本發(fā)明涉及一種色素的檢測方法，尤其涉及一種調(diào)味品中色素的檢測方法。

背景技術(shù)：

色素可以分為天然色素和合成色素。天然色素著色力和耐光性較差，因此合成色素更受人們的青睞。根據(jù)《食品添加劑使用標準(GB 2760-2014)》，我國僅允許使用檸檬黃、胭脂紅等11種合成色素。然而合成色素種類繁多，一些不法商家為了增強著色效果，在調(diào)味品中添加我國明令禁止使用的色素，如蘇丹紅、羅丹明B、堿性橙等，這些違禁色素經(jīng)人體代謝后可生成萘胺等致癌性物質(zhì)，長期攝入會對人體造成損害。

違禁色素的檢測方法主要包括高效液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。對于復雜基質(zhì)樣品，高效液相色譜法容易受到天然色素的干擾；而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法特異性強，靈敏度高，受到的干擾較少。在高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測違禁色素方面，目前檢測模式較為單一，通常只能采用正離子模式或者負離子模式進行檢測，而且樣品前處理過程復雜，需要耗費大量的時間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種前處理簡單、能同時檢測調(diào)味品中多達49種違禁色素、且檢測準確度高的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種調(diào)味品中色素的檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將樣品進行前處理，得到上樣液；

(2)采用UPLC-MS/MS方法對步驟(1)得到的上樣液進行測定，并和標準溶液的測定結(jié)果進行比對分析；

其中，高效液相色譜條件為：

a)色譜柱：C18柱，100mm×3.0mm，粒徑2.6μm；

b)流動相A為乙腈；流動相B為5～15mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.3～0.7mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；

質(zhì)譜檢測條件為：采用電噴霧離子源，正、負離子切換模式，電噴霧離子源溫度為400～550℃；多反應監(jiān)測模式；CAD碰撞氣；氣簾氣壓力為15～25psi；霧化氣壓力為50～60psi；輔助加熱氣壓力為50～60psi。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜條件為：a)色譜柱：菲羅門KinetexC18柱，100mm×3.0mm，粒徑2.6μm；b)流動相A為乙腈；流動相B為10mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.5mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；c)柱溫：40℃；d)進樣量：10μL；所述質(zhì)譜檢測條件為：采用電噴霧離子源，正、負離子切換模式，電噴霧離子源溫度為500℃；多反應監(jiān)測模式；氣簾氣壓力：20psi；霧化氣壓力：55psi；輔助加熱氣壓力：55psi；CAD碰撞氣：高強度。

本發(fā)明所述UPLC-MS/MS方法高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢，可以同時檢測調(diào)味品中多種違禁色素。

優(yōu)選地，所述前處理包括如下步驟：

(1)色素提取

按照每克調(diào)味品加入2.5mL提取劑的比例，將提取劑加至調(diào)味品中，混合均勻，離心，回收上清液；重復提取一次，合并提取液；

(2)QuEChERS方法凈化提取液

向步驟(1)得到的提取液中加入C₁₈吸附劑，再進行離心，取上清液用水稀釋后過0.22μm有機濾膜，得到上樣液。

更優(yōu)選地，所述前處理包括如下步驟：

(1)色素提取

稱取2g樣品到50mL離心管中，加入5mL提取劑，漩渦混合均勻；將離心管以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，回收上清液；重復提取一次，合并提取液；

(2)QuEChERS方法凈化提取液

取1mL步驟(1)得到的提取液于2mL離心管中，加入吸附劑，渦旋1min，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，取0.2～0.4mL上清液，用水稀釋至1mL，過0.22μm有機濾膜后，得到上樣液。

本發(fā)明所述QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法快速、簡便、成本低廉、易于操作。本發(fā)明方法采用改進的QuEChERS方法處理樣品，使調(diào)味品中的49種違禁色素同時提取、凈化，同時簡化了樣品處理步驟，具有高效、快速、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，凈化效果好，靈敏度高，準確度和精密度均符合多殘留分析方法的要求。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中的提取劑為乙腈和甲醇的混合物，所述提取劑中乙腈的體積百分比為20％～80％。

