本發(fā)明涉及一種用于微量蛋白質(zhì)原位檢測的免疫質(zhì)譜分析的標準品，其特征是采用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)替代ProteinA/ProteinG，然后用質(zhì)譜法對樣品中已被特異性抗體捕獲的標志物進行精確地鑒別、實時檢測。
背景技術(shù)：
：：不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本的篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質(zhì)表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析；用抗體-質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點。目前，在蛋白質(zhì)功能研究上常用的方法是免疫沉淀。絕大部分免疫沉淀方法是基于ProteinA/ProteinG和抗體的特異結(jié)合。目前ProteinA/ProteinG的生產(chǎn)基本被幾家美國公司所壟斷。近十年來，化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)的研究提供了許多新的工具和技術(shù)。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)形多肽(Fc-III)和抗體有很強的親和性，可以被用來純化抗體。Fc-III的序列是DCAWHLGELVWCT-NH2，它是在小分子環(huán)肽庫中通過噬菌體展示(phagedisplay)的方法篩選出來的，它能夠特異性地與IgG分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相結(jié)合。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的證據(jù)顯示，化學(xué)合成的Fc-III與IgG的Fc片段結(jié)合時呈β發(fā)卡的構(gòu)型，其中的兩個Cys殘基之間形成了二硫鍵；Fc-III通過鹽橋、氫鍵、疏水相互作用等多種作用力與Fc片段結(jié)合。Fc-III足可以模擬ProteinA或G，起到替代的效果。Fc-III能從血清或唾液中分離純化抗體；利用分子生物學(xué)的手段將Fc-III融合表達在蛋白上，可以使用IgG的凝膠顆粒、甚至是原核表達的IgG-Fc的凝膠顆粒進行蛋白純化的工作。實驗表明，這種蛋白純化的手段具有特異性高、成本低等優(yōu)勢，具有很大的應(yīng)用前景。本專利擬發(fā)展一個以合成14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)為基礎(chǔ)的分離純化抗體的技術(shù)，實現(xiàn)免疫共沉淀的靈敏度和重現(xiàn)性；并發(fā)展集成化的分析系統(tǒng)使得這個技術(shù)能被廣泛地用于分子生物學(xué)的研究中。舉例，傳統(tǒng)用于胰島素檢測試劑盒及制備方法為ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)，ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測定法。舉例講，胰島素的檢測試劑盒制備方法為先將抗胰島素抗體(第一個抗體)結(jié)合至固相表面(如玻璃)，然后將含胰島素的樣品(如血清)，加至這個已標有抗胰島素抗體的容器中；這樣，胰島素就會結(jié)合至抗體上，然后洗脫未結(jié)合的物質(zhì)；再加上已標有酶、放射性或化學(xué)發(fā)光性的抗胰島素抗體(第二個抗體)，這樣就可以檢測出胰島素的總含量。這種方法學(xué)的缺點是無法測出標志物，如胰島素，的單個氨基酸變異(如胰島素的N或C端丟失了一個或數(shù)個氨基酸，胰島素被甲基，?；刃揎?，胰島素的異構(gòu)體)；即通常被用于傳統(tǒng)檢測胰島素試驗是檢測所謂的總胰島素量。因為傳統(tǒng)胰島素檢測常常是針對病人胰島素總體水平，無法直接鑒定變異性標志物，如內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素水平，這樣就增加了胰島素個體化活性水平控制的難度。目前，在進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時還沒有發(fā)現(xiàn)一個用于臨床直接鑒定內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素檢測的、采用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)替代ProteinA/ProteinG的標準化免疫質(zhì)譜試劑盒。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素為案例的、采用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)替代ProteinA/ProteinG的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法。本發(fā)明涉及微量蛋白質(zhì)原位檢測的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法，其特征在于，該試劑盒包括：一小管含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品，10～30μl；一小管含抗胰島素抗體的、用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)標記磁珠，30～50μl；一小管緩沖液，300～500μl，該緩沖液為50～100mMPBS，pH值為7.0～8.0；一小管洗脫液，10～50μl，該洗脫液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液，5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4℃冷藏盒中。本發(fā)明提出的上述免疫質(zhì)譜試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：1)含環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品的制備：用重組DNA技術(shù)，將載環(huán)形多肽(Fc-III)的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入14C、2H同位素-亮氨酸，使合成的環(huán)形多肽(Fc-III)帶有14C、2H雙標記的同位素；用質(zhì)譜測試14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品分子量為比非標記的內(nèi)源性環(huán)形多肽(Fc-III)多了6Da；所述14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：DCAWHL(C14、H2)GEL(C14、H2)VWCT注：鏈中6、9位合成中加入了同位素14C、2H雙標記-亮氨酸(L(C14、H2))。2)制備含抗胰島素抗體的磁珠：基質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)可選擇性或特異性結(jié)合抗體的Fc位點。洗去基質(zhì)未吸附的物質(zhì)；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的磁性珠上基質(zhì)與抗胰島素抗體的氨基基團結(jié)合(GunnDL，etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972；1(4)：381-389.)