本發(fā)明涉及口腔醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種模擬口腔環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方法用于該環(huán)境的材料及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

繼發(fā)齲的發(fā)生是導(dǎo)致樹脂充填修復(fù)失敗的最主要原因，高齲齒風(fēng)險(xiǎn)人群的原發(fā)齲和繼發(fā)齲的發(fā)生率都遠(yuǎn)高于正常人群；唾液在促進(jìn)脫礦牙體硬組織再礦化、抑制齲病進(jìn)展的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；唾液因富含碳酸氫鹽等成分而具有強(qiáng)大的緩沖能力，可滲入細(xì)菌生物膜中，中和致齲菌的酸性產(chǎn)物，升高局部微環(huán)境的pH值；并且，唾液中富含鈣、磷離子，可降低牙體硬組織的主要成分—羥磷灰石的溶解度，促進(jìn)其再礦化；然而，大約30%的人口都會(huì)伴有口干的癥狀，原因包括酒精的過量攝入、某些藥物的服用、營養(yǎng)不良、某些系統(tǒng)性疾病、唾液腺功能障礙等；因唾液分泌總量的減少，唾液流量可能降至正常水平的15%-33%，意味著可進(jìn)入生物膜中核細(xì)菌酸性產(chǎn)物、提供鈣、磷粒子的唾液量大幅度減少；唾液量減少主要發(fā)生于老年人，研究表明，美國人根面齲的發(fā)生率隨年齡增長而升高；其中，年輕人中根面齲發(fā)生率僅為7%；而大于75歲的老年人中發(fā)病率可高達(dá)56%；另外，因頭頸部腫瘤而接受放射治療的患者會(huì)發(fā)生唾液量的急劇減少，導(dǎo)致猛性齲的發(fā)生；目前，針對唾液量減少的患者，臨床上尚無有效的防齲方法，僅能靠使用一些唾液替代物來減輕口干的癥狀，但是對于牙齒的保護(hù)作用微乎其微；因此，尋找能保護(hù)此類人群牙體硬組織的材料與方法具有極高的臨床意義；目前還沒有非常有效的實(shí)驗(yàn)方法和材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種模擬唾液量急劇減少患者口腔環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方法，和用于該口腔環(huán)境的材料及應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種模擬口腔環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

（1）配置乳酸溶液

將133mmol/L的NaCl溶液加入到50mmol/L的乳酸溶液中，直至乳酸溶液的pH值為4；

（2）將脫礦牙本質(zhì)樣本在步驟（1）得到的溶液中處理

將脫礦牙本質(zhì)樣本用步驟（1）中得到的溶液在37℃條件下進(jìn)行浸泡處理，每經(jīng)過24小時(shí)即換一次溶液，持續(xù)21天。

一種用于模擬口腔環(huán)境中的材料，其組分按重量百分比如下：含納米無定形磷酸鈣簡稱NACP的樹脂100份，樟腦醌0.2份和對-N，N-二甲氨基苯甲酸異戊酯0.8份，含納米無定形磷酸鈣的樹脂其組分按重量百分比如下：納米無定形磷酸鈣40%、鋇硼鋁硅酸鹽玻璃20%和EBPM40%，其中EBPM為乙氧化雙酚A二甲基丙烯酸酯和均苯四甲酸二酐甘油酯按質(zhì)量比為1:1構(gòu)成的混合物；鋇硼鋁硅酸鹽玻璃經(jīng)4%的3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷和2%的正丙胺硅烷化所得。

一種用于模擬口腔環(huán)境的材料的應(yīng)用，與端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液聯(lián)合使用；使用方法為將脫礦牙本質(zhì)樣本用濃度為1mg/mL的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液浸泡處理1h后，在脫礦牙本質(zhì)樣本表面接觸放置固化后的樹脂。

進(jìn)一步的，在所述環(huán)境中緩沖乳酸溶液的pH值。

進(jìn)一步的，在所述環(huán)境中釋放鈣、磷粒子。

進(jìn)一步的，在所述環(huán)境中促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)樣本再礦化。

