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一種快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法與流程

文檔序號:12268189閱讀:1331來源:國知局
一種快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-MS)技術(shù)快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法。



背景技術(shù):

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)簡稱單增李斯特菌,是一種能夠引起人獸共患病的食源性致病菌。單增李斯特菌可污染許多食品,包括生家禽、家畜肉、發(fā)酵香腸和海產(chǎn)品等。WHO將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布廣泛,4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一,極易污染食品而引起食物中毒和李斯特菌病(由單增李斯特菌引起的急性傳染病)的暴發(fā),尤其是在歐美國家經(jīng)常發(fā)生,給人類的健康及畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的威脅。近年來,歐美國家因食品感染的李斯特菌病患者呈上升趨勢:2014年9月,丹麥發(fā)生一起因食用香腸中毒事件,12人死亡,還有至少20人被李斯特菌感染。經(jīng)調(diào)查,疑似使用了被單增李斯特菌污染的原料肉。2015年4月9日,美國疾病控制預(yù)防中心宣布,美國至少8人因食用冰淇淋產(chǎn)品后,感染單增李斯特菌而患病就醫(yī),已經(jīng)導(dǎo)致3人死亡。美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)估計(jì),美國每年約有2600人感染單增李斯特菌,其中約1500人罹患李斯特菌病住院治療,約260人死亡。世界糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)風(fēng)險(xiǎn)評估報(bào)告(JEMRA,2004)中指出,李斯特菌病的平均死亡率為20~30%。2001年11月以來,我國質(zhì)檢部門多次從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時(shí)、丹麥等二十多家肉類加工廠進(jìn)口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌等食源致病菌。

單增李斯特菌的鑒定多采用傳統(tǒng)的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和溶血試驗(yàn)等,該方法所需時(shí)間長,一般情況下需要5~7天,很難滿足快速鑒定的需要。國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 4789.30-2010》中,溶血試驗(yàn):單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)在刺種點(diǎn)周圍都產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán),兩者難以區(qū)分;協(xié)同溶血試驗(yàn)(cAMP):單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強(qiáng),斯氏李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng),兩者也無法區(qū)分。近幾年發(fā)展起來的PCR技術(shù),是一種快速、靈敏、特異性好的技術(shù),但是目前該技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)方法的前增菌步驟,增菌液中往往含有PCR抑制劑,從而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果。斯氏李斯特氏菌和單增李斯特菌都屬于李斯特菌屬,采用免疫學(xué)檢測方法,操作簡便,可在同一時(shí)間內(nèi)檢測大量樣品,但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)的存在,難以進(jìn)行李斯特菌屬種間特異性鑒別。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法,以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn),從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。

本發(fā)明的主要原理為:利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-MS)技術(shù)檢測單增李斯特菌與斯氏李斯特菌液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物,根據(jù)兩種細(xì)菌產(chǎn)生的代謝揮發(fā)性產(chǎn)物種類不同,區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌。

具體包括下列步驟:

1、單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的培養(yǎng)物制備

接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌株到滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30~40℃,100~200r/min條件下,搖床振蕩培養(yǎng)8~24h。吸取該培養(yǎng)物5~10mL轉(zhuǎn)入20mL頂空瓶內(nèi),加蓋密封,作為測試樣品。

其中,營養(yǎng)肉湯組分為:蛋白胨10.0g/L,牛肉粉3.0g/L,氯化鈉5.0g/L,葡萄糖1.0g/L。

2、HS-GC-MS分析

頂空(HS)進(jìn)樣條件:加熱箱溫度30~60℃,定量環(huán)溫度:85℃,傳輸線溫度:100℃,樣品平衡時(shí)間:30~60min;色譜柱壓力:7.7psi;填充壓力:15psi;加壓時(shí)間:0.2min;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間:1.0min,拔針時(shí)間:0.5min。

氣相色譜(GC)條件:色譜柱(30m×250μm×0.25μm);分流進(jìn)樣,分流比為5:1,隔墊吹掃流量為3mL/min;升溫程序:初始溫度35~55℃保持2~10min,以3~10℃/min升至120~200℃;再以5~10℃/min升至250℃,保持1~5min,進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣:高純氦(He),流速:1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件:離子源EI,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,電子能量70eV,傳輸線溫度280℃,采集模式全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z:33~300u,溶劑延遲:1~3min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

MS結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫進(jìn)行定性分析,同時(shí)由軟件系統(tǒng)完成手動(dòng)對照檢索。采用提取離子流方式報(bào)告揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積。

其中,兩種細(xì)菌產(chǎn)生的代謝揮發(fā)性產(chǎn)物種類不同,區(qū)分化合物為十二醇,單增李斯特菌的液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物中可以檢測到十二醇,并且采用面積歸一法計(jì)算十二醇的相對含量為10%~30%,而斯氏李斯特菌的液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物中未檢測到十二醇。

本發(fā)明的有益效果:

本發(fā)明的方法作為一種篩選工具,比現(xiàn)有的傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)鑒定時(shí)間縮短1-2天,可以快速區(qū)分平板上的單增李斯特菌與斯氏李斯特菌,實(shí)現(xiàn)當(dāng)天篩選。相對于PCR方法和免疫方法,該篩選方法自動(dòng)化程度更高,降低一線檢測人員接觸食源致病菌的幾率,減少食源致病菌對人和環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明,但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。

圖1是單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖。

圖2是單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖。

實(shí)施例1

(1)單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 13932與斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967的培養(yǎng)物制備

采用接種環(huán),無菌操作轉(zhuǎn)接單增李斯特菌ATCC 13932到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,36℃,150r/min條件下,搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi),加蓋密封,作為單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

