發(fā)明名稱：尿路表皮癌的檢測方法

國際申請日：2011年6月20日

國際申請?zhí)枺篜CT/JP2011/003509

國家申請?zhí)枺?01180026294.X

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及尿路表皮癌的檢測方法，具體地說是涉及使用了5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽(以下，有時稱為“ALA類”)的尿路表皮癌的檢測方法。

背景技術(shù)：

尿路表皮癌的檢測，通常是對脫落在尿液中的細(xì)胞進行巴氏染色后在顯微鏡下觀察來進行的，診斷要求熟練，還存在細(xì)胞漏看多的問題。檢測困難會關(guān)系到癌癥發(fā)現(xiàn)的延誤，并且也會關(guān)系到病癥復(fù)發(fā)的錯過。

另一方面，已知在膀胱癌患者的內(nèi)視鏡手術(shù)中，將ALA類注入膀胱內(nèi)，觀察膀胱內(nèi)的癌細(xì)胞發(fā)出的熒光來決定切除部位(例如，參照非專利文獻1)，還知道通過口服給藥或者靜脈注射ALA類也可以觀察膀胱內(nèi)的熒光(參照專利文獻1)。

此外，還提出有一種含有ALA類的腫瘤診斷劑，其目的在于，將該腫瘤診斷劑按照一次每1kg體重給藥0.001mg～10g后，通過測量血液、體液、組織、尿、糞便、唾液、汗、髓液、精液或者眼淚等從體內(nèi)或體外采集到的試料中的原卟啉IX、尿卟啉I、糞卟啉I等來判斷所診斷的腦、鼻道、鼻腔、氣管、支氣管、口腔、咽、食道、胃、乳房、結(jié)腸直腸、肺、卵巢、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、膀胱、尿道、尿管、胰腺、頸管、腹腔、肛門管或者子宮頸等組織中有無腫瘤(例如，參照專利文獻2)。

此外，現(xiàn)已報告有PDD細(xì)胞學(xué)(PDDcytology)法，該法以熒光尿中的剝離細(xì)胞為對象，進行用于檢測ALA誘導(dǎo)熒光陽性細(xì)胞的熒光細(xì)胞學(xué)診斷以及流式細(xì)胞術(shù)，該熒光尿中的剝離細(xì)胞通過將從膀胱癌患者回收的尿液殘渣溶解于ALA濃度被調(diào)整到200μg/mL的無血清培養(yǎng)液中，在37℃下在暗室中保溫2個小時后再用于檢測的體外培養(yǎng)(In vitro incubation)法或者從膀胱癌患者的膀胱內(nèi)保持了2個小時后的ALA溶液(1.5gALA/50mL緩沖液)中回收的尿液殘渣用于檢測的體內(nèi)培養(yǎng)(in vivo incubation法)法進行了處理(例如，參照非專利文獻2)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：WO2009/130893號公報

專利文獻2：日本特開2006-124372號公報

非專利文獻

非專利文獻1：5－アミノレブリン酸(5－ALA)膀胱內(nèi)注入による蛍光膀胱鏡を用いた膀胱癌の光力學(xué)的診斷、井上啓史、辛島尚、鎌田雅行、執(zhí)印太郎、倉林睦、大朏祐治、日本泌尿器科學(xué)會雜誌、Vol.97、pp.719-729

非專利文獻2:膀胱癌の光力學(xué)的診斷－蛍光尿細(xì)胞診の有用性－、藤本清秀、三宅牧人、中井清、松村善昭、穴井智、平尾佳彥、日本泌尿器科學(xué)界雑誌Vol.101、No.2、総會特集號February、2010