進(jìn)一步的，在所述環(huán)境中促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)樣本硬度的恢復(fù)。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明模擬了完全無唾液的純酸性、不含鈣磷粒子的極端口腔環(huán)境，有利于開展針對唾液量下降患者齲病的防治；

（2）本發(fā)明公開了一種用于改善模擬口腔環(huán)境的材料，可臨床應(yīng)用于唾液量減少患者的齲病防治；

（3）本發(fā)明提供了一種含NACP樹脂材料的應(yīng)用方法，可以緩沖模擬口腔環(huán)境中溶液的pH，釋放鈣磷粒子，促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)再礦化；

（4）本發(fā)明所述方法操作簡單、可行性高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同換液時(shí)間后15分鐘后溶液的pH值。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同換液時(shí)間后60分鐘后溶液的pH值。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同換液時(shí)間后3小時(shí)后溶液的pH值。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同換液時(shí)間后24小時(shí)后溶液的pH值。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同時(shí)間測量的溶液中鈣離子的濃度。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境在不同時(shí)間測量的溶液中磷離子的濃度。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境處理21天后垂直于牙本質(zhì)小管方向觀察牙本質(zhì)樣本的掃描電鏡圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例3中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境處理21天后平行于牙本質(zhì)小管方向觀察牙本質(zhì)樣本的掃描電鏡圖。

圖9為本發(fā)明中實(shí)施例3中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境處理21天后牙本質(zhì)樣本表面通過EDS測得的鈣原子所占百分比。

圖10為本發(fā)明中實(shí)施例3中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境處理21天后牙本質(zhì)樣本表面通過EDS測得的磷原子所占百分比。

圖11為本發(fā)明中實(shí)施例4中四個(gè)處理組在模擬口腔環(huán)境中處理7、14和21天后牙本質(zhì)硬度變化和正常牙本質(zhì)、磷酸酸蝕后牙本質(zhì)硬度圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

下述實(shí)施例中均在模擬口腔環(huán)境中開展，模擬口腔環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方法包括以下步驟：

（1）配置乳酸溶液

將133mmol/L的NaCl溶液加入到50mmol/L的乳酸溶液中，直至乳酸溶液的pH值為4；此溶液即模擬完全無唾液、呈酸性的極端口腔環(huán)境；

（2）將脫礦牙本質(zhì)樣本在步驟（1）得到的溶液中處理

將脫礦牙本質(zhì)樣本置于一容積為1.5ml的錐形瓶中，用1ml步驟（1）中得到的溶液在37℃條件下進(jìn)行浸泡處理，每經(jīng)過24小時(shí)即換一次溶液，持續(xù)21天；此實(shí)驗(yàn)步驟中采用水浴加熱環(huán)境保證一直處于37℃條件；將脫礦牙本質(zhì)樣本經(jīng)過上述處理，即可以模擬牙齒在純酸性的無鈣磷粒子的無唾液的極端口腔環(huán)境。

一種用于模擬口腔環(huán)境中的材料，簡稱含NACP的樹脂，其組分按重量百分比如下：含納米無定形磷酸鈣的樹脂100份，樟腦醌0.2份和對-N，N-二甲氨基苯甲酸異戊酯0.8份，含納米無定形磷酸鈣的樹脂其組分按重量百分比如下：納米無定形磷酸鈣40%、鋇硼鋁硅酸鹽玻璃20%和EBPM40%，其中EBPM為乙氧化雙酚A二甲基丙烯酸酯和均苯四甲酸二酐甘油酯按質(zhì)量比為1:1構(gòu)成的混合物；其中鋇硼鋁硅酸鹽玻璃的粒度中值為1.4μm，為鋇硼鋁硅酸鹽玻璃經(jīng)4%的3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷和2%的正丙胺硅烷化所得，購自登士柏國際集團(tuán)；樟腦醌和對-N，N-二甲氨基苯甲酸異戊酯作為含環(huán)戊二烯樹脂的樹脂的光引發(fā)劑。