更優(yōu)選地，所述提取劑中乙腈的體積百分比為50％。本發(fā)明所述提取劑，能同時兼顧極性和非極性色素，很好的對色素進行分離提取，提取率高，有利于提高檢測的準確性。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中提取液用水稀釋時，提取液和水的體積比為1:2.5～1:5。本發(fā)明按照所述比例對樣品提取液進行稀釋，可有效改善目標色素峰型，減少溶劑效應，有利于提高檢測的準確性。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中的有機濾膜為聚四氟乙烯濾膜。聚四氟乙烯濾膜具有極強的化學兼容性，幾乎能勝任所有的有機溶劑和強腐蝕化學品的過濾，并且不會對色素產(chǎn)生吸附。在本發(fā)明中，將提取液通過聚四氟乙烯濾膜進行過濾，能對提取液起到很好的凈化效果。

優(yōu)選地，所述調(diào)味品中的色素包括酸性藍1、酸性橙II、堿性嫩黃O、堿性綠1、羅丹明B、結(jié)晶紫、蘇丹橙G、蘇丹黃、蘇丹紅7B、對位紅、溶劑黃13、蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、二乙基黃、酸性紅1、酸性紅73、專利藍V、橙黃IV、堿性橙21、硫黃素T、蘇丹紅G、分散橙37、分散橙1、分散紅1、分散橙3、分散橙11、堿性紅14、堿性藍1、堿性紫2、堿性紫7、堿性橙22、酸性紅52、酸性橙20、藏花橙G、酸性藍3、酸性綠16、酸性綠A、溶劑黃1、溶劑黃3、溶劑橙2、甲基橙、萘基紅、4-羥基偶氮苯、4-羥基-4-二甲氨基偶氮苯、羅丹明6G、分散黃3、柑橘紅2。

優(yōu)選地，以體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～2.5min，10％～40％A；2.5～4.7min，40.0％A；4.7～7.0min，40％～90％A；7.0～12.0min，90％A；12.0～12.1min，10％A；12.1～17.0min，10％A；各洗脫時間段中均以流動相B補足余下的體積百分比。

本發(fā)明技術(shù)方案中流動相A為乙腈，流動相B為10mmol/L乙酸銨溶液，洗脫方式為梯度洗脫，流速為0.5mL/min；初始流動相比例為10:90(A:B體積比)，到2.5min時流動相比例變?yōu)?0:60，到7min時流動相比例變?yōu)?0:10，12.1min時流動相比例又變?yōu)?0:90，這個比例一直維持到17min，因此，本發(fā)明色譜柱和流動相的選擇對調(diào)味品中違禁色素達到了優(yōu)異的分離效果，進一步保證了本發(fā)明檢測方法的準確性。

優(yōu)選地，所述電噴霧離子源在0～4.1min為負離子模式，噴霧電壓為-4500V；在4.1～16.0min為正離子模式，噴霧電壓為5500V。

本發(fā)明采用正負離子兩種不同的模式進行切換檢測方法，同時對色素的陰、陽離子進行檢測，解決了現(xiàn)在違禁色素檢測模式單一、檢測種類有限的技術(shù)難題，通用性強、檢測對象覆蓋范圍寬，降低了漏檢風險，縮短了檢測周期。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法對調(diào)味品中多達49種違禁色素進行檢測，采用正負離子切換模式，同時對色素的陰、陽離子進行檢測，解決了現(xiàn)在違禁色素檢測模式單一、檢測種類有限的技術(shù)難題，通用性強、檢測對象覆蓋范圍寬，具有高速、高效、高分辨、微量檢測及分析自動化的性能和技術(shù)優(yōu)勢，降低了漏檢風險；加上QuEChERS凈化方法去除樣品中的油脂，有效地改善了色素檢測中復雜的前處理過程，簡便快速，與以往多個方法的檢測方法相比，分析時間短，靈敏度高，檢測效率得到了根本性的提升，大大縮短了檢測周期。

