本發(fā)明涉及一種以人血清為基質(zhì)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具體說是涉及一種血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)糖尿病患病率呈迅速增加趨勢(shì)，由糖尿病導(dǎo)致的微血管并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、神經(jīng)病變和糖尿病足)及大血管并發(fā)癥(心、腦血管疾病)的發(fā)生率、致殘率和致死率極高，嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生存質(zhì)量甚至生命，也給醫(yī)療資源和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大的負(fù)擔(dān)，因此，臨床準(zhǔn)確測(cè)定血清中葡萄糖的濃度，是糖尿病的早期診斷以及糖尿病患者血糖水平合理控制是關(guān)鍵所在。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于校準(zhǔn)測(cè)量系統(tǒng)、評(píng)價(jià)測(cè)量程序或?yàn)椴牧腺x值。隨著臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)化學(xué)標(biāo)本檢測(cè)量的增加，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需要量也相應(yīng)大量增加。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備途徑主要有：人工合成、自然界物質(zhì)提純、人或動(dòng)物組織來源提純品或者基因工程重組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。作為質(zhì)控物質(zhì)，最好選用天然的物質(zhì)，與待測(cè)標(biāo)本具有盡可能的相似性，否則將不具有充分的代表性。因此研制臨床檢驗(yàn)用的人血清質(zhì)冰凍混合血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種有良好均勻性、穩(wěn)定性及互通性，符合《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》及ISO Guide35的要求，采用新鮮血液制備，來源廣泛，制備方法簡(jiǎn)單的血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟：

(1)血清的制備：起始原料來源健康捐助者血液，每個(gè)捐助者抽取全血后，得到血清量為110-170毫升；

(2)血清的處理：將各捐助者的血清混合，添加純葡萄糖物質(zhì)至目標(biāo)濃度5-7mmol/L，離心以實(shí)現(xiàn)均一、澄清的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”；

所述的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”經(jīng)無菌過濾后分裝于經(jīng)滅菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，-70℃冰凍儲(chǔ)存；得到互通性良好、均一穩(wěn)定、量值溯源可靠的、濃度水平為5-7mmol/L人血清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

作為優(yōu)選：所述的健康捐助者選擇標(biāo)準(zhǔn)為年齡20-50歲、血脂水平適當(dāng)、人類免疫缺陷病毒抗體和乙型、丙型肝炎表面抗原陰性；每個(gè)捐助者抽取300-400毫升全血，平均得到血清量為140毫升。

作為優(yōu)選：所述的健康捐助者在餐前抽血，收集于干燥的、不含任何添加劑的離子瓶中，放置在室溫下凝血3-4小時(shí)，在2000～3000g下離心20分鐘，從血塊中分離出血清。

血清混合后測(cè)定葡萄糖初濃度，添加純葡萄糖物質(zhì)至目標(biāo)濃度，在6000～9000g下離心20分鐘，取上清液以盡量去除血清樣本中的凝血、纖維蛋白等成分，目測(cè)為清晰、淡黃色且無顆粒物質(zhì)，紫外分光光度儀在波長(zhǎng)710nm、比色皿1厘米條件下吸光度A不超過0.5，若不符合則繼續(xù)在6000～9000g下離心20分鐘。

作為優(yōu)選：所述的添加純葡萄糖物質(zhì)為編號(hào)GBW10062的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；葡萄糖濃度的定值方法為氣相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法。

作為優(yōu)選：所述“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”在生物安全柜中進(jìn)行負(fù)壓抽吸過濾，血清依次經(jīng)過0.45、0.22μm等親水膜進(jìn)行無菌過濾。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)存在如下技術(shù)效果：該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性、穩(wěn)定性及互通性，符合《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》及ISO Guide35的要求；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用新鮮血液制備，來源廣泛，制備簡(jiǎn)單，使用方便；在-70℃可長(zhǎng)期儲(chǔ)存，對(duì)于常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)的溯源和質(zhì)量評(píng)價(jià)以及協(xié)作研究分析中的質(zhì)量保證都可發(fā)揮作用，具有很大的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明所述的一種血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，該制備方法包括以下步驟：

(1)血清的制備：起始原料來源健康捐助者血液，每個(gè)捐助者抽取全血后，得到血清量為110-170毫升；

(2)血清的處理：將各捐助者的血清混合，添加純葡萄糖物質(zhì)至目標(biāo)濃度5-7mmol/L，離心以實(shí)現(xiàn)均一、澄清的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”；

所述的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”經(jīng)無菌過濾后分裝于經(jīng)滅菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，-70℃冰凍儲(chǔ)存；得到互通性良好、均一穩(wěn)定、量值溯源可靠的、濃度水平為5-7mmol/L人血清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

本發(fā)明所述的健康捐助者選擇標(biāo)準(zhǔn)為年齡20-50歲、血脂水平適當(dāng)、人類免疫缺陷病毒抗體和乙型、丙型肝炎表面抗原陰性；每個(gè)捐助者抽取300-400毫升全血，平均得到血清量為140毫升。

