本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于流式細(xì)胞術(shù)的精子dfi檢測方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的精液檢測方法主要針對(duì)精子的dna碎片化，這些檢測結(jié)果不能全面、準(zhǔn)確地反映精子狀況。精子的主要功能是保留并傳遞父輩的遺傳信息，而dna存在于精子體內(nèi)，被魚精蛋白包裹呈致密的結(jié)構(gòu)。dna是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即：腺嘌呤脫氧核苷酸(damp)、胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dtmp)、胞嘧啶脫氧核苷酸(dcmp)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(dgmp)。而脫氧核糖(五碳糖)與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著dna長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。

dna存儲(chǔ)著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)dna分子的完整性對(duì)細(xì)胞至關(guān)緊要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致dna分子的損傷或改變，而且與rna及蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)大量合成不同，一般在一個(gè)原核細(xì)胞中只有一份dna，在真核二倍體細(xì)胞中相同的dna也只有一對(duì)，如果dna的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對(duì)體細(xì)胞就可能影響其功能或生存，對(duì)生殖細(xì)胞則可能影響到其后代。dna在正常狀態(tài)下形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，正常狀態(tài)下，dna分子是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，而在體內(nèi)dna由于多種原因會(huì)導(dǎo)致dna損傷，而損傷的dna又對(duì)生物個(gè)體的繁衍產(chǎn)生重大影響；故對(duì)精子dna完整性檢測是意義非凡的。傳統(tǒng)的精子dfi檢測依賴于吖啶橙檢測法，并通過顯微鏡觀察精子樣本，通過識(shí)別熒光顏色以及計(jì)數(shù)來計(jì)算dfi值。本公司通過dfi試劑盒對(duì)精子樣本進(jìn)行處理、染色，再通過流式細(xì)胞法對(duì)樣本進(jìn)行自動(dòng)化分析，該方法檢測結(jié)果過于依賴人為操作，檢測結(jié)果主觀性強(qiáng)；操作過程繁瑣，檢測效率低下，重復(fù)性差，敏感性較差特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果易于判定、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣的基于流式細(xì)胞術(shù)的精子dfi檢測方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種基于流式細(xì)胞術(shù)的精子dfi檢測方法，包括以下步驟：

(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×10⁶個(gè)/ml；

(2)將500μl稀釋過的精子加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液(主要成分為鹽酸，目的是使緊密的dna變得結(jié)構(gòu)較為松散，以便于后續(xù)染色步驟進(jìn)行)，30秒后加入ao染色液；

(3)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，將檢測管上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用dfiview軟件統(tǒng)計(jì)分析；

(4)染色后的精子細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞儀收集精子的紅綠熒光信號(hào)(即fitc與percp熒光信號(hào))，通過收集到的紅色熒光精子占收集精子總數(shù)的比例，判定樣本的dna碎片化程度；結(jié)果判斷依據(jù)于建立的圖像收集模板，主要是對(duì)熒光強(qiáng)度的要求(依據(jù)不同儀器的收集條件不同建立對(duì)應(yīng)的模板，具體包括，以calibur儀器為例，fitc熒光強(qiáng)度中位數(shù)處于收集范圍的中部為400～600，percp熒光強(qiáng)度中位數(shù)為50～100；

(5)測定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。

步驟(1)中所述的緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、n-2-羥乙基哌嗪-n-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。

所述的酸化處理緩沖液為0.08mol/l鹽酸。在酸化處理后利用吖啶橙染料與雙鏈dna結(jié)合發(fā)綠色或黃色熒光，與單鏈dna結(jié)合發(fā)紅色熒光的特性，確定精子dna碎片化程度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種基于流式細(xì)胞術(shù)的精子dfi檢測方法，通過dfi試劑盒對(duì)精子樣本進(jìn)行處理、染色，包括精子dna熒光染液和染色緩沖液。通過熒光標(biāo)記、流式上機(jī)檢測精子dna碎片率，從而評(píng)估精子的dna損傷程度，為不育癥檢查、輔助生殖治療方案的選擇提供幫助。該方法避免了傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果過于依賴人為操作，檢測結(jié)果主觀性強(qiáng)；操作過程繁瑣，檢測效率低下，重復(fù)性差，敏感性較差特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了精子dfi檢測的簡單、快速、準(zhǔn)確、高通量檢測并計(jì)算dfi的目的。

附圖說明

圖1為精子細(xì)胞群圖形，圖中用門圈中區(qū)域即為精子細(xì)胞主群；

圖2為精子細(xì)胞群熒光表達(dá)圖，圖中分為三群細(xì)胞，靠近fitc(縱軸)的群即為dna完整性好的細(xì)胞群，靠近percp(橫軸)的細(xì)胞群即為dna完整性差的細(xì)胞群，位于倆群中間的細(xì)胞群是完整性較差的細(xì)胞群。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

具體實(shí)施例

一種基于流式細(xì)胞術(shù)的精子dfi檢測方法，包括以下步驟：

(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×10⁶個(gè)/ml；其中緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、n-2-羥乙基哌嗪-n-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物；

(2)將500μl稀釋過的精子加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液(為0.08mol/l鹽酸，目的是使緊密的dna變得結(jié)構(gòu)較為松散，以便于后續(xù)染色步驟進(jìn)行)，30秒后加入ao染色液；在酸化處理后利用吖啶橙染料與雙鏈dna結(jié)合發(fā)綠色或黃色熒光，與單鏈dna結(jié)合發(fā)紅色熒光的特性，確定精子dna碎片化程度；

(3)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，將檢測管上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用dfiview軟件統(tǒng)計(jì)分析；

(4)染色后的精子細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞儀收集精子的紅綠熒光信號(hào)(即fitc與percp熒光信號(hào))，通過收集到的紅色熒光精子占收集精子總數(shù)的比例，判定樣本的dna碎片化程度；結(jié)果判斷依據(jù)于建立的圖像收集模板，主要是對(duì)熒光強(qiáng)度的要求(依據(jù)不同儀器的收集條件不同建立對(duì)應(yīng)的模板，具體包括，以calibur儀器為例，fitc熒光強(qiáng)度中位數(shù)處于收集范圍的中部為400～600，percp熒光強(qiáng)度中位數(shù)為50～100；如圖1所示，為精子細(xì)胞群圖形，圖中用門圈中區(qū)域即為精子細(xì)胞主群；圖2所示為精子細(xì)胞群熒光表達(dá)圖，圖中分為三群細(xì)胞，靠近fitc(縱軸)的群即為dna完整性好的細(xì)胞群，靠近percp(橫軸)的細(xì)胞群即為dna完整性差的細(xì)胞群，位于倆群中間的細(xì)胞群是完整性較差的細(xì)胞群；

(5)測定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。

當(dāng)然，上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的精子DFI檢測方法，特點(diǎn)是包括以下步驟：(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個(gè)/mL；(2)將500μL稀釋過的精子加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液，30秒后加入AO染色液；(3)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，將檢測管上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄5000個(gè)細(xì)胞并使用DFIView軟件統(tǒng)計(jì)分析；(4)如何進(jìn)行結(jié)果判斷；(5)測定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣。

技術(shù)研發(fā)人員：曾橋;江南;房海燕;陳繼勇;胡潤環(huán)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江星博生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.07
技術(shù)公布日：2017.07.07