本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的一種特殊抗體分泌細(xì)胞檢測(cè)方法，特別涉及一種檢測(cè)外周血乙肝表面抗體分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
乙肝表面抗體(抗-HBs)是機(jī)體對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)獲得免疫保護(hù)的標(biāo)志，在HBV的清除及預(yù)防再感染過(guò)程中具有十分重要的作用。外周血中抗-HBs由漿細(xì)胞分泌，機(jī)體在受到乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后，B細(xì)胞成熟分化為分泌抗-HBs的漿細(xì)胞和不分泌抗體的記憶B細(xì)胞，漿細(xì)胞壽命短暫，而記憶B細(xì)胞則可在無(wú)抗原刺激的情況下長(zhǎng)期存活，但其數(shù)量在外周血中極少。在機(jī)體再次受到HBsAg刺激后，記憶B細(xì)胞迅速增殖分化為漿細(xì)胞分泌抗-HBs。
在健康人群中，經(jīng)正規(guī)免疫預(yù)防接種HBV疫苗后，血清抗-HBs水平會(huì)逐漸下降，當(dāng)血清抗-HBs低于檢測(cè)水平時(shí)，其對(duì)于人體是否仍有免疫保護(hù)作用仍存在爭(zhēng)論。目前有證據(jù)表明，經(jīng)正規(guī)免疫預(yù)防接種HBV疫苗的健康個(gè)體即使抗-HBs下降至無(wú)法檢測(cè)到的水平，機(jī)體獲得的免疫保護(hù)仍然持續(xù)存在，這是由于體內(nèi)存在著不易被檢測(cè)到的記憶性B細(xì)胞，因而外周血抗-HBs分泌細(xì)胞數(shù)量可能比血清抗-HBs水平更能反映機(jī)體對(duì)HBV的持續(xù)性免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明做出之前，目前外周血抗-HBs分泌細(xì)胞的檢測(cè)困難之處在于：
(1)外周血抗-HBs分泌細(xì)胞數(shù)量少，檢出率低，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差；
(2)有限稀釋法檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、難度大，且需要采取的外周血量多，難以進(jìn)行推廣應(yīng)用；
(3)外周血中除了漿細(xì)胞直接分泌抗體之外，記憶B細(xì)胞需經(jīng)過(guò)刺激活化才能分化為抗體分泌細(xì)胞，因而在未經(jīng)充分活化時(shí)，外周血抗-HBs分泌細(xì)胞極難檢出，而現(xiàn)有活化及檢測(cè)外周血抗-HBs分泌細(xì)胞的技術(shù)存在諸多不足，例如CPG、CD40L、美洲商陸絲裂原等B細(xì)胞體外活化方法，均存在活化效率不高的問(wèn)題，不能使B細(xì)胞充分轉(zhuǎn)化為抗體分泌細(xì)胞，降低了抗-HBs分泌細(xì)胞的檢出率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，建立一種檢測(cè)外周血乙肝表面抗體分泌細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種檢測(cè)外周血乙肝表面抗體分泌細(xì)胞的方法，其主要技術(shù)特征在于通過(guò)體外刺激活化人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再采用預(yù)處理的PVDF板檢測(cè)PBMC中抗-HBs分泌細(xì)胞，檢測(cè)到一百萬(wàn)個(gè)PBMC中的一個(gè)抗-HBs分泌細(xì)胞。
具體包括以下步驟：(1)無(wú)菌收集人外周血；(2)淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血，獲得PBMC；(3)將PBMC采用特殊方法培養(yǎng)活化；(4)收集培養(yǎng)細(xì)胞，加入預(yù)處理的PVDF板中，放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；(5)取出PVDF板，洗去細(xì)胞，顯色；(6)檢測(cè)和計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，分析外周血抗-HBs分泌細(xì)胞比例。
所述步驟(3)中采用1μg/mlR848，10ng/ml IL-2，2μg/ml HBsAg刺激活化PBMC，細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為5天。
所述步驟(4)中采HBsAg預(yù)處理包被的PVDF板孵育細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為16-24小時(shí)。
所述PVDF板采用經(jīng)乙醇預(yù)處理，每孔加10μg/ml HBsAg 200μl，設(shè)加15μg/ml的抗人IgG陽(yáng)性對(duì)照孔和加PBS的陰性對(duì)照孔，4℃孵育過(guò)夜。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于用R848、HBsAg和IL-2刺激活化人外周血B細(xì)胞，并用HBsAg預(yù)包被的PVDF板捕獲人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞，減少了檢測(cè)用血量，提高了檢測(cè)的敏感度，縮短記憶B細(xì)胞活化及乙肝表面抗體分泌細(xì)胞檢測(cè)所需時(shí)間。
本發(fā)明的其它具體優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)說(shuō)明。
附圖說(shuō)明
圖1——本發(fā)明中人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果示意圖：
其中，a為陽(yáng)性對(duì)照：人外周血總IgG分泌細(xì)胞/每2500個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)示意圖；b為檢測(cè)到的人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞/每200000個(gè)PBMC示意圖；c為檢測(cè)到的人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞/每400000個(gè)PBMC示意圖；d為陰性對(duì)照示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的技術(shù)思路是：
