本發(fā)明涉及一種測量細(xì)胞懸液電特性的方法，具體涉及一種利用電聲脈沖法測量細(xì)胞懸液電特性的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞膜是與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換的通路，是細(xì)胞最重要的細(xì)胞器。細(xì)胞膜電特性主要與細(xì)胞膜內(nèi)、外離子濃度差有關(guān)，研究和了解細(xì)胞膜電特性具有重要意義，其關(guān)系到生命的生存與否，可以揭示生命的奧秘，促進(jìn)生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等學(xué)科的發(fā)展。

目前，針對(duì)細(xì)胞膜電特性的研究主要有細(xì)胞電泳法、電化學(xué)阻抗法、膜片鉗技術(shù)等方法。細(xì)胞電泳法是在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生涌動(dòng)，根據(jù)細(xì)胞的電泳淌度來檢測細(xì)胞膜電特性，它主要存在操作較繁瑣、所需時(shí)間較長、重復(fù)性和靈敏度較差等缺點(diǎn)。熒光顯微鏡法是一種利用熒光染料在特定波長的激發(fā)下熒光強(qiáng)度的變化來表征細(xì)胞膜電位的變化，此方法熒光染料對(duì)溫度和光照要求苛刻、操作過程復(fù)雜、重復(fù)性和精度差等缺點(diǎn)。膜片鉗技術(shù)是一種利用微玻璃管電極接觸細(xì)胞膜(1-3個(gè)離子通道、幾個(gè)平方微米)以記錄通過細(xì)胞膜離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一或多個(gè)離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)。這種方法雖然精度很高，但是設(shè)備昂貴、耗時(shí)耗力、無法獲取細(xì)胞集群整體的電活動(dòng)狀態(tài)。

本發(fā)明提出的電聲脈沖法是將細(xì)胞懸液置于脈沖電場電磁環(huán)境中，檢測的聲信號(hào)不會(huì)受到電磁場的干擾，經(jīng)壓電傳感器轉(zhuǎn)換后得到電信號(hào)，因此可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測細(xì)胞懸液的電特性。電聲脈沖法(PulsedElectro-Acoustic Method，PEA)是一種目前在國際上應(yīng)用較多的介質(zhì)材料中空間電荷測量技術(shù)。PEA測量原理如圖3所示，假定在厚度為d的平板試樣中存在空間電荷ρ，如果在電極1與電極2之間施加一個(gè)脈寬為△T的電脈沖U，電脈沖作用在位于x處的空間電荷ρ(x)的小薄片△x上，產(chǎn)生的力為△f₃(t)。這個(gè)力作用于電荷ρ(x)使其輕微移動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)聲脈沖△P₃(x，t)，沿電場方向傳播通過試樣與電極2到達(dá)壓電傳感器。通過壓電傳感器將聲波P(t)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)V(t)。假定作用在樣品內(nèi)所有電荷上的力與周圍介質(zhì)和電極緊密耦合在一起，并且電脈沖是理想的陡脈沖，壓電傳感器和前置放大器也是理想的，則前置放大器的輸出電壓V_s(t)與空間電荷的分布ρ(t)呈線性關(guān)系。那么通過PEA方法測量得到V_s(t)就可以得到空間電荷分布。

到目前為止，PEA方法主要用于固體薄膜材料和電纜絕緣層中空間電荷分布的測量與研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用電聲脈沖法測量細(xì)胞懸液電特性的方法，該方法提出了“三層復(fù)合介質(zhì)模型”，將細(xì)胞懸液置于兩層厚度為150-180μm的低密度聚乙烯(LDPE)固體薄膜之間，通過電極1和電極2給試樣施加千伏級(jí)的偏置電壓和納秒級(jí)脈沖電信號(hào)，偏置電壓要確保細(xì)胞膜不被擊穿(細(xì)胞膜的擊穿場強(qiáng)為10³kV)。在電極2處通過聚四氟乙烯(PVDF)壓電傳感器將檢測到的聲波信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，最后通過分析計(jì)算得到細(xì)胞膜電特性，該方法的基本原理是電介質(zhì)材料中存在的空間電荷在外加脈沖電場的作用下會(huì)受力產(chǎn)生位移，形成機(jī)械波，通過壓電傳感器將含有空間電荷信息的聲信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，即可以研究電介質(zhì)材料中的空間電荷分布情況。而細(xì)胞與外界發(fā)生物質(zhì)、能量和信息交換的過程均與細(xì)胞膜電特性有著密切關(guān)系。該方法不但實(shí)現(xiàn)設(shè)備簡單、操作容易，而且對(duì)細(xì)胞沒有任何損傷。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種利用電聲脈沖法測量細(xì)胞懸液電特性的方法，包括以下方法：