附圖說明

圖1為49種違禁色素標準品的總離子流圖，其中0～4.1min為13種陰離子色素，4.1～17min為36種陽離子色素；

圖2為13種陰離子色素負離子模式的提取離子流圖，其中，各色素保留時間分別為：酸性紅1:2.21min；酸性橙20:2.90min；酸性紅73:3.13min；酸性綠16:3.25min；酸性藍1:3.30min；甲基橙：3.32min；酸性綠A：3.37min；酸性紅52:3.45min；藏花橙G:3.45min；酸性橙II:3.46min；專利藍V:3.55min；酸性藍3:3.55min；橙黃IV：3.90min；

圖3為36種陽離子色素正離子模式的提取離子流圖，其中，各色素保留時間分別為：堿性嫩黃O:4.88min；硫黃素T:4.89min；堿性紫2:5.00min；堿性紅14:5.66min；堿性橙21:6.29min；羅丹明B:6.49min；蘇丹橙G:6.51min；對羥基偶氮苯：6.73min；溶劑黃1:6.75min；溶劑黃13:6.82min；4-羥基-4-二甲氨基偶氮苯：6.82min；分散橙3：6.93min；分散黃3:6.97min；分散橙11:7.03min；堿性藍1:7.07min；分散紅1:7.22min；溶劑黃3:7.48min堿性紫7:7.52min；萘基紅：7.53min；堿性橙22:7.56min；羅丹明6G:7.75min；對位紅:7.84min；分散橙37:7.84min；蘇丹黃:7.87min；柑橘紅2:7.97min；分散橙1:7.99min；蘇丹紅G:8.05min；結(jié)晶紫:8.09min；蘇丹紅I:8.10min；二乙基黃:8.23min；溶劑橙2:8.38min；蘇丹紅II:8.77min；堿性綠1:9.06min；蘇丹紅III:9.31min；蘇丹紅7B:10.39min；蘇丹紅IV:10.64min；

圖4為辣椒粉樣品檢出羅丹明B的總離子流圖；

圖5為辣椒粉樣品檢出羅丹明B的m/z的值為399.0的子離子提取流圖；

圖6為辣椒粉樣品檢出羅丹明B的m/z的值為355.0的子離子提取流圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

本發(fā)明所述調(diào)味品中色素的檢測方法的一種實施例，本實施例調(diào)味品為一種調(diào)味醬，本實施例所述方法包括如下步驟：

(1)色素提取

稱取2g樣品到50mL離心管中，加入5mL提取劑，漩渦混合均勻；提取劑由乙腈和甲醇以50:50的體積比混合；將離心管以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，回收上清液；重復提取一次，合并提取液。

(2)QuEChERS方法凈化提取液

取1mL提取液于2mL離心管中，加入25mg C₁₈吸附劑，渦旋1min，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。取0.3mL上清液，用水稀釋至1mL，過0.22μm聚四氟乙烯濾膜后，待測定。

(3)UPLC-MS/MS分析

色譜柱：菲羅門Kinetex-C18(100mm×3.0mm，2.6μm)；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流動相A為乙腈；流動相B為10mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.5mL/min；以體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～2.5min，10％～40％A；2.5～4.7min，40.0％A；4.7～7.0min，40％～90％A；7.0～12.0min，90％A；12.0～12.1min，10％A；12.1～17.0min，10％A；各洗脫時間段中均以流動相B補足余下的體積百分比；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，0～4.1min為負離子模式(ESI-)，噴霧電壓-4500V；4.1～16.0min為正離子模式(ESI+)，噴霧電壓5500V；多反應監(jiān)測模式(MRM)；氣簾氣壓力：20psi；霧化氣(GS1)壓力：55psi；輔助加熱氣(GS2)壓力：55psi；CAD碰撞氣：高強度；電噴霧離子源溫度為500℃，具體見違禁色素的質(zhì)譜參數(shù)表1所示。

表1 色素質(zhì)譜檢測參數(shù)

*定量離子對

按照上述條件，對49種違禁色素標準品和調(diào)味醬提取液進行UPLC-MS/MS分析和比對，對調(diào)味醬提取液中49種違禁色素進行定性定量分析。

(4)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

在UPLC-MS/MS分析時，按照常規(guī)方法繪制49種違禁色素的標準曲線，根據(jù)其標準曲線可以確定49種違禁色素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，其分析結(jié)果列于表2。

