本發(fā)明涉及組織學領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種巖黃連莖的石蠟切片方法。

背景技術(shù)：

巖黃連(Corydalis saxicola Bunting)是罌粟科植物，為多年生草本植物，分布于我國廣西、廣東、福建、湖南等省。全草入藥，全草含脫氫卡維丁(巖黃連堿)等活性成分；具有顯著的抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和強安定作用，并觀察到有抑制腫瘤細胞作用；主治瘡癤腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌等癥。是著名的壯瑤藥品種，巖黃連植物分布局限于石灰?guī)r山區(qū)，屬石山特有種。由于生境條件惡劣，其自然繁殖率很低，種群發(fā)展困難，資源蘊藏量十分有限，加上其種子細小，繁殖比較困難，在引種栽培時較難成活，年來人們大量采挖和收購，導(dǎo)致了野生資源的供不應(yīng)求，野生巖黃連資源瀕臨枯竭。隨著日益攀升的市場價格，混淆品層出不窮，因此急需開發(fā)出巖黃連莖切片用以鑒別藥材的真?zhèn)危┮?guī)范藥材市場，鑒別真?zhèn)蔚膸r黃連切片需要達到的效果為巖黃連莖部切片結(jié)構(gòu)清晰，能明確分辨各組織結(jié)構(gòu)等，且需要標本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標本。常規(guī)切片技術(shù)步驟繁雜不統(tǒng)一，且制備出來的巖黃連莖部切片達不到要求無法適用于藥材的鑒別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決現(xiàn)有技術(shù)制備的巖黃連根部切片不夠清晰不能用于藥材真?zhèn)舞b別的問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種巖黃連莖的石蠟切片方法，包括樣品固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與展片、脫蠟、染色以及封片，包括：在透明步驟之前，將脫水后的巖黃連莖放于體積濃度為0.8-1.2％的番紅溶液浸染8-12h；

在脫蠟之后，將載有巖黃連根的玻片進行復(fù)水，復(fù)水后再放于酒精溶液中進行分色，同時向用于分色的酒精溶液中加入體積比為1/(800-1000)的醋酸，最后放入體積濃度為0.8-1.2％的固綠溶液中染色10-20秒。

優(yōu)選的是，所述體積濃度為0.8-1.2％的番紅溶液是用2/3體積無水酒精+1/3體積TO型生物透明劑的混合液為溶劑配制而成，所述體積濃度為0.8-1.2％的固綠溶液是用體積濃度為95％的酒精溶液為溶劑配制而成。

優(yōu)選的是，將載有巖黃連莖的玻片依次放入1/2體積型生物透明劑+1/2體積無水酒精混合液、無水酒精、無水酒精、體積濃度為95％酒精、體積濃度為85％酒精、體積濃度為70％酒精中復(fù)水，每級3-5秒；再放入50％酒精中分色，3-10秒；之后再依次放入體積濃度為70％酒精、體積濃度為85％酒精中進一步處理，每級3-10秒。

優(yōu)選的是，固綠溶液染色后將載有巖黃連莖的玻片放于放入無水酒精中洗去染色劑，此級停留3-10秒；然后依次放入無水酒精、1/2TO型生物透明劑+1/2無水酒精混合液中，每級停留3-10秒；最后將載有巖黃連莖的玻片放入TO型生物透明劑中停留5-10分鐘，此步驟重復(fù)三次。

優(yōu)選的是，將固定后的巖黃連莖依次經(jīng)過體積濃度為80％酒精、體積濃度為85％酒精、體積濃度為90％酒精、體積濃度為95％酒精逐級脫水，每個濃度梯度脫水45-60分鐘，再放于100％酒精中脫水兩次，每次30-45分鐘。

優(yōu)選的是，每個梯度濃度的酒精溶液在對巖黃連莖脫水過程中同時進行真空抽氣10-15分鐘。

優(yōu)選的是，對番紅溶液染色后的莖依次用1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑混合液以及1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑混合液進行透明處理，每級透明時間均為60-120分鐘；再放于純TO型生物透明劑中浸泡2次，每次浸泡60-120分鐘。