，或用streptavidin標記的磁性珠上基質(zhì)與biotin標記的抗胰島素抗體結(jié)合；置磁性處理器上，15～25℃孵育20～40分鐘，除去液體；3)配制50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值為7.0～8.0緩沖液、配制1～5％三氟乙酸的洗脫液，分別分裝成300～500μl小管和10～50μl小管；4)將能量吸收分子溶解于30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成5～10μl小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4℃冷藏箱中。免疫質(zhì)譜試劑盒檢測的應(yīng)用實驗步驟包括：1.稀釋：將生物樣品先用緩沖液稀釋30～50倍，將樣品充分混勻；2.結(jié)合：將上述標本100μl加至標有特異性抗體的磁珠的PCR管中，置磁性處理器上，15～25℃孵育20～40分鐘，除去液體；3.洗去非特異結(jié)合：加100μl緩沖液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育1～5分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次；4.洗脫：加10μl洗脫液1～5分鐘，洗脫標本至上清液；5.離子化：取5μl上清液移至另一個PCR管中，加入5μl能量吸收分子飽和溶液充分混勻；6.取1μl混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片；7.將上述金屬片加入質(zhì)譜儀中，就會生成質(zhì)譜；8.外部使用多肽分子質(zhì)量標準來校正質(zhì)量精確性，所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。上述的生物標志是利用一臺質(zhì)譜儀來檢測的；該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為0.001％。用統(tǒng)計學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述生物標志可以用于區(qū)分內(nèi)、外源性人胰島素變異表達(表一)。表一、區(qū)分內(nèi)、外源性人胰島素的案例注：A組.100例正常人對照組的血清含內(nèi)源性胰島素(5807.6460)；B組.100例糖尿病病人的血清含內(nèi)源性胰島素(5807.6460)；C組.100例正常人對照組的血清加入C14同位素內(nèi)源性胰島素(5809.6460)；D組.100例正常人對照組的血清加入C14同位素外源性胰島素(5779.6197)。胰島素首先能夠被具有能與胰島素結(jié)合的抗體吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的胰島素在質(zhì)譜儀中被檢測。胰島素通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控：每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清，將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至質(zhì)譜信號強度最大值的50％。胰島素的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關(guān)。質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。表二、14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)與環(huán)形多肽(Fc-III)結(jié)合力實驗注：實驗中采用了等量14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)、環(huán)形多肽(Fc-III)。發(fā)明中使用的14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)是替代ProteinA/G的創(chuàng)新產(chǎn)品，具有特異性、高親和力地結(jié)合抗體；實驗數(shù)據(jù)顯示，含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)結(jié)合抗體Fc的能力比環(huán)形多肽(Fc-III)高200％；故采用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)具備創(chuàng)造性和新穎性。本發(fā)明可用于體外細胞和非侵入性的體外14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)質(zhì)譜檢測方法的定量控制，檢測變異性、修飾性標志物，如內(nèi)源性胰島素、外源性胰島素。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點：(1)精確質(zhì)譜直接分析有很強的精確性。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便基質(zhì)所用的支持物是14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)磁珠等物質(zhì)，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。(3)快捷用本發(fā)明提供的免疫質(zhì)譜法進行檢測時，無需對蛋白質(zhì)進行測序。本發(fā)明采用了抗體-質(zhì)譜分析對交互作用的修飾蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化進行實時檢測，如檢測變異性的內(nèi)源性胰島素、外源性胰島素。具體實施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1本發(fā)明提出的14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的免疫質(zhì)譜試劑盒實施例1，包括：本發(fā)明提出的用于交互作用的修飾蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化進行實時檢測的免疫質(zhì)譜試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：一小管含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品，10～30μl；一小管含抗胰島素抗體的、用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)標記磁珠，30～50μl：一小管緩沖液，300～500μl，該緩沖液為50～100mMPBS，pH值為7.0～8.0；一小管洗脫液，10～50μl，該洗脫液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液，5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4℃冷藏盒中。本發(fā)明提出的上述免疫質(zhì)譜試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品的制備：用重組DNA技術(shù)，將載環(huán)形多肽(Fc-III)的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入14C、2H同位素-亮氨酸，使合成的環(huán)形多肽(Fc-III)帶有14C、2H同位素；用質(zhì)譜測試14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品分子量為比非標記的內(nèi)源性環(huán)形多肽(Fc-III)多了6Da；所述14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：DCAWHL(C14、H2)GEL(C14、H2)VWCT注：鏈中6、9位合成中加入了同位素14C、2H雙標記-亮氨酸(L(C14、H2))。