1)建立三層復(fù)合介質(zhì)模型，由兩層低密度聚乙烯(LDPE)薄膜外設(shè)置電極組成，在兩層低密度聚乙烯(LDPE)薄膜中間放置待測細(xì)胞懸液；

2)為了簡化計(jì)算需做如下假設(shè)：

a)認(rèn)為低密度聚乙烯(LDPE)薄膜是完全均勻的；

b)在三層介質(zhì)模型中，由于細(xì)胞層很薄，而且測量時(shí)夾于電極之間，認(rèn)為細(xì)胞層呈單層排列，是一層由細(xì)胞和鹽溶液均勻分布的混合電介質(zhì)；

c)所需細(xì)胞懸液是經(jīng)大鼠尾部采集的新鮮血液經(jīng)過離心處理后，將紅細(xì)胞與生理鹽水配制成需要濃度；

3)確保測量模型的準(zhǔn)確性；

假設(shè)，當(dāng)施加的偏置電壓U＝0時(shí)，低密度聚乙烯中不會(huì)產(chǎn)生空間電荷，電極也沒有給細(xì)胞懸液試樣注入電荷，由于聚乙烯和理想單細(xì)胞層的介電常數(shù)不一樣，由于界面效應(yīng)在分界面上會(huì)產(chǎn)生界面自由電荷，其電荷面密度由式(1)表示為：

式中，d₁＝180μm，d₂≈10μm，ε_r1≈2.2，ε_r2≈75，ε₀＝8.85×10^-12F/mγ₁＝10^-14S/m，γ₂＝10^-10S/m，

則從低密度聚乙烯到細(xì)胞層的界面上的界面電荷由式(2)表示為：

而從細(xì)胞層到低密度聚乙烯的界面上的界面電荷由式(3)表示為：

由此可知，在細(xì)胞與聚乙烯的兩個(gè)分界面上都會(huì)產(chǎn)生界面電荷，但它們大小相等，極性相反，此外，當(dāng)電荷密度很小，在不施加偏置電壓時(shí)對(duì)于這些界面電荷的影響可以忽略；

兩個(gè)分界面上的界面電荷在低密度聚乙烯中產(chǎn)生的電場強(qiáng)度由式(4)、式(5)分別進(jìn)行計(jì)算：

而由理想單細(xì)胞層細(xì)胞膜上的電荷在低密度聚乙烯中產(chǎn)生的電場強(qiáng)度由式(6)、式(7)表示為：

其中細(xì)胞膜電荷一般為σ_Cell＝0.533×10^-10C/m²，為細(xì)胞單層排列時(shí)的面密度。

由電場的疊加原理可得：

E_PE＝E₁+E₂+E_C (7)

可得低密度聚乙烯中的電場強(qiáng)度由式(8)表示為：

由此可見，理想單細(xì)胞層的引入產(chǎn)生的界面效應(yīng)對(duì)測量波形沒有影響，反映在波形變化上就只有理想細(xì)胞層帶電產(chǎn)生。

進(jìn)一步，三層復(fù)合介質(zhì)模型當(dāng)施加了偏置電壓后，達(dá)壓電傳感器處聲波信號(hào)的檢測，用聲壓表示，聲波在三層復(fù)合介質(zhì)中的傳播，壓電傳感器檢測到的聲強(qiáng)由為式(9)表示為：