表2 49種違禁色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

(5)回收率及精密度

在調(diào)味品空白樣品(調(diào)味醬)中，分別進行3組不同濃度水平的加標回收試驗，每個水平作6次平行試驗。其回收率及相對標準偏差見表3：

表3 49種違禁色素的回收率及相對標準偏差

由表3可知，各目標物回收率為70.98％～109.72％，相對標準偏差為0％～9.14％，所述方法顯示了較好的回收率和精密度。

實施例2

本發(fā)明所述調(diào)味品中色素的檢測方法的一種實施例，本實施例調(diào)味品為一種調(diào)味醬，本實施例所述方法包括如下步驟：

(1)色素提取

稱取2g樣品到50mL離心管中，加入5mL提取劑，漩渦混合均勻；提取劑由乙腈和甲醇以50:50的體積比混合；將離心管以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，回收上清液；重復提取一次，合并提取液。

(2)QuEChERS方法凈化提取液

取1mL提取液于2mL離心管中，加入25mg C₁₈吸附劑，渦旋1min，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。取0.3mL上清液，用水稀釋至1mL，過0.22μm聚四氟乙烯濾膜后，待測定。

(3)UPLC-MS/MS分析

色譜柱：菲羅門Kinetex-C18(100mm×3.0mm，2.6μm)；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流動相A為乙腈；流動相B為10mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.5mL/min；以體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～2.5min，10％～40％A；2.5～4.7min，40.0％A；4.7～7.0min，40％～90％A；7.0～12.0min，90％A；12.0～12.1min，10％A；12.1～17.0min，10％A；各洗脫時間段中均以流動相B補足余下的體積百分比；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，0～4.1min為負離子模式(ESI-)，噴霧電壓-4500V；4.1～16.0min為正離子模式(ESI+)，噴霧電壓5500V；多反應監(jiān)測模式(MRM)；氣簾氣壓力：20psi；霧化氣(GS1)壓力：55psi；輔助加熱氣(GS2)壓力：55psi；CAD碰撞氣：高強度；電噴霧離子源溫度為500℃，具體見違禁色素的質(zhì)譜參數(shù)表1所示。

按照上述條件，對49種違禁色素標準品和調(diào)味醬提取液進行UPLC-MS/MS分析和比對，對調(diào)味醬提取液中49種違禁色素進行定性定量分析。

(4)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

在UPLC-MS/MS分析時，按照常規(guī)方法繪制49種違禁色素的標準曲線，根據(jù)其標準曲線可以確定49種違禁色素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。其分析結(jié)果列于表4。

表4 49種違禁色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

(5)回收率及精密度

在調(diào)味品空白樣品(辣椒粉)中，分別進行3組不同濃度水平的加標回收試驗，每個水平作6次平行試驗，其回收率及相對標準偏差見表5。

表5 49種違禁色素的回收率及相對標準偏差

由表5可知，各目標物回收率為70.75％～114.68％，相對標準偏差為0.06％～9.38％，所述方法顯示了較好的回收率和精密度。

實施例3

本發(fā)明所述調(diào)味品中色素的檢測方法的一種實施例，本實施例調(diào)味品為一種調(diào)味醬，本實施例所述方法包括如下步驟：

(1)色素提取

稱取2g樣品到50mL離心管中，加入5mL提取劑，漩渦混合均勻；提取劑為乙腈和甲醇的混合物，其中乙腈的體積百分含量為20％；將離心管以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，回收上清液；重復提取一次，合并提取液。

(2)QuEChERS方法凈化提取液

取1mL提取液于2mL離心管中，加入25mg C₁₈吸附劑，渦旋1min，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。取0.2mL上清液，用水稀釋至0.7mL，過0.22μm聚四氟乙烯濾膜后，待測定。