如上所述，由于以往的尿路表皮癌的檢測要求熟練，而且存在細(xì)胞漏看多的問題，所以期待有高精度且簡易的新手法。例如，在上述的體外培養(yǎng)(In vitro incubation)法中，需要在暗黑的環(huán)境中進行培養(yǎng)的培養(yǎng)裝置，而且，在采尿后至結(jié)果出來之前，患者需要等待幾個小時。在上述體內(nèi)培養(yǎng)(in vivo incubation)法中，存在著在膀胱內(nèi)注入ALA溶液時給患者造成了負(fù)擔(dān)，且只能發(fā)現(xiàn)膀胱癌的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種不需要特殊的培養(yǎng)裝置，在采尿后立刻就能進行判斷等，可以簡單且高精度地檢測出尿路表皮癌的尿路表皮癌檢測方法。

本發(fā)明的發(fā)明者們，在使用上述ALA類的技術(shù)是否也可以應(yīng)用到尿路表皮癌的細(xì)胞診斷的構(gòu)思下，經(jīng)過反復(fù)努力研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過檢測給藥ALA類的被檢體的排出到體外的尿液中游離的癌細(xì)胞中的熒光，可以查出尿路表皮癌，而且，也發(fā)現(xiàn)該ALA類的給藥量，為過去的用于決定切除部位的用量的一半以下這樣的極少量就足夠，并據(jù)此完成了本發(fā)明。

也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種尿路表皮癌的檢測方法，其特征在于，對被檢體給藥5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽之后，從該被檢體中采集尿液，檢測所采集的尿液中的細(xì)胞內(nèi)的熒光的存在或者熒光量，(2)一種尿路表皮癌的檢測方法，其特征在于，對從給藥了5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽后的被檢體中采集的尿液進行細(xì)胞分離，檢測該細(xì)胞的熒光的存在或者熒光量，(3)如上述(1)或者(2)所述的尿路表皮癌的檢測方法，其特征在于，將5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽，用ALA鹽酸鹽換算，按每1kg被檢體給藥0.05～20mg，(4)如上述(1)或者(2)所述的尿路表皮癌的檢測方法，其特征在于，口服給藥5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽，(5)如上述(1)或者(2)所述的尿路表皮癌的檢測方法，其特征在于，被檢體是尿路表皮癌的疑似患者，(6)一種尿路表皮癌檢測劑，用于上述(1)或者(2)所述的方法，其特征在于，含有5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物或者它們的鹽。

技術(shù)效果

根據(jù)本發(fā)明，不需要特殊的培養(yǎng)裝置，可以在采尿后立刻進行判斷，而且還可以在檢測到尿液中的細(xì)胞內(nèi)的熒光的時候，判定為存在異常，可以立刻轉(zhuǎn)移到用內(nèi)視鏡診斷或者實施尿道摘除措施。例如，在進行用于確認(rèn)病癥有無復(fù)發(fā)的內(nèi)視鏡檢測之前，進行該尿液中細(xì)胞的熒光檢測，沒有可疑點的話則不必進行內(nèi)視鏡檢測。這種方法，不僅很大程度上減輕了患者的負(fù)擔(dān)，而且還減少了國民醫(yī)療費。像這樣，本發(fā)明的方法，不僅是膀胱癌，所有的尿路表皮癌的檢測都可以迅速且簡易高精度地進行，是該領(lǐng)域的醫(yī)療中劃時代的方法。而且，即使少量的ALA類的給藥量也可以檢測出來，有利于減少成本，并且還收到了不會實質(zhì)性地引起光損傷這樣安全方面的效果。