優(yōu)選的是，固定之前，去除巖黃連莖表面浮塵，垂直其中脈橫切為長5-10mm，寬3-5mm的莖段，再將莖段放入FAA固定液中固定，F(xiàn)AA固定液由體積濃度為70％酒精:冰醋酸:甲醛體積比為90:5:5配制而成。

優(yōu)選的是，在巖黃連莖番紅染色過程中，染色第1小時后對放有巖黃連莖的0.8-1.2％番紅溶液用超聲頻率為32-35kHz的超聲波進行超聲處理60-75秒，染色第3小時后，對放有巖黃連莖的0.8-1.2％番紅溶液用超聲頻率為28-31kHz的超聲波進行超聲處理45-60秒，染色第7小時后，對放有巖黃連莖的0.8-1.2％番紅溶液用超聲頻率為25-27kHz的超聲波進行超聲處理30-50秒。

優(yōu)選的是，用于進一步處理的70％酒精和85％酒精中分別加入體積比為1/(1000-1200)的檸檬酸、苦味酸以及草酸的混合溶液，其中混合溶液中檸檬酸：苦味酸：草酸的體積比為1:2:1。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

(1)本發(fā)明公開的巖黃連莖切片方法，巖黃連莖橫切結(jié)構(gòu)清晰，可以在10至12天內(nèi)切出結(jié)構(gòu)清晰的巖黃連莖結(jié)構(gòu)，標本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標本，可供巖黃連藥材顯微鑒別應(yīng)用，供規(guī)范市場；

(2)巖黃連莖部脫水后根部幾乎透明，本發(fā)明在透明前先用番紅溶液對樣品進行預(yù)染色，這樣在包埋的時候包埋的位置更準確，本發(fā)明的番紅溶液是用2/3體積無水酒精+1/3體積TO型生物透明劑的混合液為溶劑配制而成，這樣既可以進行透明也可以進行染色，省時省力；

(3)本發(fā)明在固綠染色前在50％酒精中加入醋酸進行分色醋酸的加入有利于分色，使得番紅固綠染色不同部位效果更明顯；

(4)在分色后用體積濃度為70％酒精、體積濃度為85％酒精對樣品進一步處理，可以使得巖黃連根部中各組織更立體，在染色后效果更突出，更易于觀察對比；

(5)在固綠染色之后，再將片子依次放入無水酒精、1/2TO型生物透明劑+1/2無水酒精混合液中，每級停留3-10秒；最后將載有巖黃連葉片的玻片放入TO型生物透明劑中停留5-10分鐘，此步驟重復(fù)三次，目的是完全除去殘留在葉片和玻片上蠟；

(6)在番紅溶液對巖黃連莖浸染時，對番紅溶液進行超聲波處理，不但可以使得分子被分解得更小更容易進入到巖黃連莖中，還由于超聲波的作用，使得巖黃連莖細胞膜更容易共振從而便于番紅分子進入到細胞膜中；

(7)在固綠溶液染色前，用于進一步處理的70％酒精和85％酒精中分別加入體積比為1/(1000-1200)的檸檬酸、苦味酸以及草酸的混合溶液，不但使得巖黃連莖結(jié)構(gòu)更立體，固綠染料為酸性染料，事先對巖黃連莖用低濃度的酸進行浸泡，可以使得巖黃連莖處于酸性，更利于固綠的染色和分色，檸檬酸和草酸為天然酸不會破壞巖黃連莖的結(jié)構(gòu)，加入苦味酸進一步對顏色和結(jié)構(gòu)進行固定。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的對照組的石蠟切片圖；