同理，用重組DNA技術(shù)，將載外源性豬胰島素的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入C14同位素-精氨酸，使合成的外源性豬胰島素帶有C14同位素，用質(zhì)譜測試C14同位素標記的外源性豬胰島素的標準品分子量為5779.6197；將載內(nèi)源性胰島素的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入C14同位素-精氨酸，使合成的內(nèi)源性胰島素帶有C14同位素，用質(zhì)譜測試C14同位素標記的內(nèi)源性胰島素的標準品分子量為5809.6460。制備含抗胰島素抗體的磁珠：基質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)選擇性或特異性結(jié)合抗體的Fc位點。洗去基質(zhì)未吸附的物質(zhì)；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的磁性珠上基質(zhì)與抗胰島素抗體的氨基基團結(jié)合，或用streptavidin標記的磁性珠上基質(zhì)與biotin標記的抗胰島素抗體結(jié)合；配制50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值為7.0～8.0緩沖液、配制1～5％三氟乙酸的洗脫液，分別分裝成300～500μl小管和10～50μl小管；將能量吸收分子溶解于30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成5～10μl小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；將上述分裝好的各小管置于4℃冷藏箱中。實施例2本發(fā)明提出的14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的免疫質(zhì)譜試劑盒實施例2，包括：一小管含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)的標準品，10～30μl；一小管含抗胰島素抗體的、用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)標記磁珠，30～50μl；一小管緩沖液，300～500μl，該緩沖液為50～100mMPBS，pH值為7.0～8.0；一小管洗脫液，10～50μl，該洗脫液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液，5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4℃冷藏盒中。免疫質(zhì)譜試劑盒檢測生物標志的應(yīng)用實驗步驟包括：1.稀釋：將生物樣品先用緩沖液稀釋30～50倍，將樣品充分混勻；2.結(jié)合：將上述標本100μl加至標有特異性抗體的磁珠的PCR管中，置磁性處理器上，15～25℃孵育20～40分鐘，除去液體；3.洗去非特異結(jié)合：加100μl緩沖液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育1～5分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次；4.洗脫：加10μl洗脫液1～5分鐘，洗脫標本至上清液；5.離子化：取5μl上清液移至另一個PCR管中，加入5μl能量吸收分子飽和溶液充分混勻；6.取1μl混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片；7.將上述金屬片加入質(zhì)譜儀中，就會生成質(zhì)譜；8.外部使用多肽分子質(zhì)量標準來校正質(zhì)量精確性，所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。上述的生物標志是利用一臺質(zhì)譜儀來檢測的；該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為0.001％。采用本發(fā)明方法制備的試劑盒的應(yīng)用及效果說明如下：一、材料1.標本來源：A.100例正常人對照組的血清；B.100例糖尿病病人的血清；C.100例正常人對照組的血清加入C14同位素內(nèi)源性胰島素；D.100例正常人對照組的血清加入C14同位素外源性胰島素。2.儀器質(zhì)量控制：A.人標準化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控：每次測試前，用上述標準化質(zhì)控血清。3.磁珠基質(zhì)含已標記的抗胰島素的抗體：將14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)用Carbodiimide方法標記在磁珠上(見GunnDL，etal.JImmunolMethods.1：381-389，1972)；具有吸附劑功能的14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)與抗體置磁性處理器上，22℃孵育30分鐘，除去液體。加100μl緩沖液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。二、方法1.樣品的收集：全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備：每個吸附劑支持物點需要血清1μl，將血清用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測：上樣，將上述標本100μl加至已裝好磁珠-14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)-抗體的PCR管中，置磁性處理器上，22℃孵育30分鐘，除去液體。加100μl緩沖液(50mMPBS，pH7.0～8.0)至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。加10μl洗脫液2分鐘，洗脫標本至上清液。取5μl上清液移至另一個PCR管中，加入5μl能量吸收分子飽和溶充分混勻，取1μl混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片。所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會生成飛行時間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標準來校正質(zhì)量精確性。實驗結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述生物標志可以用于區(qū)分內(nèi)、外源性人胰島素變異表達(表一)。表一、區(qū)分內(nèi)、外源性人胰島素案例注：A組.100例正常人對照組的血清含內(nèi)源性胰島素(5807.6460)；B組.100例糖尿病病人的血清含內(nèi)源性胰島素(5807.6460)；C組.100例正常人對照組的血清加入C14同位素內(nèi)源性胰島素(5809.6460)；D組.100例正常人對照組的血清加入C14同位素外源性胰島素(5779.6197)。表二、14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)與環(huán)形多肽(Fc-III)結(jié)合力實驗注：實驗中采用了等量14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)、環(huán)形多肽(Fc-III)。發(fā)明中使用的14C、2H雙同位素標記的環(huán)形多肽(Fc-III)是替代ProteinA/G的創(chuàng)新產(chǎn)品，具有特異性、高親和力地結(jié)合抗體；上述實驗數(shù)據(jù)顯示，含14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)結(jié)合抗體Fc的能力比環(huán)形多肽(Fc-III)高200％；故采用14C、2H同位素雙標記的環(huán)形多肽(Fc-III)具備創(chuàng)造性和新穎性。在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式應(yīng)當同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3