(3)UPLC-MS/MS分析

色譜柱：菲羅門Kinetex-C18(100mm×3.0mm，2.6μm)；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流動相A為乙腈；流動相B為5mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.3mL/min；以體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～2.5min，10％～40％A；2.5～4.7min，40.0％A；4.7～7.0min，40％～90％A；7.0～12.0min，90％A；12.0～12.1min，10％A；12.1～17.0min，10％A；各洗脫時間段中均以流動相B補足余下的體積百分比；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，0～4.1min為負離子模式(ESI-)，噴霧電壓-4500V；4.1～16.0min為正離子模式(ESI+)，噴霧電壓5500V；多反應監(jiān)測模式(MRM)；氣簾氣壓力：15psi；霧化氣(GS1)壓力：50psi；輔助加熱氣(GS2)壓力：50psi；CAD碰撞氣：高強度；電噴霧離子源溫度為400℃，具體見違禁色素的質(zhì)譜參數(shù)表1所示。

按照上述條件，對49種違禁色素標準品和調(diào)味醬提取液進行UPLC-MS/MS分析和比對，對調(diào)味醬提取液中49種違禁色素進行定性定量分析。

(4)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

根據(jù)實施例1和實施例2中同樣的方法繪制49種違禁色素的標準曲線，根據(jù)其標準曲線可以確定49種違禁色素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)目標物的回收率在71.99％～109.22％范圍內(nèi)，相對標準偏差為0.07％～9.2％，所述方法顯示了較好的回收率和精密度。

實施例4

本發(fā)明所述調(diào)味品中色素的檢測方法的一種實施例，本實施例調(diào)味品為一種調(diào)味醬，本實施例所述方法包括如下步驟：

(1)色素提取

稱取2g樣品到50mL離心管中，加入5mL提取劑，漩渦混合均勻；提取劑為乙腈和甲醇的混合物，其中乙腈的體積百分含量為80％；將離心管以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，回收上清液；重復提取一次，合并提取液。

(2)QuEChERS方法凈化提取液

取1mL提取液于2mL離心管中，加入25mg C₁₈吸附劑，渦旋1min，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。取0.4mL上清液，用水稀釋至1mL，過0.22μm聚四氟乙烯濾膜后，待測定。

(3)UPLC-MS/MS分析

色譜柱：菲羅門Kinetex-C18(100mm×3.0mm，2.6μm)；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流動相A為乙腈；流動相B為15mmol/L乙酸銨溶液；流速為0.7mL/min；以體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～2.5min，10％～40％A；2.5～4.7min，40.0％A；4.7～7.0min，40％～90％A；7.0～12.0min，90％A；12.0～12.1min，10％A；12.1～17.0min，10％A；各洗脫時間段中均以流動相B補足余下的體積百分比；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，0～4.1min為負離子模式(ESI-)，噴霧電壓-4500V；4.1～16.0min為正離子模式(ESI+)，噴霧電壓5500V；多反應監(jiān)測模式(MRM)；氣簾氣壓力：25psi；霧化氣(GS1)壓力：60psi；輔助加熱氣(GS2)壓力：60psi；CAD碰撞氣：高強度；電噴霧離子源溫度為550℃，具體見違禁色素的質(zhì)譜參數(shù)表1所示。

按照上述條件，對49種違禁色素標準品和調(diào)味醬提取液進行UPLC-MS/MS分析和比對，對調(diào)味醬提取液中49種違禁色素進行定性定量分析。

(4)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

根據(jù)實施例1和實施例2中同樣的方法繪制49種違禁色素的標準曲線，根據(jù)其標準曲線可以確定49種違禁色素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)目標物的回收率在68.33％～114.22％范圍內(nèi)，相對標準偏差為0.07％～9.4％，所述方法顯示了較好的回收率和精密度。

實施例5

本實施例針對本發(fā)明提取方法中的提取劑的回收率進行了相關(guān)研究，采用對中間加標量進行加標回收試驗，對3種不同比例的提取溶劑進行加標回收試驗，得到3組不同的回收率并進行比較，加標濃度為表5中每種色素加標濃度的中間濃度，具體見表5中間的加標濃度點，得到回收率，研究結(jié)果如表6所示：

表6為不同體積比的乙腈與甲醇混合提取劑的加標回收率比較

從表6可以看出，本發(fā)明所述體積比的乙腈與甲醇混合提取劑，對樣品中色素的提取效果較好，尤其是當提取劑中乙腈與甲醇的體積比為1:1時，對所有待測樣品中色素的加標回收率相對較高(70.58％-109.16％)。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。