圖2為本發(fā)明的實施例1的石蠟切片圖；

圖3為本發(fā)明的實施例5的石蠟切片圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：

(1)固定：新鮮巖黃連莖部采下后用自來水沖凈表面浮塵，吸干葉片表面水分。然后垂直莖部中脈橫切，每片長約8mm，寬4mm，放入體積濃度為70％酒精配制的FAA固定液中固定24小時，F(xiàn)AA固定液由體積濃度為70％酒精:冰醋酸:甲醛體積比為90:5:5配制而成。

(2)脫水：將材料從FAA固定液中取出，濾紙吸干多余FAA固定液，放入帶橡膠塞的平底玻璃管內(nèi)，加入體積濃度為80％酒精中，體積濃度為80％酒精的加入量為材料體積的20倍以上，真空抽氣10分鐘，停留45分鐘；倒出體積濃度為80％酒精，加入體積濃度為85％酒精，真空抽氣10分鐘，放置45分鐘；倒出體積濃度為85％酒精，加入體積濃度為90％酒精，真空抽氣15分鐘，放置60分鐘；倒出體積濃度為90％酒精，加入體積濃度為95％酒精，真空抽氣15分鐘，放置60分鐘；倒出體積濃度為95％酒精，加入100％酒精，真空抽氣15分鐘，放置30分鐘；更換一次100％酒精，真空抽氣15分鐘，放置45分鐘。

(4)透明：倒出無水酒精，在透明之前，將脫水后的巖黃連莖放于體積濃度為1％的番紅溶液浸染10h，其中體積濃度為1％的番紅溶液是用2/3體積無水酒精+1/3體積TO型生物透明劑的混合液為溶劑配制而成；倒出番紅溶液，加入1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣15分鐘，放置60分鐘；倒出1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，加入1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣15分鐘，放置90分鐘；倒出1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，加入純TO型生物透明劑，真空抽氣15分鐘，放置90分鐘；倒出TO型生物透明劑，換一次TO型生物透明劑，真空抽氣15分鐘，放置120分鐘。

(5)浸蠟：第一次浸蠟向裝巖黃連莖的玻璃管中加入固體小蠟塊，加入量為TO型生物透明劑體積的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒溫箱中，待蠟融化后再行加入同樣數(shù)量的蠟塊，此步驟共5次，直至蠟不再融化為止，最后一次加蠟打開瓶塞，盡可能讓TO透明劑揮發(fā)，此過程需要3天。第二次浸蠟將莖連同蠟一起倒入坩鍋中，再將坩鍋移至60℃恒溫箱中，凝固的蠟全部溶解后將連同莖、TO透明劑一起倒出，換入已融化溶點為56℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置4h；然后再次換入已融化溶點為58℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置2h后即可包埋。

(6)包埋：從恒溫箱拿出盛有巖黃連莖的坩鍋，將標簽夾出放在包埋盒一邊，底部蠟稍凝后，解剖針在酒精燈上稍加熱劃開紙盒表面凝蠟，立即將坩鍋中的材料撥入包埋盒，并將材料按照切片方向放好，靜置冷卻。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分鐘后，取出包埋盒，室溫晾干，儲藏備用。

(7)切片與展片：蠟塊的固著與修整：將蠟塊按材料大小及切割方向修至適當大小。粘蠟塊：將修好的小蠟塊粘到木塊上。用解剖刀在酒精燈上加熱，然后接觸一下蠟塊底部，使底部蠟軟化，迅速將其粘在木塊上。蠟塊與木塊連接的部位，應(yīng)滴些熔蠟，加強粘接的牢固性。將粘著蠟塊的木塊固定在切片機上，調(diào)好所需厚度(6-12μm)，進行切片，按順序放置在準備好的大紙盒里或硬紙上。用小拇指涂極少量明膠粘片劑在載玻片上。在玻片上加足夠的蒸餾水，將載玻片放置在50±(1-2)℃展溫臺上。解剖刀將蠟帶分割成適當長度的小段，長度小于蓋玻片長度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，將粘起蠟帶，放在在載玻片的水面上使之迅速平展，調(diào)整蠟帶位置，使之排列整齊。展溫臺另一端墊上兩張紙，待蠟帶展平后，立即將其載玻片上的水吸干凈，再置溫臺上；待水完全蒸發(fā)，用磚石筆在切片一端刻上記號，放入45℃烘箱中烘烤至少放置1天后才可進行下一步。

