本發(fā)明涉及一種液質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定魚肝臟中河鲀毒素含量的方法，屬于色譜檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：TTX(河鲀毒素)是發(fā)現(xiàn)最早而毒性極大的小分子海洋毒素，毒性為氰化鈉的1000倍。毒性作用主要表現(xiàn)為選擇性地阻遏神經(jīng)和肌肉的鈉離子通道，抑制鈉離子通過神經(jīng)細(xì)胞膜，先后麻痹感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，嚴(yán)重的腦干麻痹導(dǎo)致呼吸衰竭；中毒潛伏期短，致死率高達(dá)60％。TTX為無(wú)色棱柱狀晶體，可溶于弱酸的水溶液。溶液pH值影響其穩(wěn)定性，pH值<3和pH值>7時(shí)易分解；溫度高于220℃時(shí)炭化。TTX的測(cè)定方法主要有酶聯(lián)免疫法、生物檢測(cè)法(小鼠法)、電化學(xué)法(毛細(xì)管電泳法)、色譜法(液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)等。但小鼠法測(cè)定的準(zhǔn)確度會(huì)因小鼠個(gè)體差異而變化；酶聯(lián)免疫法成本較高，氣相色譜-質(zhì)譜與液相色譜-熒光法需將TTX經(jīng)堿解衍生后再檢測(cè)，衍生效率以及源自樣品的熒光物質(zhì)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，且步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，前處理凈化需達(dá)到質(zhì)譜進(jìn)樣要求，提取溶液一般采用三氯乙酸、乙酸等水溶液，凈化樣品采用過C18小柱、離子交換柱等以及超濾等手段，但所得提取液仍因存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)而影響方法靈敏度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的基質(zhì)效應(yīng)問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種液質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定魚肝臟中河鲀毒素含量的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供的液質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定魚肝臟中河鲀毒素含量的方法，包括下列步驟：(一)樣品預(yù)處理(1)活河鲀魚冷凍處死，去皮，取其肝臟部分經(jīng)均質(zhì)制樣機(jī)充分粉碎，取其粉碎后肝臟樣品50g，加入15-20g的高嶺土，繼續(xù)用均質(zhì)制樣機(jī)粉碎，均質(zhì)粉碎10-15min，然后放入-40℃冰箱中冷凍1-2h；冷凍結(jié)束后稱取試樣(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入5mL30％乙醇水溶液和5mL1.0％乙酸甲醇溶液，均質(zhì)30-50s，細(xì)胞破碎儀在60℃超聲提取25min，8000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈離心管中；殘?jiān)?mL30％乙醇水溶液和3mL1％乙酸甲醇溶液重復(fù)提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min離心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，渦旋30s后4℃下10000r/min離心5min，棄正己烷層，重復(fù)脫脂1次，所得清液待凈化；(2)取1.0mL脫脂后的上清液過Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，棄去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通過小柱，流出液過0.22μm聚四氟乙烯-尼龍復(fù)合膜，收集于進(jìn)樣小瓶，供HPLC-MS/MS測(cè)定；(二)色譜-質(zhì)譜條件色譜條件色譜柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)；流動(dòng)相B為95％乙腈(含5mmol/L甲酸銨的0.1％甲酸水溶液)。洗脫程序?yàn)椋?-5.3min，從20％線性遞增到95％；5.3-7min，從95％線性遞減至20％；7.01-12min，平衡5min；進(jìn)樣量：10μL；流速0.35mL/min；柱溫：30℃。表1TTX的液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.33509557.03509557.01350208012.03502080質(zhì)譜條件離子源及掃描方式：ESI+；檢測(cè)模式：MRM；碰撞氣流量：12L/min；氣簾氣流量：10L/min；TTX的質(zhì)譜定性、定量離子對(duì)分別為320.2/162.1和320.2/302.2，相應(yīng)碰撞能分別為32V和47V；質(zhì)譜峰保留時(shí)間在6.32附近，駐留時(shí)間和電噴霧電壓分別為200ms和5000V，離子源溫度為600℃，各質(zhì)譜參數(shù)見表2。表2TTX保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量*定量離子對(duì)。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明針對(duì)魚肝臟樣品中的基質(zhì)效應(yīng)問題，結(jié)合河鲀毒素的化學(xué)特點(diǎn)，在前處理時(shí)加入高嶺土，并采用低溫冷凍的方式，最大程度的將毒素分離出來。同時(shí)60℃酸解，細(xì)胞破碎儀超聲提取，Carbon-GCBSPE凈化后，樣品直接進(jìn)樣分析，處理過程簡(jiǎn)捷、低耗。方法準(zhǔn)確，操作方便、重現(xiàn)性好，可滿足目前對(duì)魚肝中河鲀毒素快速檢測(cè)的技術(shù)要求。本發(fā)明中樣品經(jīng)1％乙酸甲醇在60℃下細(xì)胞破碎儀超聲提取，Carbon-GCBSPE小柱凈化后，直接進(jìn)樣分析，節(jié)省了濃縮時(shí)間。與現(xiàn)有技術(shù)中0.2％乙酸水溶液提取、其它SPE凈化以及超濾等方法相比，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、成本低、省時(shí)高效，改進(jìn)了基質(zhì)效應(yīng)問題，且具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，滿足目前快速檢測(cè)河鲀魚肝中TTX含量的技術(shù)要求。附圖說明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是陽(yáng)性河鲀魚肝臟樣品中TTX總離子流圖。