本發(fā)明所述的健康捐助者在餐前抽血，收集于干燥的、不含任何添加劑的離子瓶中，放置在室溫下凝血3-4小時(shí)，在2000～3000g下離心20分鐘，從血塊中分離出血清。

血清混合后測(cè)定葡萄糖初濃度，添加純葡萄糖物質(zhì)至目標(biāo)濃度，在6000～9000g下離心20分鐘，取上清液以盡量去除血清樣本中的凝血、纖維蛋白等成分，目測(cè)為清晰、淡黃色且無顆粒物質(zhì)，紫外分光光度儀在波長(zhǎng)710nm、比色皿1厘米條件下吸光度A不超過0.5，若不符合則繼續(xù)在6000～9000g下離心20分鐘。

所述的添加純葡萄糖物質(zhì)為編號(hào)GBW10062的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；葡萄糖濃度的定值方法為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)(JCTLM)認(rèn)可公布的一級(jí)參考測(cè)量方法(氣相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法)，可確保相關(guān)測(cè)量工作的溯源性。

本發(fā)明所述的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”在生物安全柜中進(jìn)行負(fù)壓抽吸過濾，血清依次經(jīng)過0.45、0.22μm等親水膜進(jìn)行無菌過濾。

實(shí)施例：本發(fā)明所述的血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法包括以下步驟：

(1).血清的制備：起始原料來源健康捐助者血液。健康捐助者選擇標(biāo)準(zhǔn)為年齡20-50歲、血脂水平適當(dāng)、人類免疫缺陷病毒抗體和乙型、丙型肝炎表面抗原陰性，共選取4名捐助者，每個(gè)捐助者在餐前抽取約300毫升全血，收集于干燥的離子瓶中(不含任何添加劑)，放置在室溫下凝血3-4小時(shí)，在2000～3000g下離心20分鐘，從血塊中分離出血清；

(2).血清的處理：將各捐助者的血清混合，約為550毫升，測(cè)定葡萄糖初濃度，添加純葡萄糖物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10062)至目標(biāo)濃度(5-7mmol/L)，該濃度為醫(yī)學(xué)決定水平，保證檢測(cè)質(zhì)量，以減少糖尿病的漏診率和誤診率?；旌涎逄砑蛹兾镔|(zhì)后在6000～9000g下離心20分鐘，取上清液以盡量去除血清樣本中的凝血、纖維蛋白等成分，目測(cè)為清晰、淡黃色且無顆粒物質(zhì)，紫外分光光度儀在波長(zhǎng)710nm、比色皿1厘米條件下吸光度A不超過0.5，若不符合則繼續(xù)在6000～9000g下離心20分鐘，以實(shí)現(xiàn)均一、澄清的“候選血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”。在生物安全柜中進(jìn)行負(fù)壓抽吸過濾，血清依次經(jīng)過0.45、0.22μm等親水膜進(jìn)行無菌過濾后，分裝于經(jīng)滅菌干燥的棕色安培瓶中，每瓶1毫升，共450瓶，-70℃冰凍儲(chǔ)存。

(3).均勻性檢驗(yàn)：均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的重要屬性之一，根據(jù)《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》及ISO Guide35的要求，該血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是液體，屬于均勻性良好的樣品，從制備的450瓶樣本中隨機(jī)抽取10瓶，每瓶重復(fù)測(cè)定3次，進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。

血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1～3，在顯著性水平a＝0.05下，采用F檢驗(yàn)法對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

x₁₁，x₁₂，……x₁n₁，

x₂₁，x₂₂，.……x₂n₂，

………………………...，

x_m1，x_m2，……x_mn_m，

設(shè)

組間平方和為

組內(nèi)平方和為

v₁＝m-1

v₂＝N-m

作統(tǒng)計(jì)量F：

根據(jù)自由度為(ν₁，ν₂)及給定的顯著性水平α，可由表查得臨界的F值，算得F值為1.452，小于F_α(2.393)，說明分裝后的血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組內(nèi)與組間無明顯差異，樣品是均勻的。

表1血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)(單位mmol/L)

表2血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢測(cè)結(jié)果方差分析(單位mmol/L)

表3血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

3.穩(wěn)定性評(píng)估

為了評(píng)估血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，本發(fā)明觀察了該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性主要測(cè)試在模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運(yùn)輸條件下的穩(wěn)定性，長(zhǎng)期穩(wěn)定性則是測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長(zhǎng)期貯存條件下的穩(wěn)定性。

血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估測(cè)量數(shù)據(jù)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4～5，選用平均值一致性檢驗(yàn)法進(jìn)行穩(wěn)定性分析。以不同保存時(shí)間的測(cè)試結(jié)果與第一次的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較分析。按照公式：

進(jìn)行計(jì)算，其中s₁,n₁為第一次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)。s₂,n₂為間隔一定時(shí)間后，第二次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)。

當(dāng)t與顯著性水平α，自由度為n₁+n₂-2時(shí)的t檢驗(yàn)臨界值t_α(n₁+n₂-2)之間的關(guān)系為：t≤t_α(n₁+n₂-2)時(shí)，認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值沒有發(fā)生顯著性變化，否則認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值已發(fā)生顯著性變化。