(8)脫蠟：將要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明劑中，每級3分鐘，脫去石蠟。

(9)染色：將脫蠟后的片子依次放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液、無水酒精、無水酒精、體積濃度為95％酒精、體積濃度為85％酒精、體積濃度為70％酒精中復(fù)水，每級3秒。再將片子放入體積濃度為50％酒精中分色10秒，體積濃度為50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的體積比為1:1000。然后將片子依次放入體積濃度為70％酒精、體積濃度為85％酒精中進一步處理，每級7秒。最后將片子放入體積濃度為1％的固綠溶液中染色18秒，其中體積濃度為1％的固綠溶液是用體積濃度為95％的酒精溶液為溶劑配制而成。染色完成后，將片子放入無水酒精中，涮去片子上的染色劑，此級停留10秒；再將片子放入無水酒精中，停留10秒；之后將片子放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液中，停留3秒；最后將片子放入TO型生物透明劑中，停留5分鐘，此步驟重復(fù)三次。

(10)封片：將片子平放在紙上，擦去下部殘留的TO型生物透明劑，上面滴2-3滴加拿大樹膠，蓋玻片在酒精燈上烘一下，從一側(cè)小心蓋下，避免出現(xiàn)氣泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，貼好標簽，標簽上注名材料名稱、采集地點、時間等信息。

實施例2：

(1)固定：新鮮巖黃連莖部采下后用自來水沖凈表面浮塵，吸干葉片表面水分。然后垂直根部中脈橫切，每片長約5mm，寬3mm，放入體積濃度為70％酒精配制的FAA固定液中固定24小時，F(xiàn)AA固定液重酒精:冰醋酸:甲醛體積比為90:5:5。

(2)脫水：將材料從FAA固定液中取出，濾紙吸干多余FAA固定液，放入帶橡膠塞的平底玻璃管內(nèi)，加入體積濃度為80％酒精中，體積濃度為80％酒精的加入量為材料體積的20倍以上，真空抽氣15分鐘，停留55分鐘；倒出體積濃度為80％酒精，加入體積濃度為85％酒精，真空抽氣10分鐘，放置60分鐘；倒出體積濃度為85％酒精，加入體積濃度為90％酒精，真空抽氣12分鐘，放置45分鐘；倒出體積濃度為90％酒精，加入體積濃度為95％酒精，真空抽氣15分鐘，放置45分鐘；倒出體積濃度為95％酒精，加入100％酒精，真空抽氣10分鐘，放置45分鐘；更換一次100％酒精，真空抽氣15分鐘，放置30分鐘。

(4)透明：倒出無水酒精，在透明之前，將脫水后的巖黃連莖放于體積濃度為0.8％的番紅溶液浸染12h，其中體積濃度為0.8％的番紅溶液是用2/3體積無水酒精+1/3體積TO型生物透明劑的混合液為溶劑配制而成；倒出番紅溶液，加入1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣10分鐘，放置90分鐘；倒出1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，加入1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣10分鐘，放置60分鐘；倒出1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，加入純TO型生物透明劑，真空抽氣10分鐘，放置120分鐘；倒出TO型生物透明劑，換一次TO型生物透明劑，真空抽氣10分鐘，放置60分鐘。