用R848、HBsAg和IL-2刺激外周血人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，活化B細(xì)胞后采用PVDF板捕獲人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞，經(jīng)顯色處理后進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。
下面具體說(shuō)明本發(fā)明：
一、B細(xì)胞刺激活化
(1)無(wú)菌收集人外周血；
(2)淋巴細(xì)胞分離液分離獲得PBMC；
(3)將PBMC用含10％胎牛血清，1μg/ml R848，2μg/ml HBsAg，10ng/ml IL-2的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度2×106/ml，放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)5天。
二、PVDF板檢測(cè)人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞
(1)10μg/ml的HBsAg包被PVDF板，同時(shí)設(shè)加15μg/ml的抗人IgG陽(yáng)性對(duì)照孔和加PBS的陰性對(duì)照孔，4℃過(guò)夜；
(2)收集培養(yǎng)5天的細(xì)胞，含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸，加入PVDF板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1-4×105，放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)16-24小時(shí)；
(3)棄去細(xì)胞，PBS洗板，加入1μg/ml的檢測(cè)抗體抗人IgG(與包被抗人IgG不同亞型及克隆號(hào))，室溫孵育2小時(shí)；
(4)棄去多余抗體，PBS洗板，加入1∶1000稀釋的Streptavidin-HRP，室溫孵育1小時(shí)；
(5)PBS洗板，加TMB顯色反應(yīng)，直到明顯的斑點(diǎn)出現(xiàn)，大量水沖洗終止顯色反應(yīng)；
(6)避光晾干板，計(jì)數(shù)抗人IgG對(duì)照孔、HBsAg包被孔和陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)，計(jì)算抗-HBs分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)及比例。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于采用R848、HBsAg和IL-2高效刺激活化人外周血B細(xì)胞，并用HBsAg預(yù)包被的PVDF板捕獲人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞，提高了檢測(cè)的敏感度，縮短記憶B細(xì)胞活化和檢測(cè)乙肝表面抗體分泌細(xì)胞所需時(shí)間。
具體而言：
一、B細(xì)胞刺激活化
1.無(wú)菌收集人外周血10ml(肝素抗凝)，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得PBMC，用1640培養(yǎng)液重懸，并計(jì)數(shù)，可得到PBMC 1×107；
2.在室溫下1500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，去上清，以洗滌細(xì)胞；
3.用含10％胎牛血清，1μg/mlR848，2μg/ml HBsAg，10ng/ml IL-2的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)5天。
二、PVDF板檢測(cè)人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞
A.包被PVDF板(無(wú)菌)
1.PVDF板每孔加50μl 70％乙醇預(yù)濕不超過(guò)2分鐘，迅速洗板；
2.無(wú)菌水200μl/孔洗板5次；
3.每孔加10μg/ml HBsAg，陽(yáng)性對(duì)照孔加15μg/ml抗人IgG，陰性對(duì)照孔加PBS，4℃孵育過(guò)夜。
B.細(xì)胞孵育(無(wú)菌)
1.無(wú)菌PBS 200μl/孔洗板5次，洗去過(guò)量的抗原或抗體；
2.每孔加200μl含10％FBS+2％白蛋白的1640培養(yǎng)基封閉。室溫孵育2小時(shí)；
3.收集培養(yǎng)5天的細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，棄上清。1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)；
4.含10％FBS的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入PVDF板中，每孔細(xì)胞數(shù)1-4×105；
5.將板放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)孵育16-24小時(shí)，期間避免移動(dòng)板。
C.檢測(cè)抗-HBs分泌細(xì)胞斑點(diǎn)：(不需無(wú)菌)
1.PBS 200μl/孔洗PVDF板5次，洗去細(xì)胞；
2.加入100μl/孔1μg/ml的檢測(cè)抗體抗人IgG(與包被抗人IgG不同亞型及克隆號(hào))，室溫孵育2小時(shí)；
3.洗板同1；
4.加入100μl/孔1∶1000稀釋的Streptavidin-HRP，室溫孵育1小時(shí)；
5.洗板同1；
6.加100μl/孔TMB顯色反應(yīng)，直到明顯的斑點(diǎn)出現(xiàn)；
7.大量水沖洗以停止顯色反應(yīng)；
8.避光晾干板，計(jì)數(shù)抗人IgG對(duì)照孔、HBsAg包被孔和陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)，計(jì)算抗-HBs分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)及比例。
在HBsAg、R848及IL-2刺激培養(yǎng)人外周血PBMC，使外周血B細(xì)胞活化，記憶B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，5天后預(yù)包被HBsAg的PVDF板捕獲人外周血抗-HBs分泌細(xì)胞，顯色處理后如圖1所示，a為陽(yáng)性對(duì)照，b、c分別為每2×105個(gè)PBMC、每4×105個(gè)PBMC檢測(cè)出的抗-HBs分泌細(xì)胞，d為陰性對(duì)照。