一種用于模擬口腔環(huán)境的材料的應(yīng)用，與端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液聯(lián)合使用；使用方法為將脫礦牙本質(zhì)樣本用濃度為1mg/mL的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶液浸泡處理1h后，在脫礦牙本質(zhì)樣本表面接觸放置固化后的樹脂；端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物采用第三代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，簡稱PAMAM，常溫、常壓下將50mgPAMAM粉末溶于50ml蒸餾水中得到1mg/mL的PAMAM溶液；第三代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物是以乙二胺為起始核心，反復(fù)與丙烯酸甲酯通過Michael加成反應(yīng)后再與乙二胺通過酰胺化反應(yīng)制備而成的；購自威海晨源化工新材料有限公司；通過噴霧干燥法得到所用的納米無定形磷酸鈣的顆粒；具體方法如下：碳酸鈣和磷酸二鈣分別溶于醋酸溶液中，得到鈣離子終濃度為8mmol/L、磷粒子終濃度為5.333mmol/L的溶液，將該溶液噴灑入一加熱器中使水和酸蒸發(fā)，靜電沉淀器收集干燥后的顆粒，此方法所得到的NACP顆粒平均粒徑為116nm。

下面實(shí)施例中脫礦牙本質(zhì)樣本的具體制備方法如下：

（1）口腔門診收集離體的健康第三磨牙，用0.005%的麝香草酚溶液消毒4h，用蒸餾水浸泡，于4℃保存；

（2）用金剛石刀片于釉牙骨質(zhì)界上方約4mm處垂直于牙長軸的方向切得4×4×1mm的牙本質(zhì)樣本；

（3）牙本質(zhì)樣本用37%的磷酸溶液浸泡處理15s，模擬牙本質(zhì)脫礦；

（4）脫礦的牙本質(zhì)樣本用蒸餾水超聲處理10min以去除表面菌斑，用PBS（phosphate-buffered saline，pH=7.4）溶液浸泡，于4℃保存。

以下實(shí)施例中將脫礦后的牙本質(zhì)樣本分為四組，每組六個(gè)樣本，每組具體處理方法如下：

（1）對照組：每一個(gè)脫礦牙本質(zhì)樣本用100μL蒸餾水浸泡處理后吹干；

（2）PAMAM組：每一個(gè)脫礦牙本質(zhì)樣本用100μLPAMAM溶液浸泡處理1h，并用蒸餾水沖洗；

（3）NACP組：每一個(gè)脫礦牙本質(zhì)樣本表面接觸放置3塊光固化后的2×2×12mm的NACP樹脂條；

（4）PAMAM+NACP組：每一個(gè)脫礦牙本質(zhì)樣本用100μLPAMAM溶液浸泡處理1h后，表面接觸放置3塊光固化后的2×2×12mm的NACP樹脂條。

實(shí)施例1

采用上述模擬口腔環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于第1、3、5、7、10、14和21天換液后的第15min、60min、3h和24小時(shí)測量四組乳酸溶液的pH；測試結(jié)果如圖1-4所示；PAMAM組和對照組中乳酸溶液的pH值基本恒定于4；NACP組和PAMAM+NACP組的pH值基本相同。

NACP組和PAMAM+NACP組的乳酸溶液在第1天，15min時(shí)升至6.0；NACP組和PAMAM+NACP組的乳酸溶液在第1天，60min時(shí)升至6.5；NACP組和PAMAM+NACP組的乳酸溶液在第1天，3h時(shí)升至6.9；從第一天到第21天所測得的溶液pH值略有下降；NACP組和PAMAM+NACP組在第21天，15min時(shí)pH值升至5.5；3h時(shí)升至6.5；說明含有NACP的樹脂能較強(qiáng)的緩沖酸性溶液的pH值，改善牙本質(zhì)再礦化的環(huán)境。

實(shí)施例2

采用上述模擬口腔環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于第1、3、5、7、10、14和21天后用分光光度法測量四組乳酸溶液中鈣、磷離子濃度；每次測量時(shí)取1ml溶液進(jìn)行測量；測量結(jié)果如圖5和圖6所示；PAMAM組和對照組溶液中鈣磷粒子濃度都基本恒定于0；NACP組和PAMAM+NACP組中鈣、磷離子濃度基本一致。

NACP組和PAMAM+NACP組溶液中鈣離子濃度為第1天為37mmol/L，第21天為6mmol/L，磷離子濃度第1天為15mmol/L，第21天為3mmol/L；說明含有NACP的樹脂能在純酸性、無鈣磷粒子的溶液中釋放壓本質(zhì)再礦化所必需的鈣、磷離子。