(5)浸蠟：第一次浸蠟向裝巖黃連莖的玻璃管中加入固體小蠟塊，加入量為TO型生物透明劑體積的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒溫箱中，待蠟融化后再行加入同樣數(shù)量的蠟塊，此步驟共3次，直至蠟不再融化為止，最后一次加蠟打開瓶塞，盡可能讓TO透明劑揮發(fā)，此過程需要2天。第二次浸蠟將莖連同蠟一起倒入坩鍋中，再將坩鍋移至60℃恒溫箱中，凝固的蠟全部溶解后將連同莖、TO透明劑一起倒出，換入已融化溶點為56℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置4h；然后再次換入已融化溶點為58℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置2h后即可包埋。

(6)包埋：從恒溫箱拿出盛有巖黃連莖的坩鍋，將標簽夾出放在包埋盒一邊，底部蠟稍凝后，解剖針在酒精燈上稍加熱劃開紙盒表面凝蠟，立即將坩鍋中的材料撥入包埋盒，并將材料按照切片方向放好，靜置冷卻。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分鐘后，取出包埋盒，室溫晾干，儲藏備用。

(7)切片與展片：蠟塊的固著與修整：將蠟塊按材料大小及切割方向修至適當大小。粘蠟塊：將修好的小蠟塊粘到木塊上。用解剖刀在酒精燈上加熱，然后接觸一下蠟塊底部，使底部蠟軟化，迅速將其粘在木塊上。蠟塊與木塊連接的部位，應(yīng)滴些熔蠟，加強粘接的牢固性。將粘著蠟塊的木塊固定在切片機上，調(diào)好所需厚度(6-12μm)，進行切片，按順序放置在準備好的大紙盒里或硬紙上。用小拇指涂極少量明膠粘片劑在載玻片上。在玻片上加足夠的蒸餾水，將載玻片放置在50±(1-2)℃展溫臺上。解剖刀將蠟帶分割成適當長度的小段，長度小于蓋玻片長度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，將粘起蠟帶，放在在載玻片的水面上使之迅速平展，調(diào)整蠟帶位置，使之排列整齊。展溫臺另一端墊上兩張紙，待蠟帶展平后，立即將其載玻片上的水吸干凈，再置溫臺上；待水完全蒸發(fā)，用磚石筆在切片一端刻上記號，放入45℃烘箱中烘烤至少放置2天后才可進行下一步。

(8)脫蠟：將要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明劑中，每級5分鐘，脫去石蠟。

(9)染色：將脫蠟后的片子依次放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液、無水酒精、無水酒精、體積濃度為95％酒精、體積濃度為85％酒精、體積濃度為70％酒精中復(fù)水，每級5秒。再將片子放入體積濃度為50％酒精中分色3秒，體積濃度為50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的體積比為1:800。然后將片子依次放入體積濃度為70％酒精、體積濃度為85％酒精中進一步處理，每級10秒。最后將片子放入體積濃度為1.2％的固綠溶液中染色10秒，其中體積濃度為1.2％的固綠溶液是用體積濃度為95％的酒精溶液為溶劑配制而成。染色完成后，將片子放入無水酒精中，涮去片子上的染色劑，此級停留8秒；再將片子放入無水酒精中，停留3秒；之后將片子放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液中，停留10秒；最后將片子放入TO型生物透明劑中，停留10分鐘，此步驟重復(fù)三次。

(10)封片：將片子平放在紙上，擦去下部殘留的TO型生物透明劑，上面滴2-3滴加拿大樹膠，蓋玻片在酒精燈上烘一下，從一側(cè)小心蓋下，避免出現(xiàn)氣泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，貼好標簽，標簽上注名材料名稱、采集地點、時間等信息。

實施例3：

(1)固定：新鮮巖黃連莖采下后用自來水沖凈表面浮塵，吸干葉片表面水分。然后垂直根部中脈橫切，每片長約10mm，寬5mm，放入體積濃度為70％酒精配制的FAA固定液中固定24小時，F(xiàn)AA固定液重酒精:冰醋酸:甲醛體積比為90:5:5。