附圖說明

圖1是給藥ALA鹽酸鹽1g時從尿液中分離出的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。

圖2是給藥ALA鹽酸鹽500毫克時從尿液中分離的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。

具體實施方式

作為本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法，只要是對被檢體給藥5-氨基乙酰丙酸或其衍生物或者它們的鹽(ALA類)之后，從該被檢體中采集尿液，檢測所采集到的尿液中的細(xì)胞內(nèi)的熒光(例如，檢測熒光的存在或者熒光量)的方法；和對從給藥了5-氨基乙酰丙酸或其衍生物或者它們的鹽(ALA類)后的被檢體中采集的尿液進行細(xì)胞分離，檢測分離后的細(xì)胞中的熒光的方法，則沒有特別的限制，對于本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法，還包括收集用于檢測的數(shù)據(jù)的方法。此外，作為本發(fā)明的尿路表皮癌檢測劑只要是在上述本發(fā)明的方法中使用的、含有ALA類的尿路表皮癌檢測劑，就沒有特別的限制。此外，所謂的本發(fā)明的檢測對象的尿路表皮癌，就是覆蓋尿路(腎臟、腎盂、尿管、膀胱、尿道)內(nèi)腔的轉(zhuǎn)移上皮所發(fā)生的惡性腫瘤。此外，本發(fā)明的被檢體，可以是包括人在內(nèi)的哺乳動物，具體地說，例示了通過問診等診察疑似為尿路表皮癌的人。

ALA類中，作為ALA的衍生物，可以例舉出含有ALA的酯基和?；难苌?，優(yōu)選例舉了甲酯基和甲?；?，甲酯基和乙酰基，甲酯基和正丙醇基，甲酯基和正丁?；阴セ图柞；?，乙酯基和乙?；?，乙酯基和正丙醇基，乙酯基和正丁?；慕M合。

ALA類中，作為ALA或者其衍生物的鹽，可列舉出例如，鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽等酸附加鹽，以及鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等金屬鹽，銨鹽、烷基銨鹽等。并且，這些鹽在使用時被作為溶液使用，其作用與ALA及其衍生物是同樣的。

在這些ALA類中，優(yōu)選為5-氨基乙酰丙酸、或者5-氨基乙酰丙酸的甲酯，乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、或者它們的鹽酸鹽，磷酸鹽，硫酸鹽。以上的ALA類，既可以形成水合物或者溶劑化物，還可以是任意一種單獨或者2種以上適當(dāng)組合使用。

這些ALA類，可以通過化學(xué)合成、微生物生產(chǎn)和酶生產(chǎn)中的任意一種方法制造，在通過微生物或者酶生產(chǎn)的情況下，只有在不特別含有不合適的抑制物時，可以不提煉而直接使用。

作為這些ALA類對被檢體的給藥量，用ALA鹽酸鹽換算的話，每1kg被檢體，例如優(yōu)選為0.02～50mg，0.05～20mg，更優(yōu)選為0.2～10mg，進一步優(yōu)選為5～10mg。

作為本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法中的ALA類的給藥方法，可例舉出包括舌下給藥在內(nèi)的口服給藥，包括點滴在內(nèi)的靜脈注射，使用敷劑等經(jīng)皮膚給藥劑、栓劑、點滴等，從減輕患者負(fù)擔(dān)和增強熒光的靈敏度的觀點來講，優(yōu)選為口服給藥。

包括上述ALA類在內(nèi)的本發(fā)明的尿路表皮癌檢測劑，根據(jù)需要，也可以含有其他的藥效成分如營養(yǎng)劑、載體等其他成分。作為能夠與本發(fā)明的檢測劑相配合的載體，例舉了適于攝取的有機或者無機的固體或者液體的、通常為惰性的制藥學(xué)上可允許的載體材料，具體地說，可以例舉例如，結(jié)晶性纖維素、明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物性及動物性脂肪、油脂、橡膠，聚亞烷基二醇。作為口服給藥劑的藥劑類型，可以例舉出粉末、顆粒、藥片、膠囊、口服液、懸浮液等，它們可以適當(dāng)?shù)厥褂萌軇?、分散劑、增量劑、賦形劑等依照常法制造。并且，在以水溶液調(diào)制作為本發(fā)明的檢測劑時，為了防止ALA類分解，優(yōu)選在調(diào)制時不要讓水溶液成為堿性，若是成為堿性的情況下，可通過除氧來防止分解。