式中，K為界面反射系數(shù)，T為透射系數(shù)，α1：聲波在細(xì)胞懸液中的衰減系數(shù)；α為聲波在聚乙烯中的衰減因子；Z：波阻抗，Z＝ρc，ρ為介質(zhì)密度/kg·m^-3，c為聲波在介質(zhì)中傳播速度/m·s^-1；x：聲波產(chǎn)生點(diǎn)到電極2的距離/μm；

聲波信號(hào)經(jīng)反射、透射經(jīng)壓電傳感器檢測并轉(zhuǎn)換、放大后成電壓信號(hào)，兩者之間具有線性關(guān)系比例系數(shù)為k，檢測的電壓信號(hào)可以按式(10)計(jì)算：

U＝k·P (10)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提出了“三層復(fù)合介質(zhì)模型”，將細(xì)胞懸液置于兩層厚度為150-180μm的低密度聚乙烯(LDPE)固體薄膜之間，通過電極給試樣施加千伏級(jí)的偏置電壓和納秒級(jí)脈沖電信號(hào)，偏置電壓要確保細(xì)胞膜不被擊穿(細(xì)胞膜的擊穿場強(qiáng)為10³kV)，在電極處通過聚四氟乙烯(PVDF)壓電傳感器將檢測到的聲波信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，最后通過分析計(jì)算得到細(xì)胞膜電特性。該方法不但實(shí)現(xiàn)設(shè)備簡單、操作容易，而且對(duì)細(xì)胞沒有任何損傷。將傳統(tǒng)電聲脈沖法應(yīng)用于研究細(xì)胞懸液電特性的研究，可以無損監(jiān)測細(xì)胞膜電特性的動(dòng)態(tài)變化情況，為電生理學(xué)研究提供一種全新的測量方法。為電生理學(xué)的研究提供一種全新的測量手段，有助于揭示細(xì)胞與外電場交互過程的物理本質(zhì)提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為三層復(fù)合介質(zhì)模型示意圖。

圖2為聲波在三層復(fù)合介質(zhì)中傳播模型示意圖，其中P_e2-PE:電極2/聚乙烯A分界面處的聲壓；P_ρA:空間電荷ρ_A處的聲壓；P_A-B:電介質(zhì)A/電介質(zhì)B分界面處的聲壓；P_KA-B:表面電荷K_A-B處的聲壓；P_ρB:空間電荷ρ_B處的聲壓；P_e1-PE:電極1/聚乙烯B分界面處的聲壓；ε：介質(zhì)的介電常數(shù)。

圖3為PEA測量原理示意圖。

圖4為SD大鼠紅細(xì)胞顯微圖片

圖5為不同體積細(xì)胞懸液試樣在10kV/mm電場下測量曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步敘述。

一種利用電聲脈沖法測量細(xì)胞懸液電特性的方法，包括以下方法：

1)建立三層復(fù)合介質(zhì)模型，由兩層低密度聚乙烯(LDPE)薄膜外設(shè)置電極組成，在兩層低密度聚乙烯(LDPE)薄膜中間放置待測細(xì)胞懸液；

2)為了簡化計(jì)算需做如下假設(shè)：

a)認(rèn)為低密度聚乙烯(LDPE)薄膜是完全均勻的；

b)在三層介質(zhì)模型中，由于細(xì)胞層很薄，而且測量時(shí)夾于電極之間，認(rèn)為細(xì)胞層呈單層排列，是一層由細(xì)胞和鹽溶液均勻分布的混合電介質(zhì)；

c)所需細(xì)胞懸液是經(jīng)大鼠尾部采集的新鮮血液經(jīng)過離心處理后，將紅細(xì)胞與生理鹽水配制成需要濃度；

3)確保測量模型的準(zhǔn)確性；

假設(shè)，當(dāng)施加的偏置電壓U＝0時(shí)，低密度聚乙烯中不會(huì)產(chǎn)生空間電荷，電極也沒有給細(xì)胞懸液試樣注入電荷，由于聚乙烯和理想單細(xì)胞層的介電常數(shù)不一樣，由于界面效應(yīng)在分界面上會(huì)產(chǎn)生界面自由電荷，其電荷面密度由式(1)表示為：