(2)脫水：將材料從FAA固定液中取出，濾紙吸干多余FAA固定液，放入帶橡膠塞的平底玻璃管內(nèi)，加入體積濃度為80％酒精中，體積濃度為80％酒精的加入量為材料體積的20倍以上，真空抽氣10分鐘，停留60分鐘；倒出體積濃度為80％酒精，加入體積濃度為85％酒精，真空抽氣10分鐘，放置50分鐘；倒出體積濃度為85％酒精，加入體積濃度為90％酒精，真空抽氣15分鐘，放置55分鐘；倒出體積濃度為90％酒精，加入體積濃度為95％酒精，真空抽氣15分鐘，放置55分鐘；倒出體積濃度為95％酒精，加入100％酒精，真空抽氣15分鐘，放置40分鐘；更換一次100％酒精，真空抽氣10分鐘，放置40分鐘。

(4)透明：倒出無水酒精，在透明之前，將脫水后的巖黃連莖部放于體積濃度為0.8％的番紅溶液浸染12h，其中體積濃度為0.8％的番紅溶液是用2/3體積無水酒精+1/3體積TO型生物透明劑的混合液為溶劑配制而成；倒出番紅溶液，加入1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣10分鐘，放置120分鐘；倒出1/2體積無水酒精+1/2體積TO型生物透明劑的混合液，加入1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，真空抽氣15分鐘，放置120鐘；倒出1/3體積無水酒精+2/3體積TO型生物透明劑的混合液，加入純TO型生物透明劑，真空抽氣15分鐘，放置60分鐘；倒出TO型生物透明劑，換一次TO型生物透明劑，真空抽氣15分鐘，放置90分鐘。

(5)浸蠟：第一次浸蠟向裝巖黃連莖的玻璃管中加入固體小蠟塊，加入量為TO型生物透明劑體積的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒溫箱中，待蠟融化后再行加入同樣數(shù)量的蠟塊，此步驟共4次，直至蠟不再融化為止，最后一次加蠟打開瓶塞，盡可能讓TO透明劑揮發(fā)，此過程需要2天。第二次浸蠟將莖連同蠟一起倒入坩鍋中，再將坩鍋移至60℃恒溫箱中，凝固的蠟全部溶解后將連同莖、TO透明劑一起倒出，換入已融化溶點為56℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置4h；然后再次換入已融化溶點為58℃的石蠟，在60℃恒溫箱中放置2h后即可包埋。

(6)包埋：從恒溫箱拿出盛有巖黃連莖的坩鍋，將標簽夾出放在包埋盒一邊，底部蠟稍凝后，解剖針在酒精燈上稍加熱劃開紙盒表面凝蠟，立即將坩鍋中的材料撥入包埋盒，并將材料按照切片方向放好，靜置冷卻。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分鐘后，取出包埋盒，室溫晾干，儲藏備用。

(7)切片與展片：蠟塊的固著與修整：將蠟塊按材料大小及切割方向修至適當大小。粘蠟塊：將修好的小蠟塊粘到木塊上。用解剖刀在酒精燈上加熱，然后接觸一下蠟塊底部，使底部蠟軟化，迅速將其粘在木塊上。蠟塊與木塊連接的部位，應(yīng)滴些熔蠟，加強粘接的牢固性。將粘著蠟塊的木塊固定在切片機上，調(diào)好所需厚度(6-12μm)，進行切片，按順序放置在準備好的大紙盒里或硬紙上。用小拇指涂極少量明膠粘片劑在載玻片上。在玻片上加足夠的蒸餾水，將載玻片放置在50±(1-2)℃展溫臺上。解剖刀將蠟帶分割成適當長度的小段，長度小于蓋玻片長度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，將粘起蠟帶，放在在載玻片的水面上使之迅速平展，調(diào)整蠟帶位置，使之排列整齊。展溫臺另一端墊上兩張紙，待蠟帶展平后，立即將其載玻片上的水吸干凈，再置溫臺上；待水完全蒸發(fā)，用磚石筆在切片一端刻上記號，放入45℃烘箱中烘烤至少放置1天后才可進行下一步。

