施例1以下制劑通過在去離子水中混合成分而制備：制劑a：作為對照，“速溶藍(lán)”獲自expedeonlimited，據(jù)信其含有磷酸、α-環(huán)糊精、乙醇和考馬斯染料，與wo2007/125372的實施例一致。圖1a顯示含有制劑a的小瓶，而圖1b顯示含有速溶藍(lán)的小瓶。這些圖清楚地顯示本發(fā)明的染色制劑是透明的而沒有沉淀物，并具有淺藍(lán)/綠顏色。相比之下，速溶藍(lán)呈混濁棕色，具有明顯量的懸浮顆粒/沉淀物。這些制劑被用于給含有各種濃度bsa的page凝膠染色。染色1小時后不期望的凝膠顯示于圖2和3。速溶藍(lán)中高水平的沉淀物使其在背景下難以看到低水平的bsa。該實施例清楚地顯示蛋白質(zhì)-染色溶液——含有環(huán)狀寡聚物諸如環(huán)糊精和磷酸——中高水平的沉淀物。實施例2以下制劑通過在去離子水中混合成分而制備：制劑i-1制劑i-2制劑i-3α-環(huán)糊精4％w/v乙醇2％w/v2-羥乙基纖維素0.3w/v制劑ii-1g250染料0.013％w/v酒石酸20％w/v制劑ii-2g250染料0.013％w/v磷酸10％w/v含有各濃度bsa的page凝膠利用上面顯示的制劑i和ii的以下組合進(jìn)行染色：實施例預(yù)處理染色2ai-1ii-12bi-2ii-22ci-3ii-2page凝膠首先在室溫下被暴露于預(yù)處理i達(dá)10分鐘。暴露后，處理溶液被倒掉和染色溶液ii被加入。然后，使凝膠在室溫下另外靜置5分鐘，然后去除染色溶液。來自2a、2b和2c的染色凝膠分別顯示于圖4、5和6。這些凝膠清楚地顯示根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可組合酸諸如磷酸使用而不經(jīng)歷任何沉淀問題。此外，圖4和5/6之間的比較顯示，利用酒石酸時染色的帶清楚地多。實施例3以下制劑通過在去離子水中混合成分而制備：制劑i-4α-環(huán)糊精4％w/v乙醇2％w/v2-羥乙基纖維素0.3w/v制劑i-5酒石酸20％w/v乙醇2％w/v2-羥乙基纖維素0.3w/v制劑i-6酒石酸20％w/vα-環(huán)糊精4％w/v乙醇2％w/v含有各濃度bsa的page凝膠利用上面顯示的制劑i和ii的以下組合進(jìn)行染色：實施例預(yù)處理染色3ai-1ii-13bi-4ii-13ci-5ii-13di-6ii-1page凝膠首先在室溫下被暴露于預(yù)處理i達(dá)10分鐘。暴露后，處理溶液被倒掉和染色溶液ii被加入。然后，使凝膠在室溫下另外靜置5分鐘，然后去除染色溶液。來自3a、3b、3c和3d的染色凝膠分別顯示于圖7、8、9和10。圖7和8中的凝膠顯示酒石酸不需要包括在第一溶液中(即，預(yù)處理)。圖9清楚地顯示，如果在預(yù)處理省略環(huán)狀寡聚物，則看不到帶。此外，圖10顯示如果在預(yù)處理省略纖維素衍生物，則帶幾乎不可見。實施例4以下制劑通過在去離子水中溶解各成分而制備：制劑b：制劑c：制劑d：page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)利用商業(yè)凝膠產(chǎn)品在標(biāo)準(zhǔn)條件下完成。產(chǎn)生商售和購買的牛血清白蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)樣品并在凝膠(一個或多個)上運行。商業(yè)標(biāo)記也包括在內(nèi)。一旦電泳結(jié)束，從其塑料護(hù)套中移出凝膠并插入含有上述制劑之一的小槽中。利用每種制劑允許和測試同樣的凝膠。染色時間對于每種制劑是一致的。圖11至13顯示染色凝膠的掃描。凝膠中中間四條帶是感興趣的測試帶，其中外面的泳道是標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。在掃描儀上獲得凝膠圖片，這導(dǎo)致凝膠背景為淺灰——其中水層已經(jīng)被捕獲在凝膠和掃描儀的玻璃屏之間——或白色——其中空氣層(或氣泡)在凝膠和屏之間。即使由于在凝膠和掃描儀玻璃板之間存在或不存在水層而產(chǎn)生的背景中存在差異，但圖11-13所示結(jié)果清楚地顯示，利用酒石酸取代磷酸提高四條測試帶的反襯度，使其更易于鑒別(見圖11和12)。此外，圖12和13顯示加入2-羥乙基纖維素導(dǎo)致染色蛋白質(zhì)樣品和背景之間甚至更大的反襯度。實施例5上述制劑a和速溶藍(lán)被用于給含有各種濃度bsa的page凝膠染色。染色蛋白質(zhì)與背景之比通過光密度分析法測量。結(jié)果顯示在圖14a-c中。圖14c清楚地顯示，制劑a能夠在低于20ng的濃度檢測蛋白質(zhì)。此外，圖14a、14b和14c各顯示通過利用根據(jù)本發(fā)明的染色組合物獲得的信噪比的明顯提高。當(dāng)前第1頁12