實(shí)施例3

采用上述模擬口腔環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)21天后，每個(gè)樣本用金剛石刀片切為兩半，一半用于檢測橫斷面（垂直于牙本質(zhì)小管方向），另一半用于檢測縱斷面（平行于牙本質(zhì)小管的方向）；每份樣本浸泡于含1%戊二醛的PBS溶液中于4℃保存4h，然后用梯度乙醇脫水，100%的六甲基二硅胺沖洗后噴金；用掃描電鏡觀察樣本，同時(shí)用能量色散譜儀檢測化學(xué)元素組分；其掃描電鏡檢測結(jié)果如圖7和圖8所示；化學(xué)元素組分結(jié)果如圖9和圖10所示；圖7中A圖表示對照組垂直于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖；圖C為其局部放大圖；圖7中B圖表示PAMAM組垂直于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖，圖D為其局部放大圖；圖7中E圖表示NACP組垂直于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖，圖G為其局部放大圖；圖7中F圖表示PAMAM+NACP組垂直于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖，圖H為其局部放大圖；圖8中I圖表示對照組平行于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖；圖K為其局部放大圖；圖8中J圖表示PAMAM組平行于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖；圖L為其局部放大圖；圖8中M圖表示ANCP組平行于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖；圖O為其局部放大圖；圖8中I圖表示PAMAM+NACP組平行于牙本質(zhì)小管方向的掃描電鏡圖；圖P為其局部放大圖；如圖7和圖8所示PAMAM組和對照組的樣本中牙本質(zhì)小管開放，無礦物沉淀，高倍鏡下可見暴露的牙本質(zhì)膠原纖維；NACP組樣本中，可見少量礦物沉積于牙本質(zhì)小管中；PAMAM+NACP組中，大量針狀礦物沉積于牙本質(zhì)小管中，封閉牙本質(zhì)小管，在距表面30μm的深度仍可觀測到再礦化的發(fā)生。

對照組和PAMAM組EDS圖未見鈣磷元素峰；NACP組EDS圖可見鈣磷元素峰；PAMAM+NACP組EDS圖可見強(qiáng)鈣磷元素峰；牙本質(zhì)表面鈣原子所占百分比如圖9所示，牙本質(zhì)表面磷原子所占百分比如圖10所示；說明PAMAM溶液與NACP樹脂聯(lián)用可在本發(fā)明所述唾液量急劇減少患者口腔環(huán)境中較好的促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)再礦化。

實(shí)施例4

采用上述模擬口腔環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于第7、14、21天測量四組牙本質(zhì)樣本的硬度，維氏金剛石探頭以20g的負(fù)載在樣本上停留10s以測量硬度，每個(gè)樣本測量6次；同時(shí)也測量健康牙本質(zhì)樣本，磷酸酸蝕脫礦后的牙本質(zhì)樣本的硬度作為對照，結(jié)果如圖11所示；正常牙本質(zhì)的硬度為0.57GPa，磷酸酸蝕脫礦后的牙本質(zhì)硬度為0.32GPa；PAMAM組和對照組的牙本質(zhì)硬度在第7天時(shí)將至0.2GPa；第21天時(shí)將至0.1GPa；PAMAM+NACP組牙本質(zhì)硬度在第7天時(shí)升至0.43GPa，第14天時(shí)將至0.49GPa，第21天時(shí)升至0.53GPa；與正常牙本質(zhì)硬度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說明PAMAM溶液與NACP樹脂聯(lián)用可在本發(fā)明模擬的極端口腔環(huán)境中促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)硬度的恢復(fù)。

本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模擬唾液量急劇減少患者口腔環(huán)境的牙本質(zhì)再礦化實(shí)驗(yàn)方法，能在體外較好地模擬完全無唾液的極端口腔環(huán)境；并且PAMAM溶液和NACP樹脂的聯(lián)用可在此極端環(huán)境中，釋放鈣磷粒子，促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)再礦化；為今后針對唾液量急劇減少患者齲齒病防治的材料研究提供了新的模型與思路。