本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法，給藥ALA類(本發(fā)明的檢測劑)之后采集尿液，用熒光顯微鏡等檢測所采集的尿液中的細(xì)胞是否有熒光或熒光量，可以由此來檢測尿路表皮癌。此外，還對所采集的尿液添加ALA類，按需要放置所定的時間，通過檢測熒光的有無或者熒光量，能夠進一步提高其靈敏度。在本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法中，根據(jù)熒光的存在可以機械性地進行尿路表皮癌的檢測(判定)，因此即使是不具備醫(yī)師等特定知識的人也可以容易地進行檢測，而且，還可以使用裝置進行檢測。

尿液的采集，最好是在給藥ALA類(本發(fā)明的檢測劑)之后初次排出的尿液，優(yōu)選在1個小時以后12個小時以內(nèi)進行，更優(yōu)選在2個小時以后12個小時以內(nèi)進行。此外，尿液的攝取方法，無論是自然排尿還是通過導(dǎo)尿管攝取都可以。

在檢測細(xì)胞中的熒光時，與通常的細(xì)胞診斷一樣，從尿液中通過離心分離或者過濾來進行細(xì)胞分離。在熒光檢測時，用與俗特譜帶相當(dāng)?shù)淖贤饩€照射包括紫-藍可見光線的激發(fā)光，用熒光顯微鏡等檢測所產(chǎn)生的熒光。

實施例

以下，根據(jù)實施例對本發(fā)明更具體地進行說明，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不局限于這些示例。

[實施例1]

將ALA鹽酸鹽1g溶解到50ml的橙汁中，讓某個疑似膀胱癌患者(體重約60kg)內(nèi)服。約4個小時后采尿，在遮光狀態(tài)下馬上進行離心(3000轉(zhuǎn)/分×15分)，對沉淀進行顯微鏡檢測。其結(jié)果如圖1所示。此外，顯微鏡是在奧林巴斯(OLYMPUS)的型號為(BX50CCD)的顯微鏡中安裝了奧林巴斯(OLYMPUS)的DP70攝像機后的顯微鏡，反射鏡組均為歐米伽(OMEGA OPTICAL)公司制造的，激發(fā)濾色鏡(Exciter)為XF1076 400AF30；分光鏡(Dichroic)為XF2007 475DCLP，發(fā)射濾色鏡(Emitter)為XF3090 585ALP,均為標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡系統(tǒng)。

如圖1可知，可看見清晰的癌細(xì)胞所發(fā)出的PPIX熒光。而且，對該細(xì)胞進行通常病理診斷時正確顯示出就是癌細(xì)胞。

如上所述可知，根據(jù)本發(fā)明的方法，不用像以往那樣進行膀胱內(nèi)觀察，通過檢測尿液中的細(xì)胞的熒光，就能進行尿路表皮癌檢測?？诜o藥ALA類時，由于ALA類從血液供給到癌患部，所以不僅是癌患部，甚至在從癌患部剝離下來的癌細(xì)胞中也蓄積著來自ALA類的PPIX，這是以往所沒有想到的，但是實際上，從癌患部剝離下來的尿液中的癌細(xì)胞中也蓄積著源于ALA類的PPIX，通過檢測尿液中的細(xì)胞熒光，收到了可以檢測到尿路表皮癌這樣意想不到的效果。

[實施例2]

除了將給藥量降為實施例1的一半，即500mg以外，其他均與實施例1一樣來實施檢測法。其結(jié)果，可得出圖2的圖片。另外，對該細(xì)胞進行通常的病理診斷時正確顯示出就是癌細(xì)胞。

產(chǎn)業(yè)上利用的可能性

根據(jù)本發(fā)明的尿路表皮癌的檢測方法，減輕了患者的負(fù)擔(dān)，又可以非常迅速且簡單地進行正確的檢測，此外，由于ALA類的給藥量用以往的一半就足夠，所以可以節(jié)省費用，還可以實質(zhì)性地排除偶爾出現(xiàn)的嘔吐、肝功能障礙、光過敏等危險性，因此可以說是對尿路表皮癌的早期發(fā)現(xiàn)做出貢獻的劃時代的方法。