(8)脫蠟：將要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明劑中，每級2-5分鐘，脫去石蠟。

(9)染色：將脫蠟后的片子依次放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液、無水酒精、無水酒精、體積濃度為95％酒精、體積濃度為85％酒精、體積濃度為70％酒精中復(fù)水，每級4秒。再將片子放入體積濃度為50％酒精中分色6秒，體積濃度為50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的體積比為1:900。然后將片子依次放入體積濃度為70％酒精、體積濃度為85％酒精中進一步處理，每級3秒。最后將片子放入體積濃度為0.8％的固綠溶液中染色20秒，其中體積濃度為0.8％的固綠溶液是用體積濃度為95％的酒精溶液為溶劑配制而成。染色完成后，將片子放入無水酒精中，涮去片子上的染色劑，此級停留3秒；再將片子放入無水酒精中，停留7秒；之后將片子放入1/2體積TO型生物透明劑+1/2體積無水酒精的混合液中，停留7秒；最后將片子放入TO型生物透明劑中，停留6分鐘，此步驟重復(fù)三次。

(10)封片：將片子平放在紙上，擦去下部殘留的TO型生物透明劑，上面滴2-3滴加拿大樹膠，蓋玻片在酒精燈上烘一下，從一側(cè)小心蓋下，避免出現(xiàn)氣泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，貼好標簽，標簽上注名材料名稱、采集地點、時間等信息。

實施例4：

在實施例1的基礎(chǔ)上，在巖黃連莖番紅染色過程中，染色第1小時后對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為32kHz的超聲波進行超聲處理75秒，染色第3小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為31kHz的超聲波進行超聲處理45秒，染色第7小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為25kHz的超聲波進行超聲處理50秒，繼續(xù)浸染至結(jié)束。

在固綠溶液染色前，用于進一步處理的70％酒精和85％酒精中分別加入體積比為1/1000的檸檬酸、苦味酸以及草酸的混合溶液，其中混合溶液中檸檬酸：苦味酸：草酸的體積比為1:2:1。

實施例5：

在實施例1的基礎(chǔ)上，在巖黃連莖番紅染色過程中，染色第1小時后對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為35kHz的超聲波進行超聲處理60秒，染色第3小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為30kHz的超聲波進行超聲處理50秒，染色第7小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為27kHz的超聲波進行超聲處理30秒。

在固綠溶液染色前，用于進一步處理的70％酒精和85％酒精中分別加入體積比為1/1200的檸檬酸、苦味酸以及草酸的混合溶液，其中混合溶液中檸檬酸：苦味酸：草酸的體積比為1:2:1。

實施例6：

在實施例1的基礎(chǔ)上，在巖黃連莖番紅染色過程中，染色第1小時后對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為33kHz的超聲波進行超聲處理65秒，染色第3小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為28kHz的超聲波進行超聲處理60秒，染色第7小時后，對放有巖黃連莖的番紅溶液用超聲頻率為26kHz的超聲波進行超聲處理45秒。

在固綠溶液染色前，用于進一步處理的70％酒精和85％酒精中分別加入體積比為1/1100的檸檬酸、苦味酸以及草酸的混合溶液，其中混合溶液中檸檬酸：苦味酸：草酸的體積比為1:2:1。

為了說明本發(fā)明的效果，申請人用常規(guī)的石蠟切片方法做出莖部的石蠟切片作為對照組，再取實施例1和實施例5制得的莖部石蠟切片，將三者分別放于萊卡生物顯微鏡DM2000觀察拍照，分別得到圖1、圖2以及圖3，由圖可以看出，圖3的石蠟切片組織結(jié)構(gòu)清晰分明，可以用于鑒別藥材的真?zhèn)?；圖2次之；圖1的根部組織較不清楚，圖1不能用于鑒別藥材的真?zhèn)巍?/p>

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。