圖2是空白紅鰭東方鲀肝臟樣品的總離子流圖。圖3是加標(biāo)10μg/kg紅鰭東方鲀肝臟樣品的總離子流圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例提供的液質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定魚肝臟中河鲀毒素含量的方法，包括下列步驟：(一)樣品預(yù)處理(1)活河鲀魚冷凍處死，去皮，取其肝臟部分經(jīng)均質(zhì)制樣機(jī)充分粉碎，取其粉碎后肝臟樣品50g，加入15-20g的高嶺土，繼續(xù)用均質(zhì)制樣機(jī)粉碎，均質(zhì)粉碎10-15min，然后放入-40℃冰箱中冷凍1-2h；冷凍結(jié)束后稱取試樣(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入5mL30％乙醇水溶液和5mL1.0％乙酸甲醇溶液，均質(zhì)30-50s，細(xì)胞破碎儀在60℃超聲提取25min，8000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈離心管中；殘?jiān)?mL30％乙醇水溶液和3mL1％乙酸甲醇溶液重復(fù)提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min離心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，渦旋30s后4℃下10000r/min離心5min，棄正己烷層，重復(fù)脫脂1次，所得清液待凈化；(2)取1.0mL脫脂后的上清液過Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，棄去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通過小柱，流出液過0.22μm聚四氟乙烯-尼龍復(fù)合膜，收集于進(jìn)樣小瓶，供HPLC-MS/MS測(cè)定；(二)色譜-質(zhì)譜條件色譜條件色譜柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)；流動(dòng)相B為95％乙腈(含5mmol/L甲酸銨的0.1％甲酸水溶液)。洗脫程序?yàn)椋?-5.3min，從20％線性遞增到95％；5.3-7min，從95％線性遞減至20％；7.01-12min，平衡5min；進(jìn)樣量：10μL；流速0.35mL/min；柱溫：30℃。表1TTX的液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.33509557.03509557.01350208012.03502080質(zhì)譜條件離子源及掃描方式：ESI+；檢測(cè)模式：MRM；碰撞氣流量：12L/min；氣簾氣流量：10L/min；TTX的質(zhì)譜定性、定量離子對(duì)分別為320.2/162.1和320.2/302.2，相應(yīng)碰撞能分別為32V和47V；質(zhì)譜峰保留時(shí)間在6.32min附近，駐留時(shí)間和電噴霧電壓分別為200ms和5000V，離子源溫度為600℃，各質(zhì)譜參數(shù)見表2。表2TTX保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量*定量離子對(duì)。如圖1，是陽(yáng)性河鲀魚肝臟樣品中TTX總離子流圖。實(shí)施例2線性范圍與檢出限稱取試樣(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯離心管中，加入適量河鲀毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為0、10、20、50、100、200μg/kg，放置0.5h后按照實(shí)施例1方法，得到0、10、20、50、100、200μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)溶液；以TTX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)加標(biāo)溶液濃度(μg/kg)為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，TTX在10～200μg/kg范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為Y＝2.34e+003X，r2＝0.9994。等量稱取河鲀魚肝臟樣品(1.00±0.01)g，加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，使TTX的濃度水平為5.0、10、20、30μg/kg，每水平3個(gè)平行樣，按實(shí)施例1方法進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。結(jié)果表明，添加水平為5.0μg/kg時(shí)提取液中TTX的定量離子信噪比均大于3；添加水平為10.0μg/kg時(shí)，TTX定量離子的S/N均大于10。以目標(biāo)化合物的響應(yīng)值信噪比≥3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度作檢出限，信噪比大于10作定量下限，得到本方法中河鲀毒素的檢出限和定量下限分別為5.0μg/kg和10.0μg/kg。圖2-3為紅鰭東方鲀肝空白基質(zhì)及加標(biāo)樣品譜圖。實(shí)施例3回收率與精密度稱取經(jīng)測(cè)定不含TTX的養(yǎng)殖陰性紅鰭東方鲀肝臟樣品(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯離心管，分成3組，每組6個(gè)，加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中TTX的濃度分別為10、15、30、50、100、200μg/kg，按實(shí)施例1方法用HPLC-MS/MS分析?；|(zhì)加標(biāo)校準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，回收率與精密度數(shù)據(jù)見表3。用空白基質(zhì)作回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：表3回收率與精密度數(shù)據(jù)添加水平/(μg.kg-1)回收率％1088.6-93.61590.6-96.33095.8-98.35095.2-99.510097.6-102.320098.3-103.8實(shí)施例4實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用本方法對(duì)20份河鲀魚肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣品6份，其TTX含量在41.5～520.7μg/kg之間。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3