式中，d₁＝180μm，d₂≈10μm，ε_r1≈2.2，ε_r2≈75，ε₀＝8.85×10^-12F/mγ₁＝10^-14S/m，γ₂＝10^-10S/m，

則從低密度聚乙烯到細(xì)胞層的界面上的界面電荷由式(2)表示為：

而從細(xì)胞層到低密度聚乙烯的界面上的界面電荷由式(3)表示為：

由此可知，在細(xì)胞與聚乙烯的兩個(gè)分界面上都會(huì)產(chǎn)生界面電荷，但它們大小相等，極性相反，此外，當(dāng)電荷密度很小，在不施加偏置電壓時(shí)對(duì)于這些界面電荷的影響可以忽略；

兩個(gè)分界面上的界面電荷在低密度聚乙烯中產(chǎn)生的電場強(qiáng)度由式(4)、式(5)分別進(jìn)行計(jì)算：

而由理想單細(xì)胞層細(xì)胞膜上的電荷在低密度聚乙烯中產(chǎn)生的電場強(qiáng)度由式(6)、式(7)表示為：

其中細(xì)胞膜電荷一般為σ_Cell＝0.533×10^-10C/m²，為細(xì)胞單層排列時(shí)的面密度。

由電場的疊加原理可得：

E_PE＝E₁+E₂+E_C (7)

可得低密度聚乙烯中的電場強(qiáng)度由式(8)表示為：

由此可見，理想單細(xì)胞層的引入產(chǎn)生的界面效應(yīng)對(duì)測量波形沒有影響，反映在波形變化上就只有理想細(xì)胞層帶電產(chǎn)生。

進(jìn)一步，三層復(fù)合介質(zhì)模型當(dāng)施加了偏置電壓后，達(dá)壓電傳感器處聲波信號(hào)的檢測，用聲壓表示，聲波在三層復(fù)合介質(zhì)中的傳播，壓電傳感器檢測到的聲強(qiáng)由為式(9)表示為：

式中，K為界面反射系數(shù)，T為透射系數(shù)，α1：聲波在細(xì)胞懸液中的衰減系數(shù)；α為聲波在聚乙烯中的衰減因子；Z：波阻抗，Z＝ρc，ρ為介質(zhì)密度/kg·m^-3，c為聲波在介質(zhì)中傳播速度/m·s^-1；x：聲波產(chǎn)生點(diǎn)到電極2的距離/μm；

聲波信號(hào)經(jīng)反射、透射經(jīng)壓電傳感器檢測并轉(zhuǎn)換、放大后成電壓信號(hào)，兩者之間具有線性關(guān)系比例系數(shù)為k，檢測的電壓信號(hào)可以按式(10)計(jì)算：

U＝k·P (10)。

(1)實(shí)施例1

SD大鼠紅細(xì)胞懸液電特性檢測

實(shí)驗(yàn)材料：從SD大鼠尾部取出一定量(50μL)的新鮮血液，家肝素鈉，離心機(jī)離心處理10min，3000r/min，棄上層血清。將紅細(xì)胞用0.9％生理鹽水稀釋后，二次放入離心機(jī)離心處理15min，3000r/min，棄上層清液。隨后將紅細(xì)胞進(jìn)行稀釋后配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液待用。

圖4為SD大鼠紅細(xì)胞顯微圖片，放大倍數(shù)為1000。細(xì)胞濃度為6.4×10⁵個(gè)/L，基本呈現(xiàn)出單細(xì)胞層排列狀態(tài)。

圖5為不同體積細(xì)胞懸液試樣在10kV/mm電場下測量曲線。從圖5可以看出在固定的直流偏壓和脈沖電場作用下，可以定量檢測出SD大鼠血紅細(xì)胞的帶電量，且紅細(xì)胞帶電量與其體積成正比。