采用接種環(huán),無菌操作轉(zhuǎn)接斯氏李斯特菌ATCC 35967到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,36℃,150r/min條件下,搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi),加蓋密封,作為斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

其中,營養(yǎng)肉湯組分為:蛋白胨10.0g/L,牛肉粉3.0g/L,氯化鈉5.0g/L,葡萄糖1.0g/L。購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

(2)培養(yǎng)物的頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析

采用美國安捷倫公司Agilent 7890B-5977A系列氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(配有Agilent7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器)對單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物、斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物進(jìn)行揮發(fā)性產(chǎn)物的化學(xué)分析。頂空進(jìn)樣、氣相色譜和質(zhì)譜條件如下:

頂空(HS)進(jìn)樣條件:加熱箱溫度52℃,定量環(huán)溫度:85℃,傳輸線溫度:100℃,樣品平衡時(shí)間:50min;色譜柱壓力:7.7psi;填充壓力:15psi;加壓時(shí)間:0.2min;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間:1.0min,拔針時(shí)間:0.5min。

氣相色譜(GC)條件:HP-INNOWax色譜柱(30m×250μm×0.25μm);分流進(jìn)樣,分流比為5:1,隔墊吹掃流量為3mL/min;升溫程序:初始溫度40℃保持5min,以3℃/min升至140℃;再以6℃/min升至250℃,保持5min,進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣:高純氦(He),流速:1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件:離子源EI,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,電子能量70eV,傳輸線溫度280℃,采集模式全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z:33~300u,溶劑延遲:2.2min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

采用安捷倫GCMS Chemstation軟件中的譜庫(NIST11.L)對氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行化合物的定性分析,同時(shí)由NIST MS Search 2.0軟件系統(tǒng)完成手動(dòng)對照檢索,要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配),可能性(Prob.%)大于60。采用提取離子流方式計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積,利用面積歸一法計(jì)算揮發(fā)性化合物的相對含量。選取相對含量大于1%的代表性揮發(fā)性化合物作為區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的化合物種類(表1)。

表1單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的各種揮發(fā)性化合物

注:CAS編號是化學(xué)物質(zhì)登錄號。

單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖(圖1)可以直觀顯示出兩種細(xì)菌的化合物種類差別。其中,斯氏李斯特菌ATCC 35967的揮發(fā)性化合物(圖1-A)中未檢測到十二醇,而在單增李斯特菌ATCC 13932的揮發(fā)性化合物(圖1-B)檢測到十二醇(相對含量16.12%)。十二醇,又名月桂醇,具有頗弱但很持久的油脂氣息,在大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在[1],可以用來區(qū)別單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967。

實(shí)施例2

(1)單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19114與斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35867的培養(yǎng)物制備

采用接種環(huán),無菌操作轉(zhuǎn)接單增李斯特菌ATCC 19114到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,36℃,150r/min條件下,搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi),加蓋密封,作為單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

采用接種環(huán),無菌操作轉(zhuǎn)接斯氏李斯特菌ATCC 35867到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,36℃,150r/min條件下,搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi),加蓋密封,作為斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

營養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth)購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

(2)培養(yǎng)物的頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析

采用美國安捷倫公司Agilent 7890B-5977A系列氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(配有Agilent 7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器)對單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物、斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物進(jìn)行揮發(fā)性產(chǎn)物的化學(xué)分析。頂空進(jìn)樣、氣相色譜和質(zhì)譜條件如下:

頂空(HS)進(jìn)樣條件:加熱箱溫度55℃,定量環(huán)溫度:85℃,傳輸線溫度:100℃,樣品平衡時(shí)間:50min;色譜柱壓力:7.7psi;填充壓力:15psi;加壓時(shí)間:0.2min;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間:1.0min,拔針時(shí)間:0.5min。

氣相色譜(GC)條件:HP-INNOWax色譜柱(30m×250μm×0.25μm);分流進(jìn)樣,分流比為5:1,隔墊吹掃流量為3mL/min;升溫程序:初始溫度40℃保持5min,以3℃/min升至140℃;再以6℃/min升至250℃,保持5min,進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣:高純氦(He),流速:1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件:離子源EI,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,電子能量70eV,傳輸線溫度280℃,采集模式全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z:33~300u,溶劑延遲:2.2min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

采用安捷倫GCMS Chemstation軟件中的譜庫(NIST11.L)對氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行化合物的定性分析,同時(shí)由NIST MS Search 2.0軟件系統(tǒng)完成手動(dòng)對照檢索,要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配),可能性(Prob.%)大于60。采用提取離子流方式計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積,利用面積歸一法計(jì)算揮發(fā)性化合物的相對含量。選取相對含量大于1%的代表性揮發(fā)性化合物作為區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的化合物種類(表2)。

表2單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的各種揮發(fā)性化合物

注:CAS編號是化學(xué)物質(zhì)登錄號。

單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖(圖2)可以直觀顯示出兩種細(xì)菌的化合物種類差別。其中,單增李斯特菌ATCC 19114的揮發(fā)性化合物(圖2-A)檢測到十二醇(相對含量14.45%),而在斯氏李斯特菌ATCC 35867的揮發(fā)性化合物(圖2-B)中未檢測到十二醇。十二醇,又名月桂醇,具有頗弱但很持久的油脂氣息,在大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在,可以用來區(qū)別單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867。

當(dāng)然,上述說明并非是對本發(fā)明的限制,本發(fā)明也并不限于上述舉例,本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員,在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi),作出的變化、改型、添加或替換,都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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