3.1短期穩(wěn)定性評(píng)估

短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)關(guān)注的是在特定運(yùn)輸條件下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。根據(jù)目前我國(guó)的運(yùn)輸條件，使用快遞運(yùn)輸，貨物2天內(nèi)可以運(yùn)送到我國(guó)主要城市。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)如下：模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)樣及運(yùn)輸過程的環(huán)境，分析在此過程中葡萄糖濃度的改變狀況。具體包括以下幾個(gè)步驟：首先將貯存于-70℃環(huán)境中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)迅速取出，在干冰溫度下進(jìn)行運(yùn)輸前的內(nèi)外包裝。外包裝采用壁厚為1.8cm的泡沫盒，每個(gè)泡沫盒中加入干冰1kg。

將裝有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物和干冰的泡沫盒置于室溫(25℃)環(huán)境中，在貯存的第0h，9h，24h，33h，48h，57h，72h對(duì)其進(jìn)行取樣，取樣后置于-70℃冰箱。每次取樣前觀察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的狀態(tài)，變?yōu)橐簯B(tài)后即停止取樣檢測(cè)。待全部取樣完畢后，對(duì)樣本進(jìn)行葡萄糖濃度檢測(cè)。

表4血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性評(píng)估測(cè)量結(jié)果(單位mmol/L)

3.2長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估

長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)關(guān)注的是在特定貯存條件下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)葡萄糖濃度的穩(wěn)定性狀況。本實(shí)驗(yàn)即是在-70℃貯存條件下，對(duì)貯存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行取樣分析。

表5血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估測(cè)量結(jié)果(單位mmol/L)

4.定值

4.1氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS(Agilent 7890-5975C)參數(shù)設(shè)置

色譜柱：Agilent DB-5毛細(xì)管柱；載氣為高純氦氣，流速為1.0mL/min；進(jìn)樣方式為分流，進(jìn)樣量為1μL，分流比為10:1，進(jìn)樣口溫度270℃；柱溫從80℃，以20℃/min速率升溫到280℃，保持10min；離子源溫度：230℃；采集方式：Scan和SIM(選擇離子監(jiān)測(cè))，選擇檢測(cè)離子：m/z 314和m/z 319。

4.2樣本衍生處理

精確稱取D一葡萄糖純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10062)、D-[^I3C₆]葡萄糖標(biāo)記物(ALDRICH)溶于純水中；精確量取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、D一葡萄糖純品標(biāo)準(zhǔn)液(約100μl)，加入一定量的葡萄糖標(biāo)記物溶液，輕搖充分混勻，在4℃冰箱平衡2小時(shí)；向已添加標(biāo)記物的樣品中加入0.8mL無水乙醇，振蕩混勻，在4℃下以5000r/min離心10min除去蛋白，取上層清液，60℃下氮?dú)獯蹈?；加?50μL鹽酸羥胺的吡啶溶液(0.2mol/L)，混勻，90℃下反應(yīng)0.5小時(shí)；冷卻后，再加入200μL乙酸酐，混勻，90℃下反應(yīng)0.5小時(shí)；60℃下氮?dú)獯蹈?，加?00μL二氯甲烷復(fù)溶，過有機(jī)濾膜，進(jìn)行GC/ID-MS的檢測(cè)。

4.3樣本中葡萄糖濃度計(jì)算結(jié)果

根據(jù)葡萄糖衍生物質(zhì)譜離子m/z 314與m/z 319的峰面積比，采用內(nèi)標(biāo)單點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見表6。

表6血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值數(shù)據(jù)(單位mmol/L)

5.不確定度評(píng)定

根據(jù)Guide 35《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值—通用原則和統(tǒng)計(jì)原理》的要求，采用GUM和QUAM的原則和方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的不確定度分量進(jìn)行量化。

特性值的不確定度來源主要有：1)純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度；2)特性值測(cè)量過程引起的不確定度；3)瓶間差引起的不確定度；4)穩(wěn)定性引起的不確定度。

5.1標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

1)純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10062的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u₁：

GBW10062葡萄糖定值為99.6％，擴(kuò)展不確定度為0.5％(k＝2)，因此其貢獻(xiàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.5％÷2＝0.25％。

2)測(cè)量過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u₂：

測(cè)量過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為測(cè)量相對(duì)變異系數(shù)CV＝0.42％

3)瓶間差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u₃：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候的均勻性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析見表2，評(píng)估其瓶間不均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

即均勻性引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為0.34％。

4)穩(wěn)定性引起的不確定度u₄：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表5。選用直線方程作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，擬合直線并計(jì)算與斜率相關(guān)的不確定度為其長(zhǎng)期穩(wěn)定性引起的不確定度，結(jié)果見表7：

表7長(zhǎng)期穩(wěn)定性引起的不確定度評(píng)估

5.2合成不確定度的計(jì)算

根據(jù)下列公式計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度＝5.84mmol/L×0.686％＝0.04mmol/L。

擴(kuò)展不確定度包含因子k＝2，U＝k×Uc＝2×0.04＝0.08mmol/L。

本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：葡萄糖標(biāo)示值為5.84mmol/L，擴(kuò)展不確定度為0.08